CN109580515A - 一种用于血清或血浆中胰脂肪酶测定的试剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种用于血清或血浆中胰脂肪酶测定的试剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生化检测技术领域，具体涉及一种用于血清或血浆中胰脂肪酶测定的试剂及其制备方法与应用。本发明提供一种胰脂肪酶测定试剂，包括十二烷基硫酸钠、鱼精蛋白硫酸盐和鞘磷脂。本发明通过在胰脂肪酶测定试剂中添加鱼精蛋白硫酸盐、十二烷基硫酸钠和鞘磷脂，显著降低了血清中肝脂肪酶、脂蛋白脂肪酶、胆固醇酯酶对于胰脂肪酶测定的干扰作用，有效抑制胰脂肪酶测定反应过程中，血清或血浆中非特异性脂解反应的发生，同时能够保证胰脂肪酶催化活性的有效发挥，提高了胰脂肪酶测定的特异性和准确性，有效降低了胰脂肪酶检测的假阳性率。

Description

一种用于血清或血浆中胰脂肪酶测定的试剂及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及生化检测技术领域，具体涉及一种用于血清或血浆中胰脂肪酶测定的试剂及其制备方法与应用。
背景技术
脂肪酶(lipase，Lip)又称三酰甘油水解酶，是能够水解长链脂肪酸三酰甘油的一类酶的总称。根据合成部位不同，血清中的脂肪酶包括：脂蛋白脂肪酶(LPL)、肝脂肪酶(HL)和胰脂肪酶(PL)。它们都属于脂肪酶家族成员，具有同源性。LPL主要在脂肪细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、乳腺细胞以及巨噬细胞中合成，然后表达于毛细血管内皮内膜。LPL主要作用于血浆中富含TG的脂蛋白，但LPL需与载脂蛋白结合后才能发挥其活性。HL由肝实质细胞合成，是参与脂蛋白代谢的关键酶。PL由胰腺分泌，随胆汁进入小肠后分解食入的脂肪。当胰腺发生炎症时，释放入血液中的PL显著增多，致使血液中PL活性显著升高。急性胰腺炎时，在发病4-8小时内，胰脂肪酶的活性就会增高，24小时左右达到峰值。随着疾病的好转于8-14天后降至正常水平。
现有技术中已有多种测定胰脂肪酶活性的方法，如滴定法、浊度法和酶比色法等。目前，胰脂肪酶活性测定的主要方法是甲基试卤灵底物法，该方法的主要反应过程如下：
即胰脂肪酶在共脂肪酶和胆酸盐的存在下水解微乳中的发色底物1,2-o-二月桂基-外消旋-甘油-3-戊二酸-(6-甲基试卤灵)酯(DGGR)，当6-甲基试卤灵酯降解为6-甲基试卤灵时，此红色染料在570nm处引起的吸光度变化率与样品中胰脂肪酶的活力成正比。
由于脂蛋白脂肪酶(LPL)、肝脂肪酶(HL)与胰脂肪酶同样具有脂肪酶的功能，因此，脂蛋白脂肪酶(LPL)和肝脂肪酶(HL)也可以水解发色底物，使得胰脂肪酶得测定值升高，干扰胰脂肪酶得测定，导致检测假阳性或临床误诊等情况的发生。因此，开发能够较大程度地避免脂蛋白脂肪酶(LPL)、肝脂肪酶(HL)等脂肪酶的干扰的胰脂肪酶的测定方法具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于一种用于血清或血浆中胰脂肪酶测定的试剂及其制备方法与应用。
在血清或血浆的胰脂肪酶测定过程中，血清或血浆中的肝脂肪酶、脂蛋白脂肪酶的存在会干扰胰脂肪酶的测定，而且发明人在研究过程中还发现胆固醇酯酶也会影响胰脂肪酶的测定。因此，需要加入抗干扰物质抑制肝脂肪酶、脂蛋白脂肪酶和胆固醇酯酶的非特异性反应，然而，由于胰脂肪酶与肝脂肪酶、脂蛋白脂肪酶和胆固醇酯酶的结构、性质和功能的相似性很高，因此，为提高胰脂肪酶检测的特异性，加入抗肝脂肪酶、脂蛋白脂肪酶和胆固醇酯酶干扰的物质，通常也会引起胰脂肪酶的催化性能下降，进而影响胰脂肪酶的检测。十二烷基硫酸钠是常用的乳化剂和去污剂、鱼精蛋白硫酸盐为一种强碱性蛋白，可以结合多种蛋白质或者多肽，鞘磷脂是哺乳动物血浆中含量丰富的磷脂，发明人创造性地发现，在胰脂肪酶的测定过程中加入十二烷基硫酸钠同时复配鱼精蛋白硫酸盐和鞘磷脂，能够显著减少肝脂肪酶、脂蛋白脂肪酶和胆固醇酯酶的干扰，同时保证胰脂肪酶正常发挥其催化活性，从而显著提升胰脂肪酶测定的特异性和准确性。
首先，本发明提供一种用于血清或血浆中的胰脂肪酶测定的试剂，所述试剂包括十二烷基硫酸钠、鱼精蛋白硫酸盐和鞘磷脂。
同时，为保证上述物质的添加能够更好地发挥抗干扰作用且不影响胰脂肪酶的催化功能的发挥，所述十二烷基硫酸钠和鞘磷脂的质量比为10：1～30：1。
作为优选，本发明所述的胰脂肪酶测定试剂中，十二烷基硫酸钠的质量体积百分含量为0.05％～0.5％；鞘磷脂的质量体积百分含量为0.005％～0.1％；鱼精蛋白硫酸盐的质量体积百分含量为0.001％～0.05％；其中，所述十二烷基硫酸钠和鞘磷脂的质量比为10：1～20：1；以上述含量添加十二烷基硫酸钠、鱼精蛋白硫酸盐和鞘磷脂能够更好地防止非特异性脂解反应，同时保证胰脂肪酶发挥催化活性。
更优选地，所述的胰脂肪酶测定试剂中，十二烷基硫酸钠的质量体积百分含量为0.1％～0.5％；鞘磷脂的质量体积百分含量为0.01％～0.1％；鱼精蛋白硫酸盐的质量体积百分含量为0.001％～0.01％。
本发明中，所述胰脂肪酶测定试剂还包括胰脂肪酶的作用底物，为保证底物的稳定性，本发明中，所述胰脂肪酶试剂包括试剂1和试剂2，以将底物和其它影响底物稳定性的物质分开保存。此外，为更好地促进胰脂肪酶发挥催化作用，同时降低其它非特异性酯解反应的干扰，所述测定试剂中还添加有胆酸盐和共脂肪酶。
优选地，所述试剂1包括缓冲液、共脂肪酶、胆酸盐、十二烷基硫酸钠、鞘磷脂和鱼精蛋白硫酸盐；
所述试剂2包括缓冲液和底物；
尤其对于采用人工合成物质1,2-o-二月桂基-外消旋-甘油-3-戊二酸-(6-甲基试卤灵)酯作为底物时，鱼精蛋白硫酸盐与十二烷基硫酸钠和鞘磷脂三种物质复配使用对于降低其它脂肪酶的干扰作用、提高胰脂肪酶检测的特异性的效果最佳。
为促进底物形成均一稳定的乳化液，所述试剂2还包括表面活性剂。
本发明中，所述胆酸盐选自脱氧胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种。
优选地，所述胆酸盐为脱氧胆酸盐和/或牛磺脱氧胆酸盐。
适宜的pH能够为胰脂肪酶的催化作用提供合适的条件，本发明中，所述试剂1的pH为7.5～8.5；所述试剂2的的pH为3.5～4.5。
本发明中，所述缓冲液的主要作用在于为胰脂肪酶催化提供适宜的pH条件；本发明所述缓冲液选自Tris缓冲液、GOOD’S缓冲液(如MOPS缓冲液、HEPS缓冲液、TAPS缓冲液、MES缓冲液等)、酒石酸缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种或多种。
表面活性剂的添加能够使得底物1,2-o-二月桂基-外消旋-甘油-3-戊二酸-(6-甲基试卤灵)酯更好地乳化，形成均一稳定的乳化液，优选地，所述表面活性剂选自Brij 35、Thesit、Tween 20、Triton X-100、Triton X-405中的一种或多种。
本发明通过优化测定试剂各组分的含量，所述的胰脂肪酶测定试剂能够实现更好的测定效果，具体地，所述的胰脂肪酶测定试剂包括如下组分：
试剂1：
试剂2：
作为本发明的优选实施方式，所述胰脂肪酶测定试剂包括如下组分：
试剂1：
试剂2：
所述十二烷基硫酸钠和鞘磷脂的质量比为10：1～15：1；
所述鞘磷脂与所述鱼精蛋白硫酸盐的质量比为10：1～15：1。
此外，本发明还提供所述胰脂肪酶测定试剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)试剂1的制备：将缓冲液、共脂肪酶、氯化钙、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、鱼精蛋白硫酸盐、鞘磷脂和十二烷基硫酸钠加入水中，搅拌至完全溶解，调节pH至7.50～8.50；
(2)试剂2的制备：将缓冲液和牛磺脱氧胆酸钠加入水中，搅拌至完全溶解，调节pH至3.50～4.50，得到基础液；将底物、表面活性剂混合均匀，得到底物溶液；将底物溶液滴入基础液，得到试剂2。
在上述技术方案的基础上，本发明进一步提供所述胰脂肪酶测定试剂在脂肪酶测定中的应用，具体为，将待测样品与试剂1以1：150～1：50的体积比混合，37℃孵育1～5min，加入与试剂1的体积比为1：5～1：2的试剂2，37℃孵育1～5min后检测反应液的吸光度；所述检测的主波长为570nm，副波长为800nm。
所述应用优选为用于测定血清或血浆中的胰脂肪酶。
本发明的有益效果在于：本发明通过在胰脂肪酶测定试剂中添加鱼精蛋白硫酸盐、十二烷基硫酸钠和鞘磷脂，显著降低了血清中肝脂肪酶、脂蛋白脂肪酶和胆固醇酯酶对于胰脂肪酶测定的干扰作用，有效抑制胰脂肪酶测定反应过程中，血清或血浆中非特异性脂解反应的发生，同时能够保证胰脂肪酶催化活性的有效发挥，提高了胰脂肪酶测定的特异性和准确性，有效降低了胰脂肪酶检测的假阳性率。
附图说明
图1为本发明实验例1中胰脂肪酶测定试剂测定纯水的反应过程曲线图。
图2为本发明实验例1中胰脂肪酶测定试剂测定含150U/L肝脂肪酶的纯水的反应过程曲线图。
图3为本发明实验例1中胰脂肪酶测定试剂测定含150U/L脂蛋白脂肪酶的纯水的反应过程曲线图。
图4为本发明实验例1中胰脂肪酶测定试剂测定含150U/L胆固醇酯酶的纯水的反应过程曲线图。
图5为本发明实验例1中胰脂肪酶测定试剂测定含150U/L胰脂肪酶的纯水的反应过程曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，鱼精蛋白硫酸盐购自SIGMA公司，货号为P4020；鞘磷脂购自SIGMA公司，货号为S0756。
实施例1
本实施例提供一种胰脂肪酶的测定试剂，其由试剂1和试剂2组成，具体配方如下：
试剂1：
试剂2：
本实施例还提供上述胰脂肪酶的测定试剂的制备方法，具体如下：
试剂1的制备：向容器内加入800mL去离子水，磁力搅拌下，加入Tris 6.057g，用6NHCl调pH至8.40，再依次加入二水氯化钙0.15g、牛磺脱氧胆酸钠2g、脱氧胆酸钠2g和共脂肪酶1.5mg，至各组分完全溶解，补加去离子水至1L，即得试剂1，其pH为8.40±0.10。
试剂2的制备：向容器内加入800mL去离子水，磁力搅拌下，依次加入相应量的酒石酸钠1.26g、酒石酸0.525g、牛磺脱氧胆酸钠3.76g，至各组分完全溶解，得到试剂2的基础液，pH为4.00±0.10。
向容器中加入发色底物DGGR 0.4g、Thesit 4g，搅拌至充分溶解，得到底物溶液。
在搅拌下，将上述底物溶液滴入基础液，加去离子水补足至1L，搅拌均匀即得试剂2。
实施例2
本实施例提供一种胰脂肪酶的测定试剂，其由试剂1和试剂2组成，具体配方如下：
试剂1：
试剂2：
本实施例还提供上述胰脂肪酶的测定试剂的制备方法，具体如下：
试剂1的制备：向容器内加入800mL去离子水，磁力搅拌下，加入Tris 6.057g，用6NHCl调pH至8.40，再依次加入二水氯化钙0.15g、十二烷基硫酸钠1g、牛磺脱氧胆酸钠2g、脱氧胆酸钠2g、鞘磷脂0.1g、硫酸鱼精蛋白0.01g和共脂肪酶1.5mg，至各组分完全溶解，补加去离子水至1L，即得试剂1，其pH为8.40±0.10。
试剂2的制备：向容器内加入800mL去离子水，磁力搅拌下，依次加入相应量的酒石酸钠1.26g、酒石酸0.525g、牛磺脱氧胆酸钠3.76g，至各组分完全溶解，得到试剂2的基础液，pH为4.00±0.10。
向容器中加入发色底物DGGR 0.4g、Thesit 4g，搅拌至充分溶解，得到底物溶液。
在搅拌下，将上述底物溶液滴入基础液，加去离子水补足至1L，搅拌均匀即得试剂2。
实验例1胰脂肪酶测定试剂的检测特异性分析
分别采用上述实施例1和实施例2提供的胰脂肪酶测定试剂进行胰脂肪酶、肝脂肪酶、脂蛋白脂肪酶和胆固醇酯酶含量的测定，以纯水作为对照，分析胰脂肪酶测定试剂的检测特异性，具体测定方法如下：
以纯水为溶剂分别配制150U/L胰脂肪酶溶液、150U/L肝脂肪酶溶液、150U/L脂蛋白脂肪酶标准品溶液和150U/L胆固醇酯酶溶液。分别以上溶液作为待测样品。
分别取上述待测样品4μL分别加入250μL实施例1和实施例2的胰脂肪酶测定试剂的试剂1，37℃孵育5min；分别对应加入50μL实施例1和实施例2的胰脂肪酶测定试剂的试剂2，37℃孵育5min，检测10min内的反应液的吸光度变化，检测的主波长为570nm，副波长为800nm。
上述各待测样品分别采用实施例1和实施例2的测定试剂检测的反应过程吸光度变化曲线如图1～5所示(加入测定试剂反应10min内)，其中，对照组纯水的检测反应过程吸光度变化曲线如图1所示，肝脂肪酶的检测反应过程吸光度变化如图2所示，脂蛋白脂肪酶的检测反应过程吸光度变化如图3所示，胆固醇酯酶的检测反应过程吸光度变化如图4所示，胰脂肪酶的检测反应过程吸光度变化如图5所示。结果表明，与实施例1的测定试剂相比，实施例2的胰脂肪酶测定试剂与干扰物质脂蛋白脂肪酶、肝脂肪酶和胆固醇酯酶几乎无法发生反应，其检测的特异性更高。
实验例2胰脂肪酶测定试剂的检测抗干扰性能分析
为分析本发明实施例2的胰脂肪酶测定试剂在进行胰脂肪酶检测时的抗干扰能力，模拟肝脂肪酶、脂蛋白脂肪酶和胆固醇酯酶的干扰环境制备待测样品，采用本发明实施例2的胰脂肪酶测定试剂进行检测，并以市售常用的胰脂肪酶测定试剂(北京九强生物技术股份有限公司的胰脂肪酶测定试剂盒)作为对照。
将脂肪酶浓缩液(浓度为600U/L)以及含有干扰物(分别含有脂蛋白脂肪酶、肝脂肪酶、胆固醇酯酶)的胰脂肪酶浓缩液(胰脂肪酶浓度为600U/L，干扰物浓度为300U/L)分别用去离子水按表1所示的稀释比例稀释，配制含干扰物的不同浓度的胰脂肪酶待测样品，将所有待测样品分别用市售胰脂肪酶测定试剂和实施例2提供的胰脂肪酶测定试剂测定，以用去离子水稀释的脂肪酶浓缩液作为对照，以罗氏cfas校准品定标后测定上述各种待测样品中的胰脂肪酶含量。
检测结果如表1所示，在分别存在肝脂肪酶、脂蛋白脂肪酶和胆固醇酯酶的干扰情况下，采用实施例2的胰脂肪酶测定试剂的检测的样本中的胰脂肪酶的含量与不存在干扰的对照组的检测结果基本一致，而采用市售胰脂肪酶测定试剂的检测值则明显高于不存在干扰的对照组，证明市售胰脂肪酶测定试剂的检测值为胰脂肪酶和干扰物的共同检测的结果，而本发明实施例2的测定试剂可以特异性地与胰脂肪酶反应，特异性地检测胰脂肪酶。结果表明，实施例2的胰脂肪酶测定试剂可有效消除肝脂肪酶、脂蛋白脂肪酶和胆固醇酯酶对胰脂肪酶测定的干扰，具有较高的检测特异性和准确性。
表1胰脂肪酶测定试剂的抗干扰性能分析
表1中的检测数据为三次平行实验的平均值
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种用于血清或血浆中胰脂肪酶测定的试剂，其特征在于，所述试剂包括十二烷基硫酸钠、鱼精蛋白硫酸盐和鞘磷脂。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述十二烷基硫酸钠和鞘磷脂的质量比为10：1～30：1。
3.根据权利要求1或2所述的试剂，其特征在于，所述试剂中，所述十二烷基硫酸钠的质量体积百分含量为0.05％～0.5％；所述鞘磷脂的质量体积百分含量为0.005％～0.1％；所述鱼精蛋白硫酸盐的质量体积百分含量为0.001％～0.05％；
所述十二烷基硫酸钠和鞘磷脂的质量比为10：1～20：1。
4.根据权利要求1～3任一项所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括试剂1和试剂2；
所述试剂1包括缓冲液、共脂肪酶、胆酸盐、十二烷基硫酸钠、鞘磷脂和鱼精蛋白硫酸盐；
所述试剂2包括缓冲液和底物；
优选地，所述底物为1,2-o-二月桂基-外消旋-甘油-3-戊二酸-(6-甲基试卤灵)酯；所述试剂2还包括表面活性剂。
5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述胆酸盐选自脱氧胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、鹅脱氧胆酸盐中的一种或多种；
优选地，所述胆酸盐为脱氧胆酸盐和/或牛磺脱氧胆酸盐。
6.根据权利要求4或5所述的试剂，其特征在于，所述试剂1的pH为7.5～8.5；
和/或，
所述试剂2的pH为3.5～4.5。
7.根据权利要求4～6任一项所述的试剂，其特征在于，所述缓冲液选自Tris缓冲液、GOOD’S缓冲、酒石酸缓冲液、柠檬酸缓冲液中的一种或多种；
和/或，
所述表面活性剂选自Brij 35、Thesit、Tween 20、Triton X-100、Triton X-405中的一种或多种。
8.根据权利要求1～7任一项所述的试剂，其特征在于，其包括如下组分：
试剂1：
试剂2：
优选地，所述试剂包括如下组分：
试剂1：
试剂2：
所述十二烷基硫酸钠和鞘磷脂的质量比为10：1～15：1；
所述鞘磷脂与所述鱼精蛋白硫酸盐的质量比为10：1～15：1。
9.权利要求1～8任一项所述试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)试剂1的制备：将缓冲液、共脂肪酶、氯化钙、脱氧胆酸钠、牛磺脱氧胆酸钠、鱼精蛋白硫酸盐、鞘磷脂和十二烷基硫酸钠加入水中，搅拌至完全溶解，调节pH至7.50～8.50；
(2)试剂2的制备：将缓冲液和牛磺脱氧胆酸钠加入水中，搅拌至完全溶解，调节pH至3.50～4.50，得到基础液；将底物和表面活性剂混合均匀，得到底物溶液；将所述底物溶液滴入所述基础液，得到试剂2。
10.权利要求1～8任一项所述试剂在胰脂肪酶测定中的应用，其特征在于，将待测样品与试剂1以1：150～1：50的体积比混合，37℃孵育1～5min，加入与试剂1的体积比为1：5～1：2的试剂2，37℃孵育1～5min后检测反应液的吸光度；所述检测的主波长为570nm，副波长为800nm。
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