CN110923292B - 一种血清脂肪酶检测试剂盒及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血清脂肪酶检测试剂盒及其制备方法与应用，所述试剂盒中含有试剂R1和试剂R2，所述试剂R2中含有以下组分：pH为5.5的酒石酸缓冲液、1，2‑二月桂宗甘油‑3‑戊二酸‑(6’‑甲基试卤灵)‑酯、甘露醇、曲拉通‑100、DMSO、正丙醇、卵磷脂和BSA。该试剂盒线性范围宽(10～700U/L)、成本低、稳定性好且具有较高的灵敏度，具有良好的市场推广应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种血清脂肪酶检测试剂盒及其制备方法与应用。
背景技术
脂肪酶隶属于羧基酯水解酶类，能够逐步地将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酶存在于含有脂肪的动、植物和微生物(如霉菌、细菌等)组织中。脂肪酶(Lipase，LPS)是一组特异性较低的脂肪水解酶类，主要来源于胰腺，其次为胃及小肠，能水解多种含长链(8～18碳链)脂肪酸的甘油酯。LPS需与另一种特异性很低的酯酶(esterase)相区别。酯酶作用于能溶于水的含短链脂肪酸的酯类；而脂肪酶仅作用于酯和水界面的脂肪，只有当底物呈乳剂状态时，LPS才发挥作用。
正常血清中仅含有少量的LPS，因此，血清脂肪酶的检测结果可以作为诊断各种胰腺疾病的重要临床指标，尤其作为急性胰腺炎。传统的血清脂肪酶测定方法有比浊法、紫外法、比色法等，其中，比浊法的缺点是底物的乳化批次间差异性大，导致测定结果准确度不高，且底物的稳定性差，不易保存；紫外法和比色法需要使用多种工具酶，使得检测成本高昂，实用性不佳。这些缺陷导致LPS检测难以被临床推广应用。
脂肪酶的最大催化活性及特异性，必须要有胆汁酸盐、脂肪酶及共脂肪酶(colipase)的共同参加。因此，在乳化的三油酸甘油酯底物中应含有胆汁酸盐、共脂肪酶和Ca2+，其中，胆汁酸盐的作用是清除底物-水界面的蛋白质，包括有干扰作用的酶；共脂肪酶与胆汁酸结合后生成胆汁酸盐-共脂肪酶符合物，便于脂肪酶与共脂肪酶结合，在胆汁酸盐-共脂肪酶-脂肪酶结合物中，脂肪酶方可催化底物反应；Ca2+在胆汁酸盐的存在下，促进酶对底物的结合，缩短酶促反应的延滞期，可轻度增加酶对底物的分解作用。目前，临床实验室中应用的脂肪酶测定试剂大都为Roche公司发展的色团底物法，其检测机理为：以2-邻-二月桂基-消旋-甘油-3-戊二酸(6-甲基试卤灵)酯为底物，在碱性环境并有胆酸和共脂肪酶参与下，被脂肪酶水解，生成1,2-邻-二月桂基-甘油和一个不稳定的中间体戊二酸(6-甲基试卤灵)酯。该中间体在碱性条件下，继续水解，产生戊二酸和甲基试卤灵。后者显示红色，显色强度和脂肪酶活力呈正比。反应式如下：
该方法灵敏度高，不出现负值且无需工具酶，可以极大程度的改善传统检测方法的存在的缺陷。市场上大多商品化脂肪酶检测试剂盒的检测范围较窄(只有5～300U/L)，而在临床检测过程中出现的高值样本(即300U/L以上)数量越多，导致其在日常检测过程中需稀释重复检测的频率日益增加，加大试剂的消耗、人力和物力的损耗。此外，色团底物的乳化仍存在批间差异性，导致测定方法稳定性不佳，这些缺陷导致其应用范围仍存在局限性。究其原因可能是：1)为了保证有高灵敏度而导致其在测定高值样本时吸光度上限超限；2)测定高值样本需要在试剂中溶解更多的脂肪酶底物，而底物的增加易导致底物沉淀而造成试剂盒失效。
中国发明专利CN104215632A公开了一种稳定的脂肪酶试剂盒，该试剂盒解决了试剂稳定性，但其可定量范围仍较窄。因此，开发一种可在一个较宽范围进行定量的试剂盒具有重要意义。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种血清脂肪酶检测试剂盒，该试剂盒能够在(10～700)U/L间具有较宽的线性范围。
本发明还提出上述血清脂肪酶检测试剂盒的制备方法。
本发明还提出上述血清脂肪酶检测试剂盒的应用。
根据本发明的第一方面实施例的血清脂肪酶检测试剂盒，所述试剂盒中含有试剂R1和试剂R2，所述试剂R1中含有以下组分：
所述试剂R2中含有以下组分：
其中，上述试剂R1和R2中的组分的含量分数均为质量百分数。
优选地，所述试剂R1中含有以下组分：
所述试剂R2中含有以下组分：
根据本发明的一些实施例，所述试剂盒中还含有校准品。
根据本发明的一些实施例，所述校准品为英国朗道公司生产的生化复合校准品。
根据本发明实施例的检测试剂盒，至少具有如下有益效果：由于脂肪酶底物为酯类物质，不易溶解在水中，且脂肪酶底物析出是造成脂肪酶检测试剂盒不稳定的重要因素，本发明方案通过加入一定比例的脂肪酶底物助溶剂以提高脂肪酶底物在水介质缓冲液中的稳定性，所述助溶剂由正丙醇和DMSO组成，该助溶剂能够大幅提升底物的稳定性，不仅能够使得的不发生沉淀，同时也避免了传统助溶剂所存在的无法避免底物水解等问题，同时，还在试剂R2中添加甘露醇以提升共脂肪酶的稳定性；脂肪酸底物在正丙醇中具有较大的溶解度，但溶有底物的正丙醇溶液溶于水后会立即沉淀，而其DMSO中溶解后不会在水中沉淀，但其溶解度较低，本发明方案巧妙地通过正丙醇与DMSO复配可以大幅提升底物在水溶液中的溶解度，使得该试剂盒具有较好的稳定性；该试剂盒的线性范围为(10～700)U/L，线性范围极宽，可广泛适用于低中高值样本，无需稀释即可实现高值样本的测试，避免了传统方法需要重复测试，降低了试剂的消耗和人力物力的损耗，同时该试剂盒具有较高的反应灵敏度，能够同时满足低值样本的检测，此外，利用本发明方案试剂盒进行测试时，测量结果的CV值低，测试过程的重现性好；本发明方案试剂盒以甘露醇、曲拉通-100和BSA作为复合稳定剂，协同助溶剂增强试剂的稳定性，相对于现有技术中(如专利CN105241873B等)需使用4-甲酰苯基硼酸等高价试剂，在保障试剂稳定的同时大幅降低了生产成本；本发明试剂盒通过优化试剂的配制方案，减少了现有技术中酶反应过程所需加速剂，降低了成本，具有良好的市场推广应用价值。
根据本发明的第二方面实施例的制备方法，包括以下步骤：
试剂R1的配制；
试剂R2的配制：取1倍体积正丙醇溶解脂肪酶底物，待脂肪酶底物溶解后，加入两倍体积的DMSO，混合均匀后，加入含有曲拉通-100、甘露醇和BSA的酒石酸缓冲液，最后加入共脂肪酶，混合均匀后即得；
其中，所述脂肪酶底物包括卵磷脂和1，2-二月桂宗甘油-3-戊二酸-(6’-甲基试卤灵)-酯。
根据本发明的一些实施例，所述制备方法还包括在试剂R2中加入稳定剂(可以为任意常用的稳定剂)后搅拌的操作，所述搅拌操作的时间为1h以上。
根据本发明实施例的制备方法，至少具有如下有益效果：本发明方案的配制方法操作简便，在配制试剂R2时，先将底物溶解于正丙醇中，再与2倍体积的DMSO混合，混合均匀的助溶剂溶液能够在水溶液在稳定保存13个月以上；脂肪酶底物为油酯类化合物，难以溶解于水中，使用助溶剂以使得底物能够更好地溶解在水中，正丙醇对脂肪酶底物具有良好的溶解度，但其同样无法溶解于水中，一旦与水混合会立刻沉淀，而DMSO对底物的溶解能力较差，但DMSO可以与水互溶，因此，本发明方案巧妙地将DMSO与正丙醇混合，使得底物完全快速溶解，节约了时间，同时减少了底物耗损量。
根据本发明的第三方面实施例的应用，一种血清脂肪酶检测方法，包括以下步骤：
取待测物，之后加入试剂R1，预孵育后再加入试剂R2孵育，孵育完成后测定体系的吸光度，读取两次吸光度值，并计算ΔA/min；
其中，所述待测物包括LPS标准品、待测生物样本或生理盐水中的至少一种；所述试剂R1的加入量为试剂R2加入量的5倍；
血清脂肪酶浓度的计算公式为：
根据本发明的一些实施例，待测物添加量为3μL，试剂R1的加入量为250μL，试剂R2的加入量为50μL。
根据本发明的一些实施例，测定吸光度时，采用具有双试剂功能的仪器；优选为日立7180生化自动分析仪。
根据本发明的一些实施例，测定吸光度时，主波长为570nm，次波长为700nm。
根据本发明实施例的应用，至少具有如下有益效果：本发明方案试剂盒具有一个较宽的线性范围、较好的灵敏度和稳定性，使得其能满足实际应用过程中的大多样本测试需求，具有较好的市场应用前景；试剂R1的体积为R2的5倍，同等总体积内，可溶解更多的底物，使得线性范围更宽。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例1中的血清脂肪酶检测试剂盒检测结果的线性拟合关系图；
图2为本发明实施例2中准确度试验结果图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。
本发明的实施例一为：一种血清脂肪酶检测试剂盒及其制备方法与应用，该试剂盒由试剂R1、试剂R2和校准品组成。校准品为英国朗道公司生产的生化复合校准品。试剂R1的组成如下：
| pH 8.8N,N-双(2-羟乙基)-甘氨酸缓冲液 | 50mmol/L |
| 牛磺脱氧胆酸 | 25mmol/L |
| 脱氧胆酸钠 | 5mmol/L |
| 无水氯化钙 | 5mmol/L |
| Proclin300 | 0.05％ |
试剂R2的组成如下：
| pH 5.5酒石酸缓冲液 | 10mmol/L |
| 1,2-二月桂宗甘油-3-戊二酸-(6’-甲基试卤灵)-酯 | 0.25mmol/L |
| 甘露醇 | 1％ |
| 曲拉通-100 | 0.05％ |
| DMSO | 1.0％ |
| 正丙醇 | 0.5％ |
| 卵磷脂 | 0.2％ |
| BSA | 1％ |
该试剂盒的制备过程如下：
试剂R1按照常规混合顺序制备即可，试剂R2的制备过程较为关键，首先用一倍体积的正丙醇溶解脂肪酶底物，待底物完全溶解没有明显颗粒状物质残余的情况下，加入两倍体积的DMSO，混合均匀后，用尖头容器缓慢注入预先配制的含有其它稳定剂成分的缓冲液中，搅拌一小时。
使用本发明实施例方案的试剂盒进行检测，使用时，采用具有双试剂功能的日立7180生化自动分析仪，测试条件与方法如下：
| 主波长 | 570nm | 次波长 | 700nm |
| 校准方法 | 两点定标 | 校准类型 | 线性 |
| 添加量(样本/R1/R2，μL) | 3/250/50 | 孵育时间 | 5min |
| 方法 | 速率法 | 反应方向 | 向上 |
检测过程具体为：加入生理盐水、样本或校准品3μL后，加入试剂R1 250μL预孵育5min后，再加入50μL试剂R2反应5min后，读取两次吸光度值，并计算血清脂肪酶浓度。
取LPS高值血清，用去离子水倍比稀释为7个浓度水平，使用本专利血清脂肪酶检测试剂盒检测，每个样本检测3次，测定结果(U/L)如下表1：
表1
| 浓度梯度 | 0.015625 | 0.03125 | 0.0625 | 0.125 | 0.25 | 0.5 | 1 |
| 测试1 | 18 | 38 | 75 | 150 | 284 | 500 | 980 |
| 测试2 | 19 | 40 | 74 | 149 | 292 | 521 | 985 |
| 测试3 | 19 | 41 | 74 | 149 | 286 | 523 | 1001 |
| 平均值 | 18.67 | 39.67 | 74.33 | 149.33 | 287.33 | 514.67 | 988.67 |
将测量平均值进行线性相关性拟合，结果如图1所示，由图1可以看出，本发明试剂盒的线性范围宽且R2＝0.998。
本发明的实施例二为：上述实施例1制得的试剂盒的准确度试验：
由于脂肪酶项目无法溯源至SI单位，因此，通过对比试验进行准确度测试。
1、采用校准品定标后，与市场上成熟的试剂盒测定的同一批次血清进行比对实验，结果如下表2所示：
表2
将上表中的数据点在二维平面坐标系中标出，结果如图2所示(图中x代表市场成熟试剂盒测得的浓度，y值代表本发明方案试剂盒测得的浓度)，对各点进行线性相关性拟合发现，其斜率接近于1，截矩也接近于零，由此表明，本发明方案试剂盒的检测结果与市场成熟试剂盒一致性好。
2、测定卫生部常规生化质控(2019)结果如下表2所示：
表2
3、将本发明所述的脂肪酶测定试剂盒与市场上一款相同方法学的脂肪酶测定试剂盒做对比，在同一台全自动生化分析仪上测定朗道常规生化质控品(水平2和水平3)，试剂使用37℃密闭加速，测定结果如下表3所示：
表3
从表3可以看出，本发明实施例方案的脂肪酶测定试剂盒比市场上一款试剂盒测定结果相对偏差小，变异系数(CV值)小，表明本试剂盒具有更高的稳定性和精密度。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (4)
1.一种血清脂肪酶检测试剂盒，所述试剂盒由试剂R1和试剂R2组成，其特征在于：所述试剂R1由以下组分组成：
所述试剂R2中含有以下组分：
其中，上述试剂R1和R2中的组分的含量分数均为质量百分数；
试剂R2的配制：取1倍体积正丙醇溶解脂肪酶底物，待脂肪酶底物溶解后，加入两倍体积的DMSO，混合均匀后，加入含有曲拉通-100、甘露醇和BSA的酒石酸缓冲液，最后加入共脂肪酶，混合均匀后即得；
其中，所述脂肪酶底物包括卵磷脂和1，2-二月桂宗甘油-3-戊二酸-(6’-甲基试卤灵)-酯。
2.根据权利要求1所述的血清脂肪酶检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有校准品。
3.根据权利要求1至2任一项所述的检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
配制所述试剂R1；
配制所述试剂R2：取1倍体积正丙醇溶解脂肪酶底物，待脂肪酶底物溶解后，加入两倍体积的DMSO，混合均匀后，加入含有曲拉通-100、甘露醇和BSA的酒石酸缓冲液，最后加入共脂肪酶，混合均匀后即得；
其中，所述脂肪酶底物包括卵磷脂和1，2-二月桂宗甘油-3-戊二酸-(6’-甲基试卤灵)-酯。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述制备方法还包括在试剂R2中加入稳定剂后搅拌的操作，所述搅拌操作的时间为1h以上。
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