CN104198474A - 比色法测定血清中脂肪酶含量的检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种比色法测定血清中脂肪酶含量的检测试剂盒，由试剂R1和试剂R2组成，所述试剂R1含有1～200mmol/L pH＝7.6～9.0的缓冲液、1～20mmol/L脱氧胆酸盐、1～10mg/L共脂肪酶和0.5～2g/L防腐剂；所述试剂R2含有1～200mmol/L pH＝4.0～6.0的缓冲液、1～20mmol/L脂肪酶底物、0.2～10mmol/L胆酸盐、1～10ml/L二甲亚砜和防腐剂。本发明的试剂盒底物为脂肪酶的人工合成底物，稳定性佳，有较大的临床应用价值；通过该试剂盒来检测血清中的LPS含量，可达到操作简便、稳定性佳、特异性好，快速、测定结果准确可靠的目的。

Description

比色法测定血清中脂肪酶含量的检测试剂盒

技术领域

本发明具体涉及一种比色法测定血清中的脂肪酶(LPS)含量的检测试剂盒。

背景技术

脂肪酶(甘油三酯酰基水解酶)是一种糖蛋白，含有420～449个氨基酸残基，其特异的底物是含长链脂肪酸的甘油三酯。血清脂肪酶主要从胰腺细咆分泌而来，胰腺中脂肪酶浓度比肝、十二指肠及小肠中高10倍，比血清中高20000倍，十二指肠与血清间差500-800倍，正常胰腺中脂肪酶活性相当于淀粉酶活性的4.5倍。目前由于选择用于诊断胰腺炎的脂肪酶测定阈值较低，所有脂肪酶的测定方法临床灵敏度都很高，而诊断的特异性变化却很大。在胰腺炎诊断中脂肪酶测定的特异性优于淀粉酶。

脂肪酶测定是1932年Cherry和Crandall首先提出的。之后对测定时间、特异性、重复性和灵敏度进行了大量改进。通过改进底物及加入胆酸盐和共脂肪酶可使血清中非特异性的脂解反应降至最低。比如，用含长链脂肪酸的甘油三酯作为底物可增加反应的特异性，减少非特异性酯酶的反应。胆酸盐可使胰腺脂肪酶固定于底物乳状液的油水界面上，但过量的胆酸盐可抑制脂肪酶活性，此抑制过程可被共脂肪酶特异性地逆转。由于患胰腺炎病人常缺乏共脂肪酶或其活力低于正常值，因此在过量胆酸盐存在时测定脂肪酶而额外加入共脂肪酶是很重要的，这样可提高胰腺脂肪酶的特异性。脂肪酶在临床的意义：正常人血液LPS含量极少，但在急性胰腺炎时，2～12h血液LPS显著升高，24h至峰值，可达正常值上限的10倍，甚至50倍，至48～72h可能恢复正常但随后又可持续升高8～15天。由于血液LPS在急性胰腺炎时活性升高的时间早，上升的幅度的大，持续的时间长，故其诊断价值优于淀粉酶。临床观察发现，凡血液AMY升高的病例，其LPS均升高；而LPS升高者AMY不一定升高，约有2/3AMY正常的胰腺炎病人，其LPS正常；非胰腺炎的急腹症有血液AMY升高而LPS不升高。酗酒、乙醇性胰腺炎、慢性胰腺炎、胰腺癌、肝胆疾患等血液LPS可有不同程度的升高。

目前测定脂肪酶的方法有比浊法、pH-Stat法、免疫测定法和酶偶联显色比色法。比浊法是基于三油酸甘油酯转变为甘油二酯时甘油三酯乳浊液浊度在340或365nm处降低。该方法有某些缺陷，主要与一些样品早期反应阶段的非线性及其线性范围有关。早期反应阶段吸收率的增加常与患者的类风湿因子有关，甘油三酯浓度＞5.5g/L干扰测定，血红蛋白浓度＞2g/L引起酶活性降低。pH-Stat法是基于脂肪酶水解释放脂肪酸导致反应液pH降低，采用一支pH电极或一种指示剂如酚酞，进行连续滴定检测。该方法与免疫化学法相关性很好，但因其费时、费力、难于自动化及需要特殊的仪器，而在一个时期未被广泛采用。免疫测定法是将脂肪酶特异性抗体固定于试管壁上，使其与脂肪酶结合，连着过氧化物酶及分离的脂肪酶抗原的二抗结合于脂肪酶上，形成一个夹心“三明治”，用一种色素原溶液镜头培养，在492nm下测定吸光度的增加率。该法灵敏度高，故较适宜测定胰腺机能不全患者的脂肪酶，但该法较费时，故不适用于急性胰腺炎的检测。酶偶联显色比色法，多用1，2-甘油二酯为底物，在LPS和单酸甘油酯脂肪酶的催化下，水解生成甘油和脂肪酸，甘油通过甘油激酶作用生成3-磷酸甘油，再通过甘油磷酸氧化酶/过氧化物酶体系和4-AAP色素原体系产生紫红色。于550nm波长连续监测吸光度的变化即可计算LPS活性。此类方法特异性高，通过双试剂也基本可解决内源性甘油的干扰问题。但是酶偶联显色法，工具酶的价格昂贵，而且酶来源少且不稳定。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有试剂盒存在的缺陷，提供一种比色法测定血清中的脂肪酶(LPS)含量的检测试剂盒。本发明通过该比色法测试试剂盒来检测血清中的LPS含量，以达到操作简便、稳定性佳、特异性好，快速、测定结果准确可靠的目的。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种比色法测定血清中的脂肪酶含量的检测试剂盒，由试剂R1和试剂R2组成，所述试剂R1含有1～200mmol/L pH＝7.6～9.0的缓冲液、1～20mmol/L脱氧胆酸盐、1～10mg/L共脂肪酶和0.5～2g/L防腐剂；所述试剂R2含有1～200mmol/LpH＝4.0～6.0的缓冲液、1～20mmol/L脂肪酶底物、0.2～10mmol/L胆酸盐、1～10ml/L二甲亚砜和0.5～2g/L防腐剂。

上述试剂R1中的脱氧胆酸盐可使胰腺脂肪酶固定于底物乳状液的油水界面上；共脂肪酶可特异性地逆转由于脱氧胆酸盐过量所引起的脂肪酶活性被抑制的过程。试剂R2中一定浓度(1～10ml/L)的二甲亚砜对共脂肪酶有激活作用。

优选的，所述试剂R1含有50～150mmol/L pH＝7.0～8.0的缓冲液、1～10mmol/L脱氧胆酸盐、1～5mg/L共脂肪酶和0.5～1.0g/L防腐剂；所述试剂R2含有50～150mmol/LpH＝4.0～5.0的缓冲液、10～20mmol/L脂肪酶底物、0.2～5mmol/L胆酸盐、3～8ml/L二甲亚砜和0.5～1g/L防腐剂。

优选的，所述脂肪酶底物为1，2-邻二月桂基-消旋-甘油-3-戊二酸-(6-甲基试卤灵)酯。该脂肪酶底物为人工合成，稳定性好。

优选的，所述试剂R1、R2中包含的缓冲液分别选自三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、丙磺酸(MOPS)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、酒石酸、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、三乙醇胺(TEA)和柠檬酸钠中的一种或几种。

优选的，所述试剂R1、R2中包含的防腐剂分别选自叠氮化钠、Proclin300、聚赖氨酸、山梨酸钾和乙酸钠中的一种或几种。

本发明还涉及一种上述的检测试剂盒的使用方法，试剂R1加入样本后37℃孵育3分钟，再加入试剂R2，37℃孵育1分钟，连续监测3分钟的吸光度变化率，与LPS标准品的脂肪酶含量与吸光度关系曲线进行比较，得到样本的脂肪酶含量。

优选的，所述试剂R1和试剂R2的体积比为2∶1或4∶1。

本发明试剂盒的检测原理为：以1，2-邻二月桂基-消旋-甘油-3-戊二酸-(6-甲基试卤灵)酯为底物，在碱性环境并有胆酸和共脂肪酶参与下被脂肪酶水解，生成1，2-邻二月桂基-消旋-甘油和一个不稳定的中间体戊二酸-(6-甲基试卤灵)酯；该中间体在碱性条件下，继续水解，产生戊二酸和甲基试卤灵。甲基试卤灵显示红色，显色强度和脂肪酶活力成正比。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、R1试剂中加入了脱氧胆酸盐和共脂肪酶，可使血清中非特异性的脂解反应降至最低，脱氧胆酸盐可使胰腺脂肪酶固定于底物乳状液的油水界面上，但过量的胆酸盐可抑制脂肪酶活性，而共脂肪酶可特异性地逆转该抑制过程。

2、现在市售LPS试剂所使用的样本和试剂R1、R2的比例多数为2∶200∶100，而本发明试剂除了能用以上参数进行检测，还可以用4∶200∶50的参数来进行检测；而且对于本发明的试剂而言，这两种方法的检测结果类似，这样有效节省了试剂，从而降低成本。

3、R2试剂中的脂肪酶底物为人工合成，性质稳定，有利于提高试剂37℃稳定性以及效期稳定性；且R2试剂中的二甲亚砜可激活共脂肪酶活性。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为LPS参考标准的标准曲线，其中X轴表示LPS的含量，Y轴表示吸光度。

图2为分别采用本发明试剂和美国贝克曼公司的LPS试剂，采用日立全自动生化分析仪对50份人血清(包含正常和异常标本)按各自参数同时进行测定，对测定值进行相关分析的示意图；其中，X轴表示的是本发明试剂测定的病人血清结果，Y轴表示的是美国贝克曼公司试剂测定的病人血清结果，相关系数R²＝0.9921，回归方程为y＝1.0244x+1.5184。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。以下实施例中的原料均为现有常用原料，可以直接通过商家购买获得。本发明以下实施例中没有特别说明的操作，均可以采用现有常规技术手段。

实施例1

测定试剂盒组成如下：

1.试剂R1为：

2.试剂R2为：

各种成分可以室温下依次添加，或者同时添加，或者是分别单独包装并与检测之前在即时配制。

3.试剂检测比例为2∶1

本实施例描述的LPS检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如表1。分析方法：速率法，即试剂R1、R2的用量分别为200ul和100ul，样本量2ul；200ul试剂R1加入2ul样本于37℃3min后加入100ulR2，延迟1min后开始读点，读数时间约180s；检测主波长为570nm，副波长为700nm。

采用本试剂及上述测定方法，采用日立7170生化分析仪测得的LPS标准品(Roche公司C.f.a.s.)的曲线(如图1所示)，其中X轴表示LPS含量(U/L)；Y轴表示吸光度。

表1

实施例2

测定试剂盒组成如下：

1.试剂R1为：

各种成分可以室温下依次添加，或者同时添加，或者是分别单独包装并于检测之前再即时配制。

2.试剂R2为：

3.试剂检测比例为4∶1

本实施例描述的LPS检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如表2。分析方法：速率法，即试剂R1、R2的用量分别为200ul和50ul，样本量4ul；200ul试剂R1加入4ul样本于37℃3min后加入50ulR2，延迟1min后开始读点，读数时间约180s；检测主波长为570nm，副波长为700nm。

采用本试剂及上述测定方法，采用日立7170生化分析仪测得的LPS标准品(Roche公司C.f.a.s.)的曲线(如图1所示)，其中X轴表示LPS含量(U/L)；Y轴表示吸光度。

表2

实施例3

测定试剂盒组成如下：

1.试剂R1为：

2.试剂R2为：

各种成分可以室温下依次添加，或者同时添加，或者是分别单独包装并与检测之前在即时配制。

3.试剂检测比例为2∶1

本实施例描述的LPS检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如表3。分析方法：速率法，即试剂R1、R2的用量分别为200ul和100ul，样本量2ul；200ul试剂R1加入2ul样本于37℃3min后加入100ulR2，延迟1min后开始读点，读数时间约180s；检测主波长为570nm，副波长为700nm。

采用本试剂及上述测定方法，采用日立7170生化分析仪测得的LPS标准品(Roche公司C.f.a.s.)的曲线(如图1所示)，其中X轴表示LPS含量(U/L)；Y轴表示吸光度。

表3

实施例4

测定试剂盒组成如下：

1.试剂R1为：

各种成分可以室温下依次添加，或者同时添加，或者是分别单独包装并于检测之前再即时配制。

2.试剂R2为：

3.试剂检测比例为2∶1

本实施例描述的LPS检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如表4。分析方法：速率法，即试剂R1、R2的用量分别为200ul和100ul，样本量2ul；200ul试剂R1加入4ul样本于37℃3min后加入100ulR2，延迟1min后开始读点，读数时间约180s；检测主波长为570nm，副波长为700nm。

采用本试剂及上述测定方法，采用日立7170生化分析仪测得的LPS标准品(Roche公司C.f.a.s.)的曲线(如图1所示)，其中X轴表示LPS含量(U/L)；Y轴表示吸光度。

表4

实施例5

测定试剂盒组成如下：

1.试剂R1为：

各种成分可以室温下依次添加，或者同时添加，或者是分别单独包装并于检测之前再即时配制。

2.试剂R2为：

3.试剂检测比例为4∶1

本实施例描述的LPS检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如表5。分析方法：速率法，即试剂R1、R2的用量分别为200ul和50ul，样本量4ul；200ul试剂R1加入4ul样本于37℃3min后加入50ulR2，延迟1min后开始读点，读数时间约180s；检测主波长为570nm，副波长为700nm。

采用本试剂及上述测定方法，采用日立7170生化分析仪测得的LPS标准品(Roche公司C.f.a.s.)的曲线(如图1所示)，其中X轴表示LPS含量(U/L)；Y轴表示吸光度。

表5

实施例6、检测试剂的相关性试验

使用本法发明试剂(具体配方同实施例1)和对照试剂美国贝克曼公司的LPS试剂，采用自动7170全自动生化分析仪对50份人血清(包括正常和异常标本)按各自参数同时进行测定，对测定值进行相关性分析。按照与上述“表1”中的参数进行测定，测定结果见图2，X，Y轴均为测定值(LPS的含量U/L)，

由图2的结果看出，两种试剂的相关系为R²＝0.9921，回归方程为y＝1.0244x+1.5184。结果表明本试剂与进口试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。

此外，以上实验是采用日立公司制造的7170全自动生化仪进行的，但本发明的试剂不限于上述仪器，还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。

实施例7、最低检测限试验

本实验目的是检测试剂在测试临床样本时的最小检出感度。

采用实施例2试剂、对照试剂(北京恩济和生物)、标准品、空白溶液(一般是生理食盐水和精制水)、正常人血清样本。

机器：日立7170自动生化分析仪。

操作步骤：使用生理食盐水或是去离子水溶解样本，然后50％稀释成5个点，和零点一起每一个样本测试5次，计算平均值，求得SD数值。

结果解析：根据检测数据，计算SD数值和CV数值，分别计算1SD，2SD，从最小的开始，其平均值-2SD的数值在零点平均值+2SD以上的就是试剂的最小检出感度。

表6结果显示，本发明试剂测定稀释1/16、1/8、1/4、1/2血清时，测定平均值-2SD的数值均大于零点平均值+2SD，表明本发明试剂最低检测限至少可以达到4.27U/L。而表7结果显示，对照北京恩济和公司试剂测定稀释1/16、1/8、1/4、1/2血清，并比较血清平均值-2SD与零点平均值+2SD大小，其中1/16、1/8稀释平均值-2SD的数值小于零点平均值+2SD，1/4、1/2稀释平均值-2SD的数值大于零点平均值+2SD，表明北京恩济和公司试剂最低检测限为15U/L左右。由表6、7可知，本发明试剂最低检测限明显好于北京恩济和公司试剂。

实施例2～5的最低检测限试验同上，测得结果基本同上，说明本发明试剂最低检测限至少可以达到4.27U/L。

表6

表7

综上所述，本发明试剂可用两种参数来检测样本，其中一种参数是R1、R2加样比例为200∶100，样本进样量为2μl，另一种参数为R1、R2加样比例为200∶50，样本进样量为4μl。本发明试剂的方法学为酶比色法，其中最主要和最基本的依据是酶促反应速度，而酶促反应的速率和底物浓度以及酶浓度密切相关，本发明正是通过改变酶浓度和底物浓度，也就是改变样本进样量以及试剂R1、R2的比例，来优化酶促反应，以实现两种参数均可检测样本的效果，并且检测结果相差不大。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (7)

1.一种比色法测定血清中的脂肪酶含量的检测试剂盒，由试剂R1和试剂R2组成，其特征在于，所述试剂R1含有1～200mmol/L pH＝7.0～9.0的缓冲液、1～20mmol/L脱氧胆酸盐、1～10mg/L共脂肪酶和0.5～2g/L防腐剂；所述试剂R2含有1～200mmol/LpH＝4.0～6.0的缓冲液、1～20mmol/L脂肪酶底物、0.2～10mmol/L胆酸盐、1～10ml/L二甲亚砜和0.5～2g/L防腐剂。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1含有50～150mmol/LpH＝7.0～8.0的缓冲液、1～10mmol/L脱氧胆酸盐、1～5mg/L共脂肪酶和0.5～1g/L防腐剂；所述试剂R2含有50～150mmol/L pH＝4.0～5.0的缓冲液、10～20mmol/L脂肪酶底物、0.2～5mmol/L胆酸盐、3～8ml/L二甲亚砜和0.5～1g/L防腐剂。

3.根据权利要求1或2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述脂肪酶底物为1，2-邻二月桂基-消旋-甘油-3-戊二酸-(6-甲基试卤灵)酯。

4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1、R2中包含的缓冲液分别选自TRIS、MOPS、HEPES、酒石酸、MES、TEA和柠檬酸钠中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1、R2中包含的防腐剂分别选自叠氮化钠、Proclin300、聚赖氨酸、山梨酸钾和乙酸钠中的一种或几种。

6.一种根据权利要求1～5中任一项所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，试剂R1加入样本后37℃孵育3分钟，再加入试剂R2，37℃孵育1分钟，连续监测3分钟的吸光度变化率，与LPS标准品的脂肪酶含量与吸光度关系曲线进行比较，得到样本的脂肪酶含量。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2的体积比为2∶1或4∶1。