JP6064041B2 - ヒト膵リパーゼ活性の測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、臨床検査分野における試料中のヒト膵リパーゼ活性の測定方法及びキットに関する。

ヒト膵リパーゼは急性膵炎等の膵臓疾患の診断マーカーとして重要であり、血清中の酵素活性を測定する試薬が臨床検査薬として市販されている。その酵素活性測定時の至適水素イオン指数（ｐＨ）は用いる基質や反応条件により異なるものの、概ね７．５から１０の範囲であると報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。ヒト膵リパーゼの酵素学的特徴として、反応が基質を含むエマルジョンやミセルの界面で起こること、酵素の活性化に、胆汁酸と、コリパーゼと呼ばれる分子量約１ｌｋＤａの蛋白質と、を必要とすることが挙げられる。胆汁酸及びコリパーゼが存在しないと、膵リパーゼの活性中心は、蓋を意味するリッド（ｌｉｄ）と呼ばれるドメインに覆われ、基質と接触できない。胆汁酸はエマルジョンやミセルの形成に影響を与えるが、更にコリパーゼが存在することによりヒト膵リパーゼの立体構造が変化し、ヒト膵リパーゼの活性中心に基質が結合することができるようになり、ひいてはヒト膵リパーゼが活性を示すようになる。このようにヒト膵リパーゼは、疎水性の基質、胆汁酸塩、そしてコリパーゼからなる複合体の界面で作用することが知られている。

従来、試料中のヒト膵リパーゼ活性測定において、その基質としてトリグリセリドが用いられている。トリグリセリドは、アラビアゴムやポリビニルアルコール等と強制撹拌させることにより緩衝液中に乳化分散した、いわゆるエマルジョンの形態で使用されている。トリグリセリド基質を用いてリパーゼ活性を測定する際には、例えば、リパーゼ反応により生成した脂肪酸をアルカリ滴定法で定量する。また、トリグリセリド基質からリパーゼ反応で遊離される脂肪酸を酵素法により測定する試みもなされているが、トリグリセリド基質はエマルジョンに起因する強い濁度を有するために、酵素共役系を用いて分光学的にリパーゼ活性を測定することは困難である。またエマルジョン基質は保存により相分離を起こしやすい欠点があり、再現性良くリパーゼ活性を測定することは困難である。こうしたトリグリセリド基質を用いる方法の課題の解決を目的として、ジグリセリドを基質に用いる方法（例えば、特許文献１、２参照。）や、合成基質を用いる方法（例えば、非特許文献２参照。）が開発され、これらは現在、日常検査法に用いられている。

ジグリセリドを基質に用いることの利点としては、トリグリセリドよりも親水性が高い為、界面活性剤と組み合わせることにより基質の澄明化につながり、汎用の自動分析装置に適応できるという利便性が挙げられる。

ジグリセリド基質としては主に１，２−ジグリセリドが使用されている。１，２−ジグリセリドは分子内でエステル結合の転移反応により１，３−ジグリセリドへ変化することが知られており、この変化が極力起きないようにして使用されている。また、１，２−ジグリセリドの一部を１，３−ジグリセリドに変換させ、この混合物を液状で安定化し、これをヒト膵リパーゼ測定の基質として用いることが提案されている（例えば、特許文献３参照。）。ここで、ジグリセリド基質を用いる測定方法は、リポプロテインリパーゼ、及び肝性リパーゼ等の非膵リパーゼの影響を受けることが報告されている。また、ジグリセリド基質を用いる測定方法では、血液中のリポプロテインリパーゼなどの非膵リパーゼやエステラーゼの影響を受けるため、膵リパーゼへの特異性が低下しやすいなどの弊害がある、との報告がある（例えば、特許文献４参照。）。ヒトのリポプロテインリパーゼ、肝性リパーゼ等の非膵リパーゼは、ヘパリンによって血中へ放出される。そのため、ヘパリン投与検体では血中の膵リパーゼ活性を正確に測定できない。一方、合成基質を用いたヒト膵リパーゼ活性測定用の日常検査試薬では、リポプロテインリーゼ、肝性リパーゼ等の非膵リパーゼの影響を受けないとされているが（例えば、非特許文献２参照。）、リパーゼの至適ｐＨである弱アルカリ性領域での合成基質の安定性に難がある。

非膵リパーゼの影響を回避する方法として、ジグリセリドである１，２−ジリノレオイルグリセロールを基質に用いたリパーゼ活性測定用の市販キットにおいて、胆汁酸塩として使用されているデオキシコール酸ナトリウムをグリココール酸ナトリウムに置換えることにより、非膵リパーゼの影響が軽減されたとの報告があるが（例えば、非特許文献３参照。）、その詳細は不明である。また、ジグリセリドを基質に用いるリパーゼ活性の測定方法のみならず、トリグリセリドを基質に用いるリパーゼ活性の測定方法においても、非膵リパーゼの影響を受けるが、この場合もデオキシコール酸をグリココール酸に変えることで、非膵リパーゼの影響が回避されたとの報告がある（例えば、非特許文献４参照。）。ただし、上述したように、トリグリセリド基質は分光学的に測定できないことや保存により相分離を起こしやすい欠点があることから、再現性良くリパーゼ活性を測定することは困難である。

特開昭５９−９１８９８号公報（特許第１６０７８９０号公報） 特開昭６３−２４５６７２号公報 特許第４８３６１９６号公報 特開２００８−３０７０４８号公報

Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３９：ｐ７４６−７５６，１９９３ 医学と薬学、４１巻３号、ｐ４８９−４９６、１９９９ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８：２８８−２９２，１９９２ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５：ｐ１６８８−１６９３，１９８９ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４４（２），３９９−４０６，１９８０

ジグリセリドを基質に用いる試料中のヒト膵リパーゼ活性の測定方法は、トリグリセリドを用いる測定方法に比べて再現性の面で優れるものの、相対的にリポプロテインリパーゼや肝性リパーゼの影響を受けやすい。したがって、ジグリセリドを基質に用いながら、これらの影響を回避した、より膵リパーゼへの特異性が高いヒト膵リパーゼ活性の測定方法が求められている。

前述のように、一般に、ヒトの膵リパーゼ活性の測定時の至適ｐＨは、用いる基質や反応条件により異なるが、概ね７．５から１０の範囲にあると報告されている。本発明者らは鋭意検討した結果、ジグリセリドを基質に用いる、試料中のヒト膵リパーゼの活性測定において、ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨを酸性側へ移動させ、従来報告されているよりも低いｐＨ条件にて胆汁酸及びコリパーゼを共存させてヒト膵リパーゼ反応を行うことで、意外にも、ヘパリン投与などにより試料中に混在することがあるリポプロテインリパーゼや肝性リパーゼ等の非膵リパーゼの影響を軽減できることを見出した。

すなわち、本発明は、特定の抱合型胆汁酸を単独又は他の胆汁酸と組み合わせて用いることにより、ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨが７．７未満となるように設定せしめ、更にｐＨ７．４以下にて試料中のヒト膵リパーゼ活性を測定することを特徴とする、非膵リパーゼの影響を軽減したヒト膵リパーゼ活性の測定方法である。

なお、「抱合型胆汁酸」とは、胆汁酸に例えばグリシン、又はタウリン等のアミノ酸が抱合したものをいい、「非抱合型胆汁酸」とは、抱合型胆汁酸以外の胆汁酸を意味する。また、「至適ｐＨ」とは、膵リパーゼ活性が最大となる時の測定ｐＨを意味する。

本発明の態様は、試料中のヒト膵リパーゼ活性の測定方法であって、１）ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨを７．７未満にする胆汁酸、ジグリセリド、及びコリパーゼと、試料とを、ｐＨ７．４以下で接触せしめる接触工程と、２）試料中のヒト膵リパーゼ活性に応じて変化するシグナル量を検出する検出工程と、を含む方法であり、ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨを７．７未満にする胆汁酸が、ａ）グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のａ型胆汁酸；及び／又はｂ）グリココール酸（ＧＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のｂ−１型胆汁酸と、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のｂ−２型胆汁酸と、の組合せ；を含む胆汁酸である、測定方法である。

例えば、ｐＨに対してヒト膵リパーゼの活性をプロットした場合、上に凸の曲線が描かれた場合、活性の最大値とは、活性のピークを意味する。また、通常の条件下において、ヒト膵リパーゼ活性が最大となる時の測定ｐＨを意味する「至適ｐＨ」に対して、上記の胆汁酸が存在する時にヒト膵リパーゼ活性が最大となる時の測定ｐＨを「見かけの至適ｐＨ」という場合もある。

例えば、接触工程において、ａ型胆汁酸が用いられ場合、ａ型胆汁酸の添加割合が、全ての胆汁酸及び／又はその塩の総量に対して４０％以上である。

ジグリセリドと共に、非イオン界面活性剤が存在していてもよい。非イオン界面活性剤は、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレン２級アルコールエーテルからなる群から選択される少なくとも１つである。

例えば、検出工程において、比色法が用いられる。また、例えば、接触工程において、全胆汁酸の濃度がモル比でジグリセリドに対して１０倍以上である。さらに、例えば、接触工程において、ｐＨが７．２以下である。
本発明の構成の一例は以下の通りである。
（１）
試料中のヒト膵リパーゼ活性の測定方法であって、
１）前記ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨを７．７未満にする胆汁酸、ジグリセリド、及びコリパーゼと、前記試料とを、ｐＨ７．４以下で接触せしめる接触工程と、
２）前記試料中の前記ヒト膵リパーゼ活性に応じて変化するシグナル量を検出する検出工程と、
を含む測定方法であり、
前記胆汁酸が、
ａ）グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のａ型胆汁酸；及び／又は
ｂ）グリココール酸（ＧＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のｂ−１型胆汁酸と、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のｂ−２型胆汁酸と、の組合せ；
を含む胆汁酸である、
測定方法。
（２）
前記試料が、ヒト非膵リパーゼの混在することがある試料、あるいはヒト非膵リパーゼを含むことができる試料である、（１）に記載の測定方法。
（３）
前記接触工程において、前記ａ）の胆汁酸が用いられる、（１）又は（２）に記載の測定方法。
（４）
前記ａ）の胆汁酸を用いる場合において、前記ａ型胆汁酸の添加割合が、全ての胆汁酸及び／又はその塩の総量に対して４０％以上である、（１）ないし（３）のいずれか１つに記載の測定方法。
（５）
前記接触工程において、前記ｂ）の胆汁酸が用いられる、（１）又は（２）に記載の測定方法。
（６）
前記ａ型胆汁酸が、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）及びその塩から選択される１種又は２種である、（１）ないし（４）のいずれか１つに記載の測定方法。
（７）
前記ａ型胆汁酸が、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上である、（１）ないし（４）のいずれか１つに記載の測定方法。
（８）
前記ａ型胆汁酸が、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）及びその塩から選択される１種又は２種である、（１）ないし（４）のいずれか１つに記載の測定方法。
（９）
前記ジグリセリドと共に、非イオン界面活性剤が存在する、（１）ないし（８）のいずれか１つに記載の測定方法。
（１０）
前記非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレン２級アルコールエーテルからなる群から選択される少なくとも１つである、（９）に記載の測定方法。
（１１）
前記検出工程において、比色法が用いられる、（１）ないし（１０）のいずれか１つに記載の測定方法。
（１２）
前記接触工程において、全胆汁酸の濃度がモル比で前記ジグリセリドに対して１０倍以上である、(１)ないし(１１)のいずれか１つに記載の測定方法。
(１３)
前記接触工程において、ｐＨが７．２以下である、（１）ないし（１２）のいずれか１つに記載の測定方法。
(１４)
ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨを７．７未満にする胆汁酸、ジグリセリド、及びコリパーゼを少なくとも含む、試料中のヒト膵リパーゼ活性の測定用キットであって、
前記ヒト膵リパーゼ活性の測定時のｐＨが７．４以下となるよう調製されており、
前記胆汁酸が、
ａ）グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のａ型胆汁酸；及び／又は
ｂ）グリココール酸（ＧＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のｂ−１型胆汁酸と、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のｂ−２型胆汁酸と、の組合せ；
を含む胆汁酸である、
キット。
（１５）
前記試料がヒト非膵リパーゼの混在することがある試料、あるいはヒト非膵リパーゼを含むことができる試料である、（１４）に記載のキット。
(１６)
色原体を更に含む、(１４)又は（１５）に記載のキット。
(１７)
活性測定時のｐＨが７．２以下となるように調整された、(１４)ないし(１６)に記載のキット。
(１８)
内容物が複数の容器に分けて保存されている、(１４)ないし(１７)のいずれか１つに記載のキット。
（１９）
試料中のヒト膵リパーゼ活性の測定方法であって、
１）胆汁酸、ジグリセリド、及びコリパーゼと、前記試料とを、ｐＨ７．４以下で接触せしめる接触工程と、
２）前記試料中の前記ヒト膵リパーゼ活性に応じて変化するシグナル量を検出する検出工程と、
を含む測定方法であり、
前記ジグリセリドの濃度が０．３５〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、前記胆汁酸の濃度がモル比で前記ジグリセリドの濃度の１０〜２０倍であり、
前記胆汁酸が、
ａ）グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のａ型胆汁酸を含む胆汁酸であって、前記ａ型胆汁酸のモル比が、全ての胆汁酸及び／又はその塩の総量に対して４０％以上である胆汁酸；及び／又は
ｂ）グリココール酸（ＧＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のｂ−１型胆汁酸と、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のｂ−２型胆汁酸と、の組合せを含む胆汁酸であって、前記ｂ−１型胆汁酸のモル比が、全ての胆汁酸及び／又はその塩の総量に対して３０〜７０％である胆汁酸；
である、
測定方法。
（２０）
前記試料がヒト非膵リパーゼの混在することがある試料、あるいはヒト非膵リパーゼを含むことができる試料である、（１９）に記載の測定方法。
（２１）
前記接触工程において、前記ａ）の胆汁酸が用いられる、（１９）又は（２０）に記載の測定方法。
（２２）
前記接触工程において、前記ｂ）の胆汁酸が用いられる、（１９）又は（２０）に記載の測定方法。
（２３）
前記ａ型胆汁酸が、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）及びその塩から選択される１種又は２種である、（１９）ないし（２１）のいずれか１つに記載の測定方法。
（２４）
前記ａ型胆汁酸が、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上である、（１９）ないし（２１）のいずれか１つに記載の測定方法。
（２５）
前記ａ型胆汁酸が、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）及びその塩から選択される１種又は２種である、（１９）ないし（２１）のいずれか１つに記載の測定方法。
（２６）
前記ジグリセリドと共に、非イオン界面活性剤が存在する、（１９）ないし（２５）のいずれか１つに記載の測定方法。
（２７）
前記非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレン２級アルコールエーテルからなる群から選択される少なくとも１つである、（２６）に記載の測定方法。
（２８）
前記検出工程において、比色法が用いられる、（１９）ないし（２７）のいずれか１つに記載の測定方法。
（２９）
前記接触工程において、ｐＨが７．２以下である、（１９）ないし（２８）のいずれか１つに記載の測定方法。
（３０）
胆汁酸、ジグリセリド、及びコリパーゼを少なくとも含む、試料中のヒト膵リパーゼ活性の測定用キットであって、
前記ヒト膵リパーゼ活性の測定時のｐＨが７．４以下となるよう調製されており、かつ少なくとも前記胆汁酸、前記ジグリセリド、及び前記コリパーゼと、前記試料と、を接触させる反応液中の前記ジグリセリドの濃度が０．３５〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、前記胆汁酸の濃度がモル比で前記ジグリセリドの濃度の１０〜２０倍となるよう調製されており、
前記胆汁酸が、
ａ）グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のａ型胆汁酸を含む胆汁酸であって、前記ａ型胆汁酸のモル比が、全ての胆汁酸及び／又はその塩の総量に対して４０％以上である胆汁酸；及び／又は
ｂ）グリココール酸（ＧＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のｂ−１型胆汁酸と、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のｂ−２型胆汁酸と、の組合せを含む胆汁酸であって、前記ｂ−１型胆汁酸のモル比が、全ての胆汁酸及び／又はその塩の総量に対して３０〜７０％である胆汁酸；
である、
キット。
（３１）
前記試料がヒト非膵リパーゼの混在することがある試料、あるいはヒト非膵リパーゼを含むことができる試料である、（３０）に記載の測定方法。
（３２）
色原体を更に含む、（３０）又は（３１）に記載のキット。
（３３）
活性測定時のｐＨが７．２以下となるように調整された、（３０）ないし（３２）のいずれか１つに記載のキット。
（３４）
内容物が複数の容器に分けて保存されている、（３０）ないし（３３）のいずれか１つに記載のキット。

本発明の他の態様は、ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨを７．７未満にする胆汁酸、ジグリセリド、及びコリパーゼを少なくとも含む、試料中のヒト膵リパーゼ活性の測定用キットであって、ヒト膵リパーゼ活性の測定時のｐＨが７．４以下となるよう調製されており、ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨを７．７未満にする胆汁酸が、ａ）グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のａ型胆汁酸；及び／又はｂ）グリココール酸（ＧＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のｂ−１型胆汁酸と、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のｂ−２型胆汁酸と、の組合せ；を含む胆汁酸である、キットである。

キットは、色原体を更に含んでいてもよい。キットは、例えば、活性測定時のｐＨが７．２以下となるように調整されている。キットにおいて、内容物は、複数の容器に分けて保存されていてもよい。

あるいは、本発明の態様は、試料中のヒト膵リパーゼ活性の測定方法であって、
１）少なくとも、下記ｉ）に示された条件下、ｉｉ）ジグリセリド及びｉｉｉ）コリパーゼと、試料とを、ｐＨ７．４以下で接触せしめる接触工程と、
なお上記ｉ）は、下記のａ）及び／又はｂ）を表す：
ａ）グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選ばれた１種又は２種以上の抱合型胆汁酸（ａ型胆汁酸）を含有し、且つヒト膵リパーゼ活性測定における見かけの至適ｐＨが測定可能であり、その見かけ至適ｐＨが７．７未満となる条件で接触工程時に存在すること。
ｂ）下記ｂ−１）に示される抱合型胆汁酸（ｂ−１型胆汁酸）と、下記ｂ−２）に示される非抱合型胆汁酸（ｂ−２型胆汁酸）と、が共に存在し、且つ全ての胆汁酸（その塩を含む）に対するｂ−１型胆汁酸の存在比率（モル比）が３０％以上７０％以下となる条件で、少なくとも接触工程測定時に存在すること。
ｂ−１）グリココール酸（ＧＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選ばれた１種又は２種以上のｂ−１型胆汁酸。
ｂ−２）デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選ばれた１種又は２種以上のｂ−２型胆汁酸。
２）試料中のヒト膵リパーゼ活性に対応して変化するシグナル量を検出する工程と、
を含む測定方法である。

例えば、ｉ）はａ）である。また、例えば、ａ）において、ａ型胆汁酸の添加割合は胆汁酸及び／又はその塩の総量に対して４０％以上である。あるいは、ｉ）はｂ）である。

例えば、ａ型胆汁酸は、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）である。あるいは、ａ型胆汁酸は、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）及びタウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）である。

例えば、ｉｉ）は非イオン界面活性剤との混合物である。非イオン界面活性剤は、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン２級アルコールエーテルである。

例えば、２）は、比色法である。

例えば、ｉ）の濃度がモル比でジグリセリドに対して１０倍以上である。

例えば、試料は、ｐＨ７．２以下で接触せしめる。

またあるいは、本発明の態様は、少なくとも、下記ｉ）、ｉｉ）ジグリセリド及びｉｉｉ）コリパーゼを含む試料中ヒトリパーゼ活性測定用組成物であって、活性測定時のｐＨが７．４以下となるよう調整した組成物である。
なお上記ｉ）は、下記のａ）及び／又はｂ）を示す。
ａ）グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選ばれた１種又は２種以上のａ型胆汁酸を含有し、かつ、膵リパーゼ活性測定における測定可能な見かけの至適ｐＨが７．７未満である胆汁酸。
ｂ）下記ｂ−１）に示されるｂ−１型胆汁酸と、下記ｂ−２）に示される、ｂ−２型胆汁酸がともに存在し、且つ全ての胆汁酸（その塩を含む）に対するｂ−１型胆汁酸の存在比率（モル比）が３０％以上７０％以下である胆汁酸。
ｂ−１）グリココール酸（ＧＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選ばれた１種又は２種以上のｂ−１型胆汁酸。
ｂ−２）デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選ばれた１種又は２種以上のｂ−２型胆汁酸。

例えば、組成物は色原体を含有する。また、例えば、組成物は、活性測定時のｐＨが７．２以下となるように調整されている。組成物が複数に分割されたキットであってもよい。

本発明により、ジグリセリドを基質に用いる、試料中のヒト膵リパーゼの活性測定方法において、リポプロテインリパーゼ及び肝性リパーゼ等の非膵リパーゼの影響を軽減し、再現性の良い測定方法を提供することができる。

実施例１に係る抱合型胆汁酸のナトリウム塩存在下のヒト膵リパーゼ活性のｐＨ依存性を示すグラフである。 実施例１の比較例に係る非抱合型胆汁酸のナトリウム塩存在下のヒト膵リパーゼ活性のｐＨ依存性を示すグラフである。 実施例２に係るｂ−１型胆汁酸とｂ−２型胆汁酸のナトリウム塩存在下のヒト膵リパーゼ活性のｐＨ依存性を示すグラフである。 実施例２に係るａ−１型胆汁酸の存在下、ｂ−１型胆汁酸を添加した場合のヒト膵リパーゼ活性のｐＨ依存性を示すグラフである。 実施例３に係るタウロデオキシコール酸のナトリウム塩（ＮａＴＤＣＡ）とデオキシコール酸のナトリウム塩（ＮａＤＣＡ）の混合比率（モル比）を変化させた場合のヒト膵リパーゼ活性のｐＨ依存性を示すグラフである。 実施例３に係るＮａＴＤＣＡとＮａＤＣＡの混合比率とヒト膵リパーゼの活性ｐＨとの関係を示すグラフである。 実施例４に係るグリココール酸のナトリウム塩（ＮａＧＣＡ）とデオキシコール酸のナトリウム塩（ＮａＤＣＡ）の混合比率（モル比）を変化させた場合の膵リパーゼ活性のｐＨ依存性を示すグラフである。 実施例４に係るＮａＧＣＡとＮａＤＣＡの混合比率とヒト膵リパーゼの活性ｐＨとの関係を示すグラフである。 実施例５に係るヒト膵リパーゼ活性の測定値と、「リキテック リパーゼカラーＩＩ」によるヒト膵リパーゼ活性の測定値と、の相関を示すグラフである。 実施例８に係る結果を示す表である。 実施例９に係る結果を示す表である。 実施例１０に係る結果を示す表である。 実施例１２に係るＮａＧＤＣＡ使用時のヘパリン投与の有無による検体中のヒト膵リパーゼ活性のｐＨ依存性を示すグラフである。 実施例１２に係るＮａＧＣＡ／ＮａＤＣＡ使用時のヘパリン投与の有無による検体中のリパーゼ活性のｐＨ依存性を示すグラフである。 実施例１２の比較対照例に係るＮａＤＣＡ使用時のヘパリン投与の有無による検体中のヒト膵リパーゼ活性のｐＨ依存性を示すグラフである。 実施例１３に係る胆汁酸とジグリセリドの比（モル比）と、ヒト膵リパーゼ活性と、の関係図である。 実施例１６の比較対照例に係るヒト膵リパーゼ活性の測定値と、「リキテック リパーゼカラーＩＩ」によるヒト膵リパーゼ活性の測定値と、の相関図である。 実施例１６−３に係るヒト膵リパーゼ活性の測定値と、「リキテック リパーゼカラーＩＩ」によるヒト膵リパーゼ活性の測定値と、の相関図である。 実施例１９に係る非抱合胆汁酸とそのナトリウム塩の違いが、ヒト膵リパーゼ活性のｐＨ依存性へ影響しないことを示すグラフである。

以下に本発明の実施の形態を説明する。ただし、以下の実施の形態が本発明を限定するものであると理解するべきではない。本開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。

実施の形態に係る試料中のヒト膵リパーゼ活性の測定方法は、１）ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨを７．７未満、好ましくは７．４以下にする胆汁酸、ジグリセリド、及びコリパーゼと、試料とを、ｐＨ７．４以下で接触せしめる接触工程と、２）試料中のヒト膵リパーゼ活性に応じて変化するシグナル量を検出する検出工程と、を含む方法である。

ここで、ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨを７．７未満、好ましくは７．４以下にする胆汁酸は、ａ）グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上の抱合型胆汁酸であるａ型胆汁酸を含む胆汁酸である。

あるいは、ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨを７．７未満、好ましくは７．４以下にする胆汁酸は、ｂ）グリココール酸（ＧＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上の抱合型胆汁酸であるｂ−１型胆汁酸と、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上の非抱合型胆汁酸であるｂ−２型胆汁酸と、の組合せを含む胆汁酸である。

またあるいは、ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨを７．７未満、好ましくは７．４以下にする胆汁酸は、ａ型胆汁酸と、ｂ−１型胆汁酸及びｂ−２型胆汁酸の組合せと、を含む胆汁酸である。

ヒト膵リパーゼ活性の測定対象となる試料としては、ヒト膵リパーゼを含む試料であればいずれも用いることができるが、ヒト血液が好ましく、ヒト血清がより好ましい。

ａ型胆汁酸は、好ましくは、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上である。あるいは、ａ型胆汁酸は、好ましくは、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上である。

またあるいは、ａ型胆汁酸は、好ましくは、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上である。さらにあるいは、ａ型胆汁酸は、好ましくは、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上である。

ａ型胆汁酸は、より好ましくは、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上である。したがって、より好ましいａ型胆汁酸としては、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）又はその塩と、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）又はその塩との組み合わせ；グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）又はその塩；タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）又はその塩；が挙げられる。ａ型胆汁酸は、より更に好ましくは、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）及びその塩から選択される１種又は２種、並びにタウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）及びその塩から選択される１種又は２種である。

ａ型胆汁酸は、他の胆汁酸と併用してもよい。この場合、ａ型胆汁酸の存在比率（モル比）が、胆汁酸及び／又はその塩の総量に対して４０％以上であることが好ましい。ａ型胆汁酸の存在比率（モル比）が４０％を下回ると、ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨを酸性側に移動させる効果が減少する傾向にある。

ｂ−１型胆汁酸及びｂ−２型胆汁酸の組合せを用いる場合、全ての胆汁酸（その塩を含む）に対するｂ−１型胆汁酸の存在比率（モル比）が、３０％以上７０％以下であることが好ましい。ｂ−１型胆汁酸の存在比率（モル比）が３０％を下回ると、コリパーゼ添加による膵リパーゼの活性化率が低下する傾向にあり、また、７０％を越えると、活性測定の感度が低下する傾向にある。

試料中のヒト膵リパーゼ活性を測定する際、反応液における胆汁酸の総量は、例えば、８ｍｍｏｌ／Ｌ以上である。また、それらの塩を含む全ての胆汁酸の濃度は、ジグリセリド濃度に対して、モル比で１０倍以上２０倍以下であることが好ましく、より好ましくは１２倍以上２０倍以下である。１０倍未満であると、リパーゼ活性の強度が不足する傾向にある。２０倍を超えると、一定濃度のジグリセリドに対し、総胆汁酸塩濃度と感度との関係が飽和曲線を示すので、感度が徐々に低下する傾向にある。ａ型胆汁酸、ｂ−１型胆汁酸、及びｂ−２型胆汁酸は、例えばシグマ−アルドリッチ社等から入手可能である。なお上記ジグリセリドの濃度は、後述されている濃度が好ましい。

リパーゼ活性測定時のｐＨは７．４以下であり、好ましくは７．２以下である。ｐＨが７．４を超えると、非膵リパーゼの影響を受けやすくなる傾向にある。またｐＨは、好ましくは６．０以上である。ｐＨが６．０未満であると、十分なリパーゼ活性の強度が得られない傾向にある。ｐＨは、より好ましくは、６．０以上７．２以下である。

ジグリセリドにおける高級脂肪酸残基としては、炭素数１２以上の高級脂肪酸であればよい。また、これらの高級脂肪酸は、１種類だけでもよく２種類の異なる高級脂肪酸の組み合わせであってもよい。例えばラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、及びアラキジン酸等の飽和高級脂肪酸や、パルミトオレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、及びアラキドン酸等の不飽和高級脂肪酸が、ジグリセリドを基質として調製した際の溶液の澄明度の高さから、好ましく用いられる。

好ましい脂肪酸のジグリセリドとしては、１，２−ジオレイルグリセロール、１−パルミトイル−２−オレイルグリセロール、並びに卵黄由来精製レシチン又は大豆由来精製レシチンに由来するジグリセリド等を挙げることができるが、これらに限定されない。

ジグリセリド基質には、市販品を使用可能である。また、例えば、１，２−ジオレイルグリセリルコリン、１−パルミトイル−２−オレイルグリセリルコリン、卵黄由来精製レシチン、又は大豆由来精製レシチン等のリン脂質を予め調製し、これらのリン脂質にホスフォリパーゼＣを作用してジグリセリド基質を得てもよい。あるいは、１，２−ジグリセリドを、非イオン界面活性剤存在下でアルカリ処理を施して一部１，３−ジグリセリドに変換させたジグリセリド（１、２−ジグリセリドと１，３−ジグリセリドの混合物）も、ヒト膵リパーゼ反応の基質として用いることができる。

ヒト膵リパーゼ反応に最適なジグリセリドの濃度は、好ましくは０．３５〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であり、より好ましくは０．５〜１．５ｍｍｏｌ／Ｌであるが、これらに限定されない。

接触工程においては、ジグリセリドと共に非イオン性界面活性剤が存在すると好ましい。非イオン性界面活性剤の具体例としては、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）高級アルコールエーテル、ＰＯＥ第２級アルコールエトキシレート、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル、ＰＯＥアルキルエーテル、ＰＯＥ脂肪酸エステル、及びＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル等が挙げられるが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤は、好ましくは、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル系非イオン性界面活性剤、又はＰＯＥアルキルエーテル系非イオン性界面活性剤である。ＰＯＥアルキルフェニルエーテル系非イオン性界面活性剤の具体例としては、ＰＯＥノニルフェニルエーテルが挙げられる。また、ＰＯＥアルキルエーテル系非イオン性界面活性剤の具体例としては、ＰＯＥトリデシルエーテルが挙げられる。

非イオン性界面活性剤の使用濃度は特に限定されないが、膵由来リパーゼ活性を好適に発現させ且つ阻害しない濃度範囲、すなわちジグリセリド基質に対してモル比で１．１〜２．５倍の範囲で使用するのが好ましく、１．２〜２．０倍がより好ましい。非イオン性界面活性剤の濃度が、ジグリセリド基質に対してモル比で２．５倍を超えると、ヒト膵リパーゼの活性が低下するとともに、非膵リパーゼに対する活性が上昇する傾向にある（例えば、特許文献３参照。）。

ジグリセリド基質と、非イオン界面活性剤と、は、両者が混合されたジグリセリド溶液として用意されてもよい。ジグリセリド溶液は、例えば、ジグリセリドに非イオン性界面活性剤を含有する緩衝液を加え、３５℃〜４６℃、好ましくは３７℃〜４４℃で１時間から７時間、好ましくは１．５から４時間撹拌するか、もしくは上記温度で３０分程度超音波処理をすることで得られる。ただし、ジグリセリド溶液を得る方法は、これらに限定されない。ジグリセリドの溶解に用いる緩衝液としては、ｐＨ５〜９．５の範囲で緩衝能のある緩衝液を適宜選択すればよい。

コリパーゼの具体例としては、ブタ膵臓由来コリパーゼ等が挙げられるが、これに限定されない。コリパーゼの濃度は、一般的にリパーゼ酵素活性に対して飽和曲線を示し、ある濃度以上でリパーゼ活性は一定に達することが知られている。したがって、ヒト膵リパーゼの活性測定におけるコリパーゼの適当な濃度は、実験的に容易に決定することができる。例えば、旭化成ファーマ製のコリパーゼを用いる場合、コリパーゼの濃度は、例えば８〜２５０Ｕ／Ｌであり、好ましくは１０〜１５０Ｕ／Ｌであり、更に好ましくは１０〜１２０Ｕ／Ｌであるが、これらに限定されない。

接触工程において、ｐＨを７．４以下に保つためには緩衝液を使用することが好ましい。ただし、これに限定されず、塩酸等の酸、あるいは水酸化ナトリウム等の塩基を用いてｐＨを調整してもよい。緩衝液を使用する場合は、ｐＨ７．４以下で緩衝能のある緩衝液、例えば、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＢＥＳ等のグッドの緩衝液を使用することができる。

実施の形態に係る試料中のヒト膵リパーゼ活性の測定方法において、物質を混合する順番等の手順に特に限定はないが、例えば実用性の面から、物質を２種類の構成試薬に分け、これらを組み合わせて反応を起こさせてもよい。この場合、２種類の試薬のｐＨが同一である必要はなく、リパーゼ活性測定時、すなわち２種類の試薬を混合する時のｐＨが７．４以下となるようにすればよい。緩衝液の濃度は特に限定されないが、１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上２５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲が好ましい。

また、この場合、例えば、１）ジグリセリドを一の試薬に含有させ、他方の試薬に胆汁酸塩を含有させるか、あるいは２）ジグリセリドを一の試薬に含有させ、他方の試薬にコリパーゼを含有させればよい。１）の場合、コリパーゼはどちらに加えても、また両方の試薬に分配して加えてもよく、２）の場合、胆汁酸塩はどちらに加えても、また両方の試薬に分配して添加してもよい。

検出工程において用いられる方法としては、例えば、比色法とそれ以外の方法があり、ヒト膵リパーゼ反応により生じる生成物を適宜、既知の反応系を組み合わせて測定すればよい。例えば、比色法としてはジグリセリド基質から生成したモノグリセリドを、モノグリセリドリパーゼを用いて脂肪酸とグリセロールに変換させる場合、遊離したグリセロールを、グリセロールキナーゼ、グリセロ−３−リン酸オキシダーゼ、及びペルオキシダーゼを用いて最終的に生成した過酸化水素を４−アミノアンチピリンなどのカップラーの存在下に水素供与体と組み合わせ、発色した色素を分光学的に検出する方法がある。また、比色法以外の方法としては、遊離したグリセロールを、グリセロールキナーゼ、ＡＤＰ−ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと組み合わせ、還元型ＮＡＤ（Ｐ）に基づく吸光度変化を３４０ｎｍにて検出する紫外線（ＵＶ）法などがある。したがって、検出工程において用いられる方法は、これらの比色法や、それ以外の方法から適宜選択すればよい。

比色法で用いられるモノグリセリドリパーゼとしては、ジグリセリドに作用せずモノグリセリドに特異的に作用する酵素であれば特に起源は問わないが、安定供給の点で、微生物由来酵素が好ましく、バチルス属由来酵素がより好ましい。リパーゼ反応における共役酵素として使用する濃度の下限値としては、０．５Ｕ／ｍｌ以上が好ましく、また、上限値としては、５Ｕ／ｍｌ以下であることが好ましいが、これに限定されない。

グリセロキナーゼは特にその起源は問わないが、安定性に優れた酵素の使用が好ましく、フラボバクテリウム属由来酵素がより好ましい。グリセロ−３−リン酸オキシダーゼは特にその起源は問わないが、安定供給の点で微生物由来が好ましく、乳酸菌由来酵素がより好ましい。

グリセロ−３−リン酸オキシダーゼ反応で生成される過酸化水素は、ペルオキシダーゼと、トリンダー試薬の色原体と、カップラーと、の酸化縮合により色素を生成する。ペルオキシダーゼはその起源は特に問わないが、既に安定供給されている西洋わさび大根由来の酵素が好ましい。また、水素供与体としては、フェノール誘導体、アニリン誘導体、及びトルイジン誘導体等が好ましい。水素供与体の具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、２，４−ジクロロフェノール、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−アニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン２ナトリウム（ＴＯＤＢ）（以上同仁化学研究所社製）等が挙げられる。

過酸化水素の存在は、パーオキシダーゼ存在下ロイコ型試薬の発色により確認することができる。この試薬の具体例としては、ｏ−ジアニシジン、ｏ−トリジン、３，３’−ジアミノベンジジン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン；以上同仁化学研究所社製、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン（ＤＡ６４）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＤＡ６７）；以上和光純薬社製等が挙げられる。更に、過酸化水素の検出及び定量は、分光学的な方法のみならず、例えば蛍光法、化学発光法、及び電極法等でも実施することができる。

また、ＵＶ法で用いられるグリセロールキナーゼの生成物のひとつであるＡＤＰは、グルコース存在下ＡＤＰ依存性へキソキナーゼ（ＡＤＰ−ＨＫ）によりグルコース−６−リン酸に変換できる。ＡＤＰ−ＨＫは特にその起源は問わないが、安定供給の点で微生物由来が好ましく、保存安定性に優れたパイロコッカス属やサーモコッカス属等の高度好温菌由来酵素がより好ましい。ＡＤＰ−ＨＫの基質であるグルコースは２〜５０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で使用することができる。ＡＤＰ−ＨＫによる生成物であるグルコース−６−リン酸は酸化型ＮＡＤ又はＮＡＤＰ存在下でグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼによって還元型ＮＡＤ又はＮＡＤＰに変換できる。グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは特にその起源は問わないが、安定供給の点で、微生物由来酵素が好ましい。なかでもロイコノストック属由来酵素が好ましい。

例えば、試料としての血清等の生体成分中には、遊離のグリセロールが存在することがある。そのため、比色法であれ、ＵＶ法であれ、遊離のグリセロールによって、膵リパーゼ活性の測定に正誤差が生じうる。よって、試料中の遊離のグリセロールを、膵リパーゼ反応に先立ち消去することが好ましい。

比色法を用いる場合、グリセロキナーゼ、グリセロ−３−リン酸オキシダーゼ、カタラーゼあるいはパーオキシダーゼとフェノール誘導体、アニリン誘導体、トルイジン誘導体等のトリンダー試薬の色原体とを含有する第１の比色法試薬を用意し、第１の比色法試薬に被験液を添加し、予め加温することで、被験液中に遊離していたグリセロールを消去することができるが、この方法に限定されない。トリンダー型試薬の色原体としては、先に挙げた色原体が挙げられるが、これらに限定されない。また、比色法を用いる場合、４アミノアンチピリン若しくは３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等のカップラーからなる成分で構成される第２の比色法試薬を用意する。ここで、第１の比色法試薬でカタラーゼを使用する場合には、窒化ナトリウムなどのカタラーゼ阻害剤を第２の比色法試薬に含有させればよい。第１の比色法試薬と、第２の比色法試薬と、が混合されると同時に、グリセロ−３−リン酸オキシダーゼ反応で生成される過酸化水素は、トリンダー試薬の色原体と、カップラーと、の酸化縮合により色素を生成するので、この色素の増加速度を分光学的に測定することができる。

ＵＶ法を用いる場合、遊離グリセロールの影響を回避する方法として、予め、グリセロールキナーゼ、ＡＤＰ−ヘキソキナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ及びグルコース、ＮＡＤ（Ｐ）を含有させた第１のＵＶ法試薬を用意し、第１のＵＶ法試薬に被験液を添加し、遊離グリセロールを還元型ＮＡＤ（Ｐ）に変換させておけばよい。また、グリセロールに作用する酸化酵素（グリセロールオキシダーゼ）を第１のＵＶ法試薬に添加し、遊離のグリセロールをアルデヒドに変換することで、遊離のグリセロールの影響を回避することができる。ただし、この場合、第１のＵＶ法試薬でグリセロールキナーゼ反応が起こらないように、グリセロールキナーゼ及び／又はＡＴＰを第２のＵＶ法試薬に添加する。グリセロールオキシダーゼとしては、例えばアスペルギルス属、ノイロスポラ属、ペニシリウム属由来のグリセロールオキシダーゼ等の公知のグリセロールオキシダーゼを使用することができるが、これらに限定されない（例えば、非特許文献５参照。）。

ＵＶ法で、還元型ＮＡＤ（Ｐ）に基づく吸光度変化を測定する場合、ある種の検体においては試薬との混合によって濁りが生じ、その濁りが測定波長である３４０ｎｍの吸光度に影響を与えることがある。このような場合、検体毎に、検体ブランクを測定すれば濁りの影響を回避することができる。測定感度を上げるためには、分子吸光係数の高い検出系を用いることが好ましい。この場合、還元型ＮＡＤ（Ｐ）の分子吸光係数に比べ、より大きな分子吸光係数を有する色素、例えばチオＮＡＤ（Ｐ）などを選択することで、還元型ＮＡＤ（Ｐ）による検出に優る感度を得ることができる。

検出工程において用いられる方法は、比色法及びＵＶ法に限られず、その他の既存の方法やそれらを組み合わせた方法を用いてもよく、測定の煩雑さ、測定精度、測定感度などの観点から、実用的なものを適宜選択すればよい。

以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の例によって限定されるものではない。

（実施例１）胆汁酸の種類と膵リパーゼの活性ｐＨ
・ジグリセリド原液の調製
溶解後の濃度が９．３２ｍｍｏｌ／Ｌになるよう１，２−ジオレオイルグリセロール（ＤＯＤＧ）（日本精化製）を秤量しこれに１．６６ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ（同仁化学）を含有する１％ポリオキシエチレン（１０）ノニルフェニルエーテル（ＮＰＥ）（和光純薬工業株式会社）を加え、３７度２時間撹拌し溶解させ、その後氷中に２時間以上静置した。この溶液を基質原液として用いた。

・反応液の調製
上記ジグリセリド原液を用い、下記の組成で「基質ストック液」を調製した。
５．６ ｍｏｌ／Ｌ １，２−ジオレオイルグリセロール
０．６％ ＮＰＥ
１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ
３．２ ｍｍｏｌ／Ｌ 硫酸マグネシウム

下記の組成で「第１の反応液（Ｒ−１）」を調製した。
７５ｍｍｏｌ／Ｌ 緩衝液
４ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化カルシウム
後述する濃度 胆汁酸塩
３ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ
３ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＰ
３０００Ｕ／Ｌ グリセロールキナーゼ（ＧＫＺ） （旭化成ファーマ製）
７５００Ｕ／Ｌ ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（ＡＤＰ−ＨＫＰＩＩ）（旭化成ファーマ製）
３０００Ｕ／Ｌ グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）（東洋紡製）
３ｍｍｏｌ／Ｌ グルコース
３ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化マグネシウム

下記の組成で「第２の反応液（Ｒ−２）」を調製した。
５０ｍｍｏｌ／Ｌ 緩衝液
１０，０００Ｕ／Ｌ モノグリセライドリパーゼ（ＭＧＬＰＩＩ）（旭化成ファーマ）
６０，０００Ｕ／Ｌ コリパーゼ（ＣｏＬＰ）（旭化成ファーマ）

下記の組成で「検体ブランク用第２の反応液（Ｒ−２）」を調製した。
５０ｍｍｏｌ／Ｌ 緩衝液
６０，０００Ｕ／Ｌ コリパーゼ（ＣｏＬＰ）（旭化成ファーマ）

・測定操作
基質ストック液と、Ｒ−１と、を１対２の比率で混合したものを第一試薬として用いた。第二試薬はＲ−２をそのまま用いた。検体としては、プール血清あるいは管理試料(膵リパーゼを含むコントロール)を用いた。検体量、第一試薬、第二試薬の比率は、検体量：第一試薬：第二試薬＝０．０１ｍｌ：０．１８ｍｌ：０．０６ｍｌとした。第一試薬に検体を加え３７度５分間加温後、第二試薬を加え３７度にて第二試薬添加後の３分後から４分後までの還元型ＮＡＤＰに基づく３４０ｎｍにおける吸光度変化速度を求め、還元型ＮＡＤＰの分子吸光係数６３００Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍを用いてリパーゼ活性を算出した。また、検体ブランクとして、検体の変わりに生理的食塩水を用い、第二試薬からＭＧＬＰＩＩを除いた検体ブランク用試薬を用いて吸光度を測定し、二つの測定値の差を酵素活性値とした。測定には日立自動分析装置Ｈ７１７０型もしくはＨ７０８０を用いた。

・測定
Ｒ−１に添加する抱合型胆汁酸として、それぞれ４０ｍｍｏｌ／Ｌのタウロデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＴＤＣＡ）、グリコデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＧＤＣＡと）、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＧＣＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＴＣＤＣＡ）、グリココール酸ナトリウム（ＮａＧＣＡ）タウロコール酸ナトリウム（ＮａＴＣＡ）及びタウロウルソデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＴＵＤＣＡ）を選択し、Ｒ−１のｐＨをＢＥＳ（同仁化学製）を用いて、それぞれ６．８、７．０、７．２、７．４、７．８、８．０に調整し、ヒト膵リパーゼ活性を測定した。Ｒ−２のｐＨは、それぞれＲ−１のｐＨに合わせた。

プール血清におけるヒト膵リパーゼ活性の測定結果を図１に示す。ＮａＴＤＣＡを用いた場合の活性の最大値を与えるｐＨは７付近であり、ＮａＧＤＣＡを用いた場合の活性の最大値を与えるｐＨは７．２〜７．４付近であり、ＮａＧＣＤＣＡ又はＮａＴＣＤＣＡを用いた場合の活性の最大値を与えるｐＨは６．８未満であった。よって、いずれの場合も、ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨ（見かけの至適ｐＨ）は７．５未満であった。ＮａＧＣＡ、ＮａＴＣＡ及びＮａＴＵＤＣＡについては、活性化の程度が極めて低く検出限界以下であった。

比較例として、非抱合型胆汁酸であるコール酸ナトリウム（ＮａＣＡ）、デオキシコール酸ナトリウム（ＮａＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＣＤＣＡ）及びウルソデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＵＤＣＡ）につき、種々のｐＨで同様の操作を行った。なお、非抱合型胆汁酸の濃度はＲ−１で各々２４ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにした。また、ｐＨ７．２，７．６，７．８，８．０はＢＥＳを、ｐＨ８．２，８．５はＢｉｃｉｎｅを用いた。

比較例に係るプール血清におけるヒト膵リパーゼ活性の測定結果を図２に示す。ＮａＤＣＡを用いた場合の活性の最大値を与えるｐＨ（見かけの至適ｐＨ）は８．２付近であり、ＮａＣＤＣＡを用いた場合の活性の最大値を与えるｐＨ（見かけの至適ｐＨ）は７．７付近であった。ＮａＵＤＣＡについてはＲ−１反応液に濁りが生じたため測定できなかった。また、ＮａＣＡについては、ＮａＤＣＡに比べてわずかなシグナルしか得られなかった。

（実施例２）ＮａＴＵＤＣＡ、ＮａＧＣＡ、ＮａＴＣＡの組合せ効果
・反応液の調製
下記の組成で「基質ストック液」を調製した。
５．６ ｍｏｌ／Ｌ １，２−ジオレオイルグリセロール
０．６％ ＮＰＥ
１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ
３．２ ｍｍｏｌ／Ｌ 硫酸マグネシウム

下記の組成で「第１の反応液（Ｒ−１）」を調製した。
７５ｍｍｏｌ／Ｌ 緩衝液
４ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化カルシウム
後述する濃度 胆汁酸塩
４ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ
３ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＡＤＰ
３０００Ｕ／Ｌ ＧＫＺ
８０００Ｕ／Ｌ ＡＤＰ−ＨＫＰＩＩ
３０００Ｕ／Ｌ Ｇ６ＰＤ
３ｍｍｏｌ／Ｌ グルコース
３ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化マグネシウム

下記の組成で「第２の反応液（Ｒ−２）」を調製した。
５０ｍｍｏｌ／Ｌ 緩衝液
１０，０００Ｕ／Ｌ ＭＧＬＰＩＩ
６０，０００Ｕ／Ｌ ＣｏＬＰ

・測定操作
実施例１と同様、基質ストック液とＲ−１を１対２の比率で混合したものを第一試薬として用いた。その他は実施例１に準じた。

・測定
実施例１で、単独では十分なヒト膵リパーゼの活性化を示さなかった抱合型胆汁酸塩の中のＮａＧＣＡ、ＮａＴＣＡ及びＮａＴＵＤＣＡについて、それぞれ非抱合胆汁酸であるＮａＤＣＡと組み合わせた場合にヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨ（見かけの至適ｐＨ）を調べた。また、ＮａＴＣＡについては、抱合型胆汁酸であるＮａＴＤＣＡと組み合わせた場合にヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨ（見かけの至適ｐＨ）も調べた。なお、ｐＨ６．９，７．２，７．７はＢＥＳ緩衝液を、ｐＨ７．９５，８．２はＢｉｃｉｎｅ緩衝液を用いた。ＮａＧＣＡ／ＮａＤＣＡ、ＮａＴＣＡ／ＮａＤＣＡ、ＮａＴＵＤＣＡ／ＮａＤＣＡ及びＮａＴＣＡ／ＮａＴＤＣＡそれぞれの組合せについて各々の胆汁酸の濃度はＲ−１中で２０ｍｍｏｌ／Ｌとした。ＮａＴＣＡとＮａＴＤＣＡの組合せに対しては、対照として４０ｍｍｏｌ／ＬＮａＴＤＣＡを置いた。

図３に、ＮａＧＣＡ／ＮａＤＣＡ、ＮａＴＣＡ／ＮａＤＣＡ及びＮａＴＵＤＣＡ／ＮａＤＣＡの組合せの結果を示す。実施例１の比較例で示したＮａＤＣＡ単独の至適ｐＨが８．２付近であったのに対して、ＮａＧＣＡとの組み合わせではヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨ（見かけの至適ｐＨ）が７．２付近に、ＮａＴＣＡでは６．９付近に、またＮａＴＵＤＣＡでは７．４付近に変化していた。また、図４に示すように、実施例１の結果と同様、至適ｐＨが７．１付近であったＮａＴＤＣＡの場合、ＴＣＡと併用することによりヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨ（見かけの至適ｐＨ）は更に酸性側へ移動した。これらの結果から、単独ではヒト膵リパーゼの活性化が不十分であったＮａＧＣＡ、ＮａＴＣＡ及びＮａＴＵＤＣＡともに、特定の胆汁酸と併用して用いれば、ヒト膵リパーゼの活性化が十分に達成されると共に、ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨを酸性側へ移動させる効果が認められることがわかった。

（実施例３）ＮａＴＤＣＡとＮａＤＣＡの混合比率と活性ｐＨ
試薬組成、測定操作は実施例２と同じとした。単独でヒト膵リパーゼの至適ｐＨを７付近にする抱合胆汁酸ＮａＴＤＣＡと、単独でヒト膵リパーゼの至適ｐＨを８．２付近にする非抱合型胆汁酸ＮａＤＣＡについて、その混合比率（モル比）を変えてヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨがどのようになるかプール血清を用いて調べた。ｐＨ６．９，７．１，７．５５，７．７５はＢＥＳ緩衝液を、ｐＨ７．９５，８．１５，８．４はＢｉｃｉｎｅ緩衝液を用いた。

図５に示すように、ＮａＴＤＣＡの含量が６７％の時、ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨは７．５５付近であり、３３％の時、ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨは８付近であった。また、この結果を基に、横軸に添加した総胆汁酸に対するＮａＴＤＣＡの割合を、縦軸にヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨをプロットすると、図６に示すように、ほぼ直線的になり、胆汁酸の混合比によりヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨが予測できることが示された。

（実施例４）ＮａＧＣＡとＮａＤＣＡの混合比率と活性ｐＨ
試薬組成、測定操作は実施例２と同じとした。単独では十分なヒト膵リパーゼの活性化を示さなかった抱合型胆汁酸の中からＮａＧＣＡを選択し、非抱合型胆汁酸で、単独でヒト膵リパーゼの至適ｐＨを８．２付近にするＮａＤＣＡとの混合比率（モル比）ＮａＤＣＡ／ＮａＧＣＡを終濃度で２４ｍｍｏｌ／Ｌ／０、１６ｍｍｏｌ／Ｌ／８ｍｍｏｌ／Ｌ、１２ｍｍｏｌ／Ｌ／１２ｍｍｏｌ／Ｌ、８ｍｍｏｌ／Ｌ／１６ｍｍｏｌ／Ｌ、６ｍｍｏｌ／Ｌ／１８ｍｍｏｌ／Ｌと変化させ、ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨがどう変動するか管理試料（膵リパーゼを含むコントロール）を用いて調べた。ｐＨ７．２，７．６はＢＥＳ緩衝液を、ｐＨ８．０，８．５はＢｉｃｉｎｅ緩衝液を用いた。

結果を図７に示す。ＮａＧＣＡ量の増加と共に、ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨは酸性側へ移行したが、同時に感度も低下した。この結果を基に、図８に示すように、横軸に添加した総胆汁酸に対するＮａＧＣＡの割合を、縦軸にヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨをプロットするとほぼ直線的になり、胆汁酸の混合比によりヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨが予測できることが示された。

（実施例５）抱合型胆汁酸単独使用と非膵リパーゼ影響度の軽減
試薬組成、測定操作は実施例２と同じとした。

・測定
ヘパリン投与によって血中に出現するリポプロテインリパーゼや肝性リパーゼ等の非膵リパーゼの影響を受けないとされている、１，２−Ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロール−３−グルタル酸−（６−メチルレゾルフィン）エステル（ＤＧＧＲ）を用いたレゾルフィン比色法市販試薬であるロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製「リキテック リパーゼカラーＩＩ」を本実施例の効果を確認するために用いた。「リキテック リパーゼカラーＩＩ」については添付文書に従い、また専用キャリブレーターを用い、酵素活性を算出した。比較対照例として、胆汁酸がＮａＤＣＡ（Ｒ−１中の濃度４０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用い反応液のｐＨが８．１５（Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液）、本実施例の試薬組成として（１）Ｒ−１、Ｒ−２の緩衝液がＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、胆汁酸としてＮａＴＤＣＡ、（２）Ｒ−１、Ｒ−２の緩衝液がＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）で胆汁酸がＮａＧＤＣＡ、（３）Ｒ−１、Ｒ−２の緩衝液がＢＥＳ（ｐＨ７．０）で胆汁酸がＮａＧＣＤＣＡである試薬をそれぞれ調製した。本実施例の胆汁酸濃度は、比較対照例と同じとした。

試料はコントロール、ヘパリン非投与検体（通常検体）、ヘパリン投与検体を用いた。結果を表１に示す。まず、ＮａＴＤＣＡを用いた場合、コントロール及び通常検体の測定値が比較対照例に比べて、７７〜１１２％であったのに対し、ヘパリン投与検体では２８〜５２％に、ＮａＧＤＣＡの場合はそれぞれ７６〜１２１％と、３２〜５５％に、ＮａＧＣＤＣＡの場合はそれぞれ７０〜９８％と２６〜４８％に、いずれの胆汁酸についても比較対照例に比べてヘパリン投与検体の活性が著しく低下し、主にリポプロテインリパーゼや肝性リパーゼからなる非膵リパーゼの影響が軽減されていることが示された。図９にリキテック リパーゼカラーＩＩによる結果と、ＮａＴＤＣＡを胆汁酸として添加した本実施例による結果と、の相関を示す。ヘパリン投与検体はヘパリン非投与検体（通常検体）とほぼ同一線上に散布しており、本実施例の効果が確認された。

（実施例６）胆汁酸組合せと非膵リパーゼ影響度の軽減
試薬組成は実施例２と同じとした。比較対照例として、胆汁酸にＮａＤＣＡ（Ｒ−１中の濃度４０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用い、反応液のｐＨを８．１５（Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液）として、ヘパリン投与検体を測定した。また、本実施例の抱合型胆汁酸として、単独では充分な活性化効果の認められなかったＮａＧＣＡ、ＮａＴＣＡ及びＮａＴＵＤＣＡをそれぞれ非抱合型胆汁酸としてＮａＤＣＡ又はＮａＣＤＣＡと組み合わせて、また単独でも充分な活性化を示すＮａＧＣＤＣＡ、ＮａＴＣＤＣＡを用いてヘパリン投与検体を測定した（ＢＥＳ（ｐＨ７．１）、胆汁酸はＲ−１中で４０ｍｍｏｌ／Ｌ（組合せの場合は等量混合））。

なお、ヒト膵組換えリパーゼが含まれているＣＲＭ−００１ｂを蒸留水の代わりにプール血清で溶解したものをキャリブレーターに用いて、リパーゼ活性を算出した。その結果、表２に示すように、比較対照例に比べて、本実施例では、ヘパリン投与検体の活性値が激減していた。したがって、本実施例によれば、非膵リパーゼの影響を軽減可能なことが示された。

（実施例７）非膵リパーゼの影響の定量評価（ｐＨ依存性）：ＮａＴＤＣＡ
本実施例及び参考例の胆汁酸として、ＮａＴＤＣＡを選択し、反応液のｐＨを６．２〜７．６の範囲で変化させたときのｐＨ依存性について調べた。なお、ｐＨが７．６の場合を参考例とした。ｐＨ６．２，６．４はＭＥＳ緩衝液でその他はＢＥＳ緩衝液を用いた。試料は管理試料（膵リパーゼを含むコントロール）（６種）とヘパリン投与検体（９種）である。比較対照例として、胆汁酸がＮａＤＣＡ（Ｒ−１中の濃度４０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用い反応液のｐＨが８．１５（Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液）のものを用いた。また、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製「リキテック リパーゼカラーＩＩ」を本実施例の効果を確認するために用いた。「リキテック リパーゼカラーＩＩ」については添付文書に従い、また専用キャリブレーターを用い、酵素活性を算出した。結果を表３に示す。

次に、非膵リパーゼ活性の影響度を、リキテック試薬が非膵リパーゼの影響を受けないという前提で、以下のようにして求めた。まず、ヘパリン投与検体を除いた酵素活性の測定値につき、回帰式（独立変数Ｘ：リキテックによる酵素活性、従属変数Ｙ：比較対照例もしくは本実施例による酵素活性）を求めた。次に、各ヘパリン投与検体についてリキテックによる酵素活性の測定値を回帰式のＸに代入し、Ｙの値を理論値として算出した。その後、ヘパリン投与検体について、比較対照例もしくは本実施例による酵素活性の実測値をＹの理論値で除したものを相対％として算出した。結果を表４に示す。なお、影響度の許容範囲としては、「リキテック リパーゼカラーＩＩ」の添付文書の記載として、正確性が既知活性の±１５％以内、となっていることを参考に暫定的に±２０％以内とした。

結果を表４に示す。表４から明らかなように、ｐＨ７．４以下では、理論値に対して実測値は平均１２０．０％未満であり、許容範囲内であったのに対して、ｐＨ７．６では平均２１２．１％と、の２倍以上の値を示した。したがって、ｐＨ７．４以下であれば、非膵リパーゼの影響を軽減可能なことが示された。

（実施例８）非膵リパーゼの影響軽減効果の定量評価（ｐＨ７．１，７．４，７．６））：ＮａＧＤＣＡ／ＮａＤＣＡ
本実施例では抱合型胆汁酸として、ＮａＧＤＣＡを選択し、非抱合胆汁酸ＮａＤＣＡと組み合わせ（等量混合）て、反応液のｐＨを７．１、７．４、７．６と変化させたときのヘパリン投与検体の挙動を調べた。緩衝液にはＢＥＳ緩衝液を用いた。試料としては、管理試料（膵リパーゼを含むコントロール）（４種）、通常検体（１０種）、及びヘパリン投与検体（９種）を用いた。比較対照例では、胆汁酸としてＮａＤＣＡ（Ｒ−１中で３０ｍｍｏｌ／Ｌ）及びＮａＴＤＣＡ（同１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用い、反応液のｐＨを７．９５ （Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液）とした。また、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製「リキテック リパーゼカラーＩＩ」を本実施例の効果を確認するために用いた。「リキテック リパーゼカラーＩＩ」については添付文書に従い、また専用キャリブレーターを用い、酵素活性を算出した。その後、実施例７と同様に、ヘパリン投与検体について、比較対照例もしくは本実施例による酵素活性の実測値を理論値で除したものを相対％として算出した。非膵リパーゼ活性の影響度、及び影響度の許容範囲も、実施例７と同様とした。

結果を図１０に示す。図１０から明らかなように、ヘパリン投与検体につき、ｐＨ７．４、ｐＨ７．１では、理論値に対し実測値は平均１２０％以内であり、許容範囲内であった。これに対し、参考例としてｐＨ７．６では１９４．７％であり、比較対照例では１９８％と理論値のほぼ２倍の値を示した。したがって、ＮａＧＤＣＡとＮａＤＣＡを組合せて、ｐＨを７．４以下とすれば、非膵リパーゼの影響を軽減可能なことが示された。

（実施例９）胆汁酸組合せによる非膵リパーゼの影響軽減効果の定量評価
比較対照例として、胆汁酸にＮａＤＣＡとＮａＴＤＣＡ（Ｒ−１中の濃度でそれぞれ３０ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用い、反応液のｐＨが７．９５となるよう、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液を用いて、ヘパリン投与検体を測定した。また、本実施例として、抱合型胆汁酸にＮａＴＤＣＡ、ＮａＧＤＣＡ、ＮａＧＣＡ、ＮａＴＣＡを用い、非抱合型胆汁酸にＮａＤＣＡを用い、表６に示すように非抱合型と抱合型胆汁酸の組合せ、抱合型胆汁酸同士の組合せ、並びに抱合型胆汁酸２種類と非抱合型胆汁酸の組合せ各々につき、ヘパリン投与検体を測定した（ＢＥＳ（ｐＨ６．９）。胆汁酸はＲ−１中で計４０ｍｍｏｌ／Ｌ（２種類の場合は各２０ｍｍｏｌ／Ｌ、３種類の場合は各１３．３ｍｍｏｌ／Ｌ）とした。また、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製「リキテック リパーゼカラーＩＩ」を本実施例の効果を確認するために用いた。「リキテック リパーゼカラーＩＩ」については添付文書に従い、また専用キャリブレーターを用い、酵素活性を算出した。比較対照例、及び本実施例においては、還元型ＮＡＤＰの分子吸光係数６３００Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍを用いてリパーゼ活性を算出した。その後、実施例７と同様に、ヘパリン投与検体について、比較対照例もしくは本実施例による酵素活性の実測値を理論値で除したものを相対％として算出した。非膵リパーゼ活性の影響度、影響度の許容範囲も、実施例７と同様の方法により算出した。

その結果、図１１に示すように、比較対照例では、理論値に対し、ヘパリン投与検体４種の実測値は平均２０４．５％だったのに対し、本実施例では、いずれの組合せにおいても１００±１５％以内と許容範囲内であり、非膵リパーゼの影響が著しく軽減していた。

（実施例１０）界面活性剤の種類と非膵リパーゼの影響軽減効果の定量評価
実施例１に記載のジグリセリド原液の調製時に、界面活性剤としてポリオキシエチレン（１０）ノニルフェニルエーテル（ＮＰＥ）の代わりにポリオキシエチレントリデシルエーテル（アデカトール ＴＮ−１００）（アデカ）を用いてジグリセリド原液を調製し、ＮＰＥを用いて調製したものと比較した。なお、界面活性剤の濃度は同じとした。本実施例の抱合型胆汁酸としてＮａＧＤＣＡとＮａＴＤＣＡ（等量混合）を選択し、それぞれの界面活性剤につきｐＨ７．２の反応液とｐＨ７．４の反応液を調製した。また、比較対照例においては、胆汁酸としてＮａＤＣＡ（Ｒ−１中で３０ｍｍｏｌ／Ｌ）及びＮａＴＤＣＡ（同１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用い、反応液のｐＨが７．９５となるよう、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液を用いた。さらに、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製「リキテック リパーゼカラーＩＩ」を用い、実施例７と同様の方法で非膵リパーゼ活性の影響度を調べた。

ヘパリン投与検体のみの結果を図１２に示す。この結果から、２種の界面活性剤ともに、実測値は理論値の±１２０％以内であり、非膵リパーゼの影響を受けなかったのに対して、ＮＰＥを用いた比較対照例では１５０％、２１０％と非膵リパーゼの影響を受けた。

（実施例１１）ｐＨ７．５以上、以下の比較
比較対照例として、胆汁酸にＮａＤＣＡとＮａＴＤＣＡ（Ｒ−１中の濃度でそれぞれ３０ｍｍｏｌ／Ｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を用い、反応液のｐＨが７．９５となるよう、Ｂｉｃｉｎｅ緩衝液を用いた。また、抱合型胆汁酸としてＮａＧＣＤＣＡを選択し（Ｒ−１中で４０ｍｍｏｌ／Ｌ）、本実施例としてｐＨ７．０、参考例としてｐＨ７．９５について、２種類のヘパリン投与検体につき、その効果を調べた。まず、組換え膵ＬＰ添加血清でキャリブレーションを実施し、比較対照例のヘパリン投与検体の測定値が、ヒト膵リパーゼと非膵リパーゼを合計した活性を表しており、本実施例の測定値が、ヒト膵リパーゼのみの活性を表しているという前提で、非膵リパーゼの総リパーゼに対する混入率を算出した。

分子吸光係数から求めた比較対照例の測定値から、本実施例及び参考例について、それぞれのヘパリン投与検体を除いた場合の相関式を用い、ヒト膵リパーゼ活性の理論値Ｙを次のように計算した。なお、Ｘは比較対照例の測定値を代入する変数であり、ａは傾き、ｂは切片を表す。

膵リパーゼ活性（理論値）＝（１−非膵リパーゼの混入率） ｘ （ａＸ ＋ｂ）

結果を表５に示す。まず、ｐＨ７．０の本実施例に比べてｐＨ７．９５の参考例では、感度が約４０％程度に低下していた。更に、ヘパリン投与検体中の非膵リパーゼの至適ｐＨはｐＨ７．０よりｐＨ７．９５に近い為、酵素活性の測定値が膵リパーゼの理論値に対して、３１１．８％、４９２．８％と大きな値を示した。これに対してｐＨ７．０の本実施例においては、測定値が膵リパーゼの理論値に対して、９８．４％、９８．５％であり、非膵リパーゼの影響が大きく回避されていることが示された。

（実施例１２）膵リパーゼ、非膵リパーゼの活性ｐＨ比較
反応液のｐＨを７．４から８．４の間で変化させ、ヒトプール血清とヘパリン投与血清につき、リパーゼ活性を測定した。ｐＨ７．４，７．５５はＢＥＳ緩衝液を、その他のｐＨはＢｉｃｉｎｅ緩衝液を用いた。本実施例において、抱合型胆汁酸としてはＮａＧＤＣＡとＮａＧＣＡを（ＮａＧＣＡは非抱合型胆汁酸ＮａＤＣＡとの組み合わせ（等量、Ｒ−１中で計４０ｍｍｏｌ／Ｌ））用いた。また比較対照例において、ＮａＤＣＡ（Ｂｉｃｉｎｅ ｐＨ８．１５）を用いた。その結果を図１３、図１４、及び図１５に示す。図１５に示すように、比較対照例において、ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨは８．２付近であったのに対して、図１３及び図１４に示すように、本実施例においてはｐＨ７．４を少し下回る付近であった。一方、ヘパリン投与検体については、両方法において、いずれもｐＨの上昇と共に活性も上昇するという結果であった。この結果より、本実施例に係る胆汁酸は、ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨを酸性側へ移行させるものの、非膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨを変化させないことが示された。なお、実験にはそれぞれ異なるヘパリン投与検体を用いた。

（実施例１３）胆汁酸と基質の比率
本実施例に係る抱合型胆汁酸としてＮａＴＤＣＡを用い、ｐＨ７．２（ＢＥＳ緩衝液）において、胆汁酸濃度の影響を調べた。基質ジグリセリドには１，２−ジオレオイルグリセロールを用い、基質を溶解させるための非イオン界面活性剤としてポリオキシエチレン（１０）ノニルフェニルエーテル（和光純薬工業）をジグリセリドに対するモル比として１．７４になるようにして用いた。また、基質濃度としては終濃度で１．４０ｍｍｏｌ／Ｌ及び１．６３ｍｍｏｌ／Ｌに設定した。結果を図１６に示す。リパーゼ活性が最大になる胆汁酸の基質に対する比率は、基質濃度が１．４０ｍｍｏｌ／Ｌの時は約１７、また１．６３ｍｍｏｌ／Ｌの時は約１５であった。また比率が２０を超えると感度は低下する傾向にあった。

（実施例１４）市販カラー法試薬（卵黄レシチン由来ジグリセリド）を用いた効果の確認
卵黄レシチンから調製された１，２−ジグリセリドを基質に用いた市販試薬「リパーゼカラーオートテストワコー」（和光純薬工業株式会社）を用い、効果の確認を行った。「リパーゼカラーオートテストワコー」は、酵素基質剤（凍結乾燥バイアル）、溶解液（グッド緩衝液）及び活性化溶液（グッド緩衝液ｐＨ８．７、４−アミノアンチピリン、デオキシコール酸）から構成され、酵素基質剤を溶解液で溶解したものを酵素基質液として第一試薬とし、活性化溶液を第二試薬として用いる。

効果を調べるため、溶解液に粉末でＮａＴＤＣＡ及びＮａＧＤＣＡを、溶解液中の濃度として１２ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、更に水酸化ナトリウムでｐＨを７．０に調整した。また、６ｍｍｏｌ／Ｌの４−アミノアンチピリンを含む１５０ｍｍｏｌ／ＬＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を調製し活性化溶液の代わりに用いた。すなわち、キットの活性化溶液に含まれている胆汁酸であるデオキシコール酸を除き、代わりにＮａＴＤＣＡ及びＮａＧＤＣＡを用いた。この反応液を用い、加工前の試薬との測定結果を比較した。検体としては、ヘパリン投与のもの９種、並びに非投与のもの５種を用いた。

結果を表６に示す。ヘパリン非投与の検体において、胆汁酸塩の種類を変えた本実施例（加工試薬）は、加工前の市販試薬の９４〜１０８％の活性の測定値を示した。また、ヘパリン投与検体において、本実施例は、加工前の市販試薬の４０％から６２％の活性の測定値を示した。したがって、ヘパリン投与検体において、本実施例は、非膵リパーゼの影響を軽減可能なことが示された。

（実施例１５）
実施例２のＲ−１、Ｒ−２のｐＨをＢｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．０）に、またＲ−１の胆汁酸を２７ｍｍｏｌ／Ｌデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＤＣＡ）と１３ｍｍｏｌ／Ｌタウロデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＴＤＣＡ）としたものを比較対照例（ＮａＴＤＣＡの胆汁酸に占める比率３３％）とした。また、本実施例の試薬組成として（１）Ｒ−１、Ｒ−２の緩衝液をＢＥＳ（ｐＨ７．２）とし、胆汁酸として２０ｍｍｏｌ／Ｌタウロデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＴＤＣＡ）と２０ｍｍｏｌ／Ｌグリコデオキシコール酸ナトリウム（ＮａＧＤＣＡ）を添加した。さらに、本実施例の別の試薬組成として（２）Ｒ−１の緩衝液をＢＥＳ（ｐＨ７．２）とし、胆汁酸無添加、Ｒ−２の緩衝液をＢＥＳ（ｐＨ７．２）とし、胆汁酸として４０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＴＤＣＡと４０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＧＤＣＡを添加した。このように、（２）においては胆汁酸をＲ−２に添加した。なお、胆汁酸の終濃度は（１）と同じである。

・測定操作
活性計算以外は実施例２と同じとした。本実施例及び比較対照例において、ヒト膵組換えリパーゼが含まれているＣＲＭ−００１ｂを蒸留水の代わりにプール血清で溶解したものをキャリブレーターに用いて、リパーゼ活性を算出した。

・検体
プレチパス、プレチノルム、ヘパリン非投与検体１０種、ヘパリン投与検体５種。

・測定
結果を表７に示す。表から明らかなように、本実施例（１）、（２）において、ヘパリン非投与検体については比較対照例で測定したリパーゼ活性の９０−１１０％の活性を示したが、ヘパリン投与検体については比較対照例で測定したリパーゼ活性の５２−６９％の活性値となった。本実施例から、胆汁酸をＲ−１、Ｒ−２のどちらに添加しても効果が認められることが示された。

（実施例１６）カラー法
・基質の調製
溶解後の濃度が１３．９５ｍｍｏｌ／Ｌになるよう１，２−ジオレオイルグリセロール（ＤＯＤＧ）（日本精化製）を秤量しこれに２．５ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳ（同仁化学）を含有する１．２％ポリオキシエチレン（１０）ノニルフェニルエーテル（ＮＰＥ）（和光純薬工業株式会社）を加え、３７度４時間撹拌し溶解させ、その後氷中に２時間以上静置した。

・試薬組成
比較対照例
（Ｒ−１）
１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ （ｐＨ６．０５）
１．５ｍｍｏｌ／Ｌ 塩化カルシウム
３ ｍｍｏｌ／Ｌ 硫酸マグネシウム
３ ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ
１．０５ｍｍｏｌ／Ｌ １，２−ジオレオイルグリセロール
０．０９％ ＮＰＥ
０．０４５％ Ｎ，Ｎ−ビス（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン２ナトリウム（ＴＯＤＢ）（同仁化学製）
９０ Ｕ／Ｌ グリセロキナーゼ（ＧＫＺ）（旭化成ファーマ製）
９０ Ｕ／Ｌ モノグリセリドリパーゼ（ＭＧＬＰＩＩ） （旭化成ファーマ製）
３２００ Ｕ／Ｌ グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯＭ）（旭化成ファーマ製）
２２５０ Ｕ／Ｌ パーオキシダーゼ （シグマ製）

（Ｒ−２）
１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＴＡＰＳ（ｐＨ８．１）
３ ｍｍｏｌ／Ｌ ４−アミノアンチピリン
３０ ｍｍｏｌ／Ｌ デオキシコール酸ナトリウム
３６０００ Ｕ／Ｌ コリパーゼ

本実施例として、３通りの試薬を調製した。上記の比較対照例からの変更点のみを下記に示す。
実施例１６−１
（Ｒ−１）
比較対照例の（Ｒ−１）にさらに下記成分を追加した。
１２ｍｍｏｌ／Ｌタウロデオキシコール酸ナトリウム
１２ｍｍｏｌ／Ｌ グリコデオキシコール酸ナトリウム
（Ｒ−２）
１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＢＥＳ（ｐＨ７．０）
３ ｍｍｏｌ／Ｌ ４−アミノアンチピリン
３６０００ Ｕ／Ｌ コリパーゼ

実施例１６−２
（Ｒ−１）比較対照例と同じ。
（Ｒ−２）
１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＢＥＳ（ｐＨ７．０）
３ ｍｍｏｌ／Ｌ ４−アミノアンチピリン
３６０００ Ｕ／Ｌ コリパーゼ
１５ｍｍｏｌ／Ｌ タウロデオキシコール酸ナトリウム
１５ｍｍｏｌ／Ｌ グリコデオキシコール酸ナトリウム

実施例１６−３
（Ｒ−１）
比較対照例の（Ｒ−１）にさらに下記成分を追加した。
１８０００ Ｕ／Ｌ コリパーゼ
（Ｒ−２）
１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＢＥＳ（ｐＨ７．０）
３ ｍｍｏｌ／Ｌ ４−アミノアンチピリン
１５ｍｍｏｌ／Ｌ タウロデオキシコール酸ナトリウム
１５ｍｍｏｌ／Ｌ グリコデオキシコール酸ナトリウム

・検体
プレチパス、プレチノルム、セロノルムＬＩＰＩＤ、ヘパリン非投与検体５種、ヘパリン投与検体９種。

・測定
実施例１６−１に係る組成（１）、実施例１６−２に係る組成（２）、及び実施例１６−３に係る組成（３）の簡単な比較表を下記の表８に示す。なお、検体、Ｒ−１、Ｒ−２の混合比は３、１６０、８０とした。

１，２−Ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロール−３−グルタル酸−（６−メチルレゾルフィン）エステル（ＤＧＧＲ）を用いたレゾルフィン比色法の市販試薬であるロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製「リキテック リパーゼカラーＩＩ」を効果を確認するために用いた。なお、本実施例に係る試薬及び比較対照例においては、暫定的なキャリブレーターを用いて活性を算出した。結果を表９に示す。ヘパリン非投与検体について、本実施例により測定したヒト膵リパーゼ活性が、比較対照例により測定した活性の８７〜１０８％とほぼ同等の値を示したのに対して、ヘパリン投与検体については、４７〜６８％の範囲で活性が低下し、非膵リパーゼの影響が軽減したことが示された。本実施例においては、ジグリセリドとコリパーゼが別々の試薬に含まれている場合は、組成（１）、組成（２）での結果が示すように、胆汁酸は第一試薬、第二試薬のどちらに添加してもよい。また、ジグリセリドと胆汁酸が別々の試薬に含まれている場合、コリパーゼはどちらに添加してもよい（組成（２）と組成（３）の結果）。

また、「リキテック リパーゼカラーＩＩ」と、比較対照例と、の相関を図１７に示す。リキテックに比べてヘパリン投与検体の測定値が、ヘパリン非投与検体の回帰直線から大きく逸脱していることがわかる。これに対し、図１８に示すように、「リキテック リパーゼカラーＩＩ」と、本実施例と、の相関では、この点が改善され、ヘパリン投与検体の測定値は、ほぼヘパリン非投与検体の回帰直線上にあった。したがって、ヘパリン投与検体において、本実施例は、非膵リパーゼの影響を軽減可能なことが示された。

（実施例１７）ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨと活性測定時のｐＨとの関係
抱合型胆汁酸としてＮａＧＤＣＡを、非抱合胆汁酸としてＮａＣＤＣＡを選択し、実施例２と同様の反応液を用いた。Ｒ−１中でのＮａＧＤＣＡ濃度は１６ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＣＤＣＡ濃度は２４ｍｍｏｌ／Ｌとし、この時のヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨを求めたところ、７．６付近であった。

次に、この組成を用いｐＨを７．１及び７．６に調整し、ヘパリン投与検体２種を含む管理試料（膵リパーゼを含むコントロール）を測定した。同時にＮａＧＤＣＡとＮａＴＤＣＡ（Ｒ−１中でそれぞれ２０ｍｍｏｌ／Ｌ）を含む本実施例の組成（ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．２）についても測定を実施した。還元型ＮＡＤＰの分子吸光係数を用い、酵素活性を算出した。ヒト膵ＬＰ遺伝子組換え体を添加したプール血清の感度は、ＮａＧＤＣＡとＮａＣＤＣＡの組合せでは、至適ｐＨであるｐＨ７．６の時を１００％とするとｐＨ７．１では約８０％であった。ＮａＧＤＣＡとＮａＴＤＣＡの組合せでｐＨ６．２の反応液を用いて測定したヘパリン投与血清の測定値を、非膵リパーゼ活性の影響を受けていないヒト膵リパーゼ活性値を反映していると仮定し、ＮａＧＤＣＡとＮａＣＤＣＡの組合せ組成のｐＨ７．１、７．６それぞれの測定値をキャリブレーターで換算し、非膵リパーゼの影響度を評価した。

結果を表１０に示す。ヘパリン投与検体のリパーゼ測定値はｐＨ７．６では、相対値として１８２％、１３７％であったが、ｐＨ７．１においては、１１８％、１００％と、非膵リパーゼの影響が軽減されていた。これらの結果から、ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨと、リパーゼ活性測定時のｐＨと、が一致していなくとも、リパーゼ活性測定時のｐＨが７．４以下であれば、本実施例の効果が認められることが示された。また、リパーゼ活性測定時のｐＨが７．６の場合、相対値（％）は１２０％を超えていたことから、非膵リパーゼの影響を２０％以上受けていることが示された。

（実施例１８）ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨと活性測定時のｐＨとの関係
本実施例においては、抱合型胆汁酸としてＮａＴＤＣＡを、また非抱合胆汁酸としてＮａＤＣＡを選択し、実施例２と同様の反応液を用いた。Ｒ−１中でのＮａＴＤＣＡ濃度は２７ｍｍｏｌ／Ｌ、ＮａＤＣＡ濃度は１３ｍｍｏｌ／Ｌとし、この時のヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨを求めたところ、ｐＨ７．５５付近であった。

次に、この組成を用いｐＨを７．１、７．５５、及び７．７５に調整し、ヘパリン投与検体２種を含む管理試料（膵リパーゼを含むコントロール）を測定した。実施例１７と同様にＮａＧＤＣＡとＮａＴＤＣＡ（Ｒ−１中でそれぞれ２０ｍｍｏｌ／Ｌ）を含む本実施例の組成（ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．２）について測定したものを対象として、実施例１７に従い、感度、影響度を評価した。

結果を表１１に示す。ヒト膵ＬＰ遺伝子組換え体を添加したプール血清の感度は、ＮａＴＤＣＡとＮａＤＣＡの２対１混合では、至適ｐＨであるｐＨ７．５５の時を１００％とするとｐＨ７．１では８３％であった。一方、ヘパリン投与検体のリパーゼ測定値はｐＨ７．７５及び７．５５では、相対値としてそれぞれ２５８．９％、２４４．５％及び１５６．３％、１６８．２％であったが、ｐＨ７．１においては、１０９．４％、１０３．０％と、非膵リパーゼの影響が軽減されていた。

実施例１７の結果と同様これらの結果から、ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨと、リパーゼ活性測定時のｐＨと、が一致していなくとも、リパーゼ活性測定時のｐＨが７．４以下であれば、本実施例の効果が認められることが示された。また、リパーゼ活性測定時のｐＨが７．５５の場合、相対値（％）は１２０％を超えていたことから、非膵リパーゼの影響を２０％以上受けていることが示された。

（実施例１９）非抱合型胆汁酸とその塩の比較
タウロデオキシコール酸とデオキシコール酸の組合せにつき、実施例３で用いたデオキシコール酸ナトリウム塩の代わりに、非抱合型胆汁酸であるデオキシコール酸（ＤＣＡ）を用いて試薬を調製した。タウロデオキシコール酸としてはナトリウム塩に固定した。図１９に示すように、タウロデオキシコール酸とデオキシコール酸の比率を２４／１２ｍｍｏｌ／Ｌとした時、及び０／３６ｍｍｏｌ／Ｌについて、ナトリウム塩を用いた場合と非抱合型の酸を用いた場合で、結果に差は認められなかった。したがって、胆汁酸が塩であるか否かは、本実施例に係るヒト膵リパーゼの活性測定に影響しないことが示された。

本発明により、非膵リパーゼの影響を軽減した再現性の良い、試料中のヒト膵リパーゼ活性測定方法を提供することができ、例えば、急性膵炎等の膵臓疾患の診断マーカーとしてのヒト膵パーゼ測定に利用可能である。

Claims (34)

1. 試料中のヒト膵リパーゼ活性の測定方法であって、
   １）前記ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨを７．７未満にする胆汁酸、ジグリセリド、及びコリパーゼと、前記試料とを、ｐＨ７．４以下で接触せしめる接触工程と、
   ２）前記試料中の前記ヒト膵リパーゼ活性に応じて変化するシグナル量を検出する検出工程と、
   を含む測定方法であり、
   前記胆汁酸が、
   ａ）グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のａ型胆汁酸；及び／又は
   ｂ）グリココール酸（ＧＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のｂ−１型胆汁酸と、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のｂ−２型胆汁酸と、の組合せ；
   を含む胆汁酸である、
   測定方法。
2. 前記試料がヒト非膵リパーゼの混在することがある試料である請求項１に記載の測定方法。
3. 前記接触工程において、前記ａ）の胆汁酸が用いられる、請求項１又は２に記載の測定方法。
4. 前記ａ）の胆汁酸を用いる場合において、前記ａ型胆汁酸の添加割合が、全ての胆汁酸及び／又はその塩の総量に対して４０％以上である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の測定方法。
5. 前記接触工程において、前記ｂ）の胆汁酸が用いられる、請求項１又は２に記載の測定方法。
6. 前記ａ型胆汁酸が、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）及びその塩から選択される１種又は２種である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の測定方法。
7. 前記ａ型胆汁酸が、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の測定方法。
8. 前記ａ型胆汁酸が、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）及びその塩から選択される１種又は２種である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の測定方法。
9. 前記ジグリセリドと共に、非イオン界面活性剤が存在する、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の測定方法。
10. 前記非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレン２級アルコールエーテルからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項９に記載の測定方法。
11. 前記検出工程において、比色法が用いられる、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の測定方法。
12. 前記接触工程において、全胆汁酸の濃度がモル比で前記ジグリセリドに対して１０倍以上である、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の測定方法。
13. 前記接触工程において、ｐＨが７．２以下である、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の測定方法。
14. ヒト膵リパーゼの活性の最大値を与えるｐＨを７．７未満にする胆汁酸、ジグリセリド、及びコリパーゼを少なくとも含む、試料中のヒト膵リパーゼ活性の測定用キットであって、
    前記ヒト膵リパーゼ活性の測定時のｐＨが７．４以下となるよう調製されており、
    前記胆汁酸が、
    ａ）グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のａ型胆汁酸；及び／又は
    ｂ）グリココール酸（ＧＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のｂ−１型胆汁酸と、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のｂ−２型胆汁酸と、の組合せ；
    を含む胆汁酸である、
    キット。
15. 前記試料がヒト非膵リパーゼの混在することがある試料である、請求項１４に記載のキット。
16. 色原体を更に含む、請求項１４又は１５に記載のキット。
17. 活性測定時のｐＨが７．２以下となるように調整された、請求項１４ないし１６のいずれか１項に記載のキット。
18. 内容物が複数の容器に分けて保存されている、請求項１４ないし１７のいずれか１項に記載のキット。
19. 試料中のヒト膵リパーゼ活性の測定方法であって、
    １）胆汁酸、ジグリセリド、及びコリパーゼと、前記試料とを、ｐＨ７．４以下で接触せしめる接触工程と、
    ２）前記試料中の前記ヒト膵リパーゼ活性に応じて変化するシグナル量を検出する検出工程と、
    を含む測定方法であり、
    前記ジグリセリドの濃度が０．３５〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、前記胆汁酸の濃度がモル比で前記ジグリセリドの濃度の１０〜２０倍であり、
    前記胆汁酸が、
    ａ）グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のａ型胆汁酸を含む胆汁酸であって、前記ａ型胆汁酸のモル比が、全ての胆汁酸及び／又はその塩の総量に対して４０％以上である胆汁酸；又は
    ｂ）グリココール酸（ＧＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のｂ−１型胆汁酸と、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のｂ−２型胆汁酸と、の組合せを含む胆汁酸であって、前記ｂ−１型胆汁酸のモル比が、全ての胆汁酸及び／又はその塩の総量に対して３０〜７０％である胆汁酸；
    である、
    測定方法。
20. 前記試料がヒト非膵リパーゼの混在することがある試料である、請求項１９に記載の測定方法。
21. 前記接触工程において、前記ａ）の胆汁酸が用いられる、請求項１９又は２０に記載の測定方法。
22. 前記接触工程において、前記ｂ）の胆汁酸が用いられる、請求項１９又は２０に記載の測定方法。
23. 前記ａ型胆汁酸が、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）及びその塩から選択される１種又は２種である、請求項１９ないし２１のいずれか１項に記載の測定方法。
24. 前記ａ型胆汁酸が、グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項１９ないし２１のいずれか１項に記載の測定方法。
25. 前記ａ型胆汁酸が、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）及びその塩から選択される１種又は２種である、請求項１９ないし２１のいずれか１項に記載の測定方法。
26. 前記ジグリセリドと共に、非イオン界面活性剤が存在する、請求項１９ないし２５のいずれか１項に記載の測定方法。
27. 前記非イオン界面活性剤が、ポリオキシエレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、及びポリオキシエチレン２級アルコールエーテルからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２６に記載の測定方法。
28. 前記検出工程において、比色法が用いられる、請求項１９ないし２７のいずれか１項に記載の測定方法。
29. 前記接触工程において、ｐＨが７．２以下である、請求項１９ないし２８のいずれか１項に記載の測定方法。
30. 胆汁酸、ジグリセリド、及びコリパーゼを少なくとも含む、試料中のヒト膵リパーゼ活性の測定用キットであって、
    前記ヒト膵リパーゼ活性の測定時のｐＨが７．４以下となるよう調製されており、かつ少なくとも前記胆汁酸、前記ジグリセリド、及び前記コリパーゼと、前記試料と、を接触させる反応液中の前記ジグリセリドの濃度が０．３５〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、前記胆汁酸の濃度がモル比で前記ジグリセリドの濃度の１０〜２０倍となるよう調製されており、
    前記胆汁酸が、
    ａ）グリコデオキシコール酸（ＧＤＣＡ）、グリコケノデオキシコール酸（ＧＣＤＣＡ）、タウロデオキシコール酸（ＴＤＣＡ）、タウロケノデオキシコール酸（ＴＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のａ型胆汁酸を含む胆汁酸であって、前記ａ型胆汁酸のモル比が、全ての胆汁酸及び／又はその塩の総量に対して４０％以上である胆汁酸；又は
    ｂ）グリココール酸（ＧＣＡ）、グリコウルソデオキシコール酸（ＧＵＤＣＡ）、タウロコール酸（ＴＣＡ）、タウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のｂ−１型胆汁酸と、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）及びそれらの塩からなる群から選択される１種又は２種以上のｂ−２型胆汁酸と、の組合せを含む胆汁酸であって、前記ｂ−１型胆汁酸のモル比が、全ての胆汁酸及び／又はその塩の総量に対して３０〜７０％である胆汁酸；
    である、
    キット。
31. 前記試料がヒト非膵リパーゼの混在することがある試料である請求項３０に記載のキット。
32. 色原体を更に含む、請求項３０又は３１に記載のキット。
33. 活性測定時のｐＨが７．２以下となるように調整された、請求項３０ないし３２のいずれか１項に記載のキット。
34. 内容物が複数の容器に分けて保存されている、請求項３０ないし３３のいずれか１項に記載のキット。