JPH03228699A - ビリルビン影響を回避したリパーゼ活性測定用試薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、血清中のリパーゼ活性を測定する臨床診断用
試薬組成物であり、主に膵疾患の診断または治療効果の
判定等に利用する際、測定系のビリルビンの影響を回避
した、基質として１．２−ジグリセリドを用いてなるリ
パーゼ活性測定用試薬組成物に関する。

〈従来の技術〉 従来、生体成分の測定系における生成物である過酸化水
素を定量する方法は、エマーソン・トリシダー法が一般
的に用いられているが、この方法は酸化カップリング反
応において、還元性物質。

中でも血清中に高濃度に存在する可能性のあるビリルビ
ンの反応系への影響が問題となっており、ビリルビンの
影響を回避する公知技術として、生体成分として例えば
、尿酸、コレステロール、トリグリセリドの測定系にフ
ェロシアン化物イオンを含有せしめた試薬組成物の報告
がある（特開昭５５−１３８６５６号、特開昭５６−１
５５８５２号、特開昭５９−２８６６４号）。しかしな
がら、上記の過酸化水素定量系におけるフェロシアン化
物イオンによるビリルビン影響の回避効果が不充分であ
ることから、さらにフェロシアン化物イオンとアルブミ
ンを共存せしめることによりビリルビンの影響を相乗的
に回避する方法が報告され（特開昭６０−２２８９６３
号）、さらに過酸化水素定量系に鉄錯体を添加したビリ
ルビン影響の回避方法の報告（特開平１−１０９２６０
号）がある。

〈発明が解決しようとする問題点〉 上述のように、過酸化水素定量系を含む生体内成分であ
る例えば尿酸、コレステロール、トリグリセリド等の測
定系にビリルビン影響回避の目的でフェロシアン化物イ
オンや鉄錯体を添加することが知られているものの、そ
の効果が不充分であることからさらに過酸化水素定量系
のビリルビン影響回避の効果を改善するに当たってはア
ルブミンの共存が必要であることが知られているが、本
発明のように、生体内の主に膵疾患の診断等に有用であ
る１、２−ジグリセリド、非イオン性界面活性剤、モノ
グリセリドリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロ
リン酸オキシダーゼ等に基づくリパーゼ活性測定の目的
において、さらにこの測定系の中ヘビリルビン影響を回
避するための手段を組み込んだリパーゼ活性測定用の試
薬組成物は未だ報告されていない。

〈問題点を解決するための手段〉 本発明者らは、リパーゼ活性測定用試薬系において、ま
ず天然または合成基質である１、２−ジグリセリドが非
イオン性界面活性剤を用いることにより水に可溶化し、
得られる組成物が安定に長期間保存でき、かつ水可溶化
の形態であるために分光学的な測定方法にも使用でき、
再現性の良好なリパーゼ活性測定用としての基質組成物
であることを見出しく特開昭５９−９１８９８号）、さ
らに１．２−ジグリセリドの分解物であるモノグリセリ
ドからグリセロールへの分解反応が律速である点を解消
して迅速な測定をする目的で、モノグリセリドに特に強
く作用するモノグリセリドリパーゼを見出した（特開昭
６３−２４５６７２号）。次いで本発明に至っては、基
質である１、２−ジグリセリドにこれら非イオン性界面
活性剤、・モノグリセリドリパーゼやグリセロールキナ
ーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ水素供与体とそのカ
プラー、パーオキシダーゼ等を添加せしめ、さらに測定
系における過酸化水素定量系でのビリルビン影響を回避
するために鉄錯体である例えばフェロシアン化物イオン
やエチレンジアミン四酢酸鉄（ＥＤＴＡ−Ｆｅ）イオン
を添加した組成物を作製することにより、アルブミンの
共存によるビリルビン影響回避の改善効果を何ら必要と
することなく、この鉄錯体により測定系における生体内
ビリルビン影響を良好に回避することを可能とした有用
なリパーゼ活性測定用試薬組成物（以下、本発明組成物
ということがある）を見出した。

本発明は以上の知見に基づいて完成されたものであり、
少なくとも１，２−ジグリセリド、モノグリセリドリパ
ーゼ、非イオン性界面活性剤、グリセロールキナーゼ、
グリセロリン酸オキシダーゼ。

水素供与体とそのカプラー、パーオキシダーゼ。

鉄錯体を含有するリパーゼ活性測定用試薬組成物を提供
するものであり、その目的はリパーゼ活性系におけるビ
リルビン影響を効率良く回避せしめる組成物を提供する
ことである。

すなわち本発明の測定系の概略は次のとうりである。ま
ず測定対象成分である検体中のリパーゼは、非イオン性
界面活性剤により水に可溶化され種々の点で好ましい状
態の天然または合成基質である１、２−ジグリセリドに
作用してモノグリセリドを遊離し、これをモノグリセリ
ドに特に強く作用するモノグリセリドリパーゼにより迅
速にグリセロールと脂肪酸に分離し、このグリセロール
をグリセロールキナーゼでリン酸化し、さらにグリセロ
リン酸からグリセロリン酸オキシダーゼの作用により過
酸化水素を生成する。このようにして生成された過酸化
水素を水素供与体とそのカプラーである例えばフェノー
ル類またはアニリン誘導体と４−アミノアンチピリン、
及びパーオキシダーセ゛を用いて比色定置するが、この
反応系において生体成分中のビリルビンの影響のために
正確な測定が行われないことを回避する目的で、鉄錯体
であるフェロシアン化物イオン等あるいはＥＤＴＡＦｅ
イオン等を含有せしめたリパーゼ活性測定用試薬を提供
するものである。

以下に、本発明の試薬組成物を構成する物質とその使用
濃度について詳細に説明する。

まず、本発明に用いる鉄錯体として、フェロシアン化物
イオンを用いるのが好ましく、例えばフェロシアン化ナ
トリウム、またはフェロシアン化カリウムのようなアル
カリ金属塩、並びにフェロシアン化物イオンを含有また
は放出することのできるその他の塩等のフェシアン化物
イオン源が挙げられる。またその他の鉄錯体として、例
えばＥＤＴＡ−Ｆｅイオンについては、ＥＤＴＡ−Ｆｅ
ナトリウムやＥＤＴＡ−ＦｅカリウムのようなＥＤＴＡ
−Ｆｅイオンを含有または放出することができるその他
の塩等のＥＤＴＡ−Ｆｅイオン源が挙げられる。またそ
の他にもニトリロ三酢酸、エチレンジアミンニ酢酸５エ
チレンジアミンニプロピオン酸、ヒドロキシエチルエチ
レンジアミン三酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、グリコ
ールエーテルジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ
ニ酢酸、イミノニ酢酸、ニトリロニ酢酸プロピオン酸、
エチレンジアミンスルホン酸、グリコン酸エチレンジア
ミン　ジヒドロキシエチルグリシントランス−シクロヘ
キサンジアミン四酢酸等の鉄錯体を挙げることができ、
またこれらの例示した化合物に限らず、鉄と錯体を形成
しうるちのであれば本発明に有効に用いることができる
。

尚、本発明に用いる鉄錯体として特に好ましいフェロシ
アン化物イオンを用いる場合の濃度は、１　ｎｍｏｌｅ
／　ｍ　１未満であるとビリルビン影響を完全に回避す
ることができず、また１５ｎＩＩＯ１ｅノＩｌＮを越え
る濃度であると試薬ブランク値が上昇するために正誤差
の原因となり試薬性能を損ない測定感度が低下するので
、これらの好ましい使用濃度は１ｎＩＩｌｏｌｅ／　ｍ
ｆｆ１〜１５ｎｍｏｌｅ／　ｓｊ！の範囲となる。同様
に鉄錯体としてＥＤＴＡ−Ｆｅイオン等を用いる場合の
濃度は、１０ｎｍｏｌｅ／　ｍ　ｊ！　〜２５Ｏｎ＋＊
ｏｌｅ／ｍ　ｌの範囲である。

次に、本発明に用いる基質である１、２−ジグリセリド
としては、下記一般式（１） ％式％ ［１） （ただし、Ｒ１およびＲ２は同一または異なって炭素数
１２以上の高級脂肪酸基を示す）で表される天然または
合成の化合物である。

一般式（Ｉ）で表される化合物のＲ１およびＲ２におけ
る高級脂肪酸基としての構成因子である高級脂肪酸は炭
素数１２以上の高級脂肪酸であればよく、例えば、ラウ
リン酸（Ｃ＋□。）、トリデシレン酸（Ｃ，３，。）、
ミリスチン酸（Ｃ１ａ　＋。）、ペンタデシレン酸（Ｃ
Ｉ５＋。）、−パルミチン酸（Ｃ２゜：０）、マーガリ
ン酸（Ｃ，□、。）、ステアリン酸（Ｃ＋ｓ＋ｏ）、ノ
ナデシレン酸（Ｃ１１，。）、アラキン酸（ＣＺ。、。

）、ベヘニン酸（Ｃｚ、＝。）、リグノセリン（Ｃｚｚ
：。）等の飽和高級脂肪酸やパルミトオレイン酸（ＣＩ
６＋１）　、９−オクタデセン酸（Ｃ１：１；オレイン
酸）、１１−オクタデセン酸（ＣＩｌｌｌｌｉバクセン
酸）、ｌ、２−オクタデセン酸（ｃ＋ｇ＋＋）、９−ア
イコセン酸（ＣＺ。、、）　、１１−　トコセン酸（Ｃ
ｔｔ：１＞　、１３−　トコセン酸（Ｃｚｚ＋＋ｉエル
カ酸）、リノール酸（Ｃ＋ｓ、ｚ）　、リルン酸（Ｃ０
Ｉ＋３）、１１、１４−エイコサジエン酸ＣＣｔｏ＋ｔ
）　、８．ＩＣｌ３−エイコサトリエン酸（Ｃｚ。＋３
）　、５，８，１１．１４−エイコサトラエン酸（Ｃｚ
。、４；アラキドン酸）等の不飽和高級脂肪酸が挙げら
れる。このＲ１およびＲ。

の構成因子である高級脂肪酸においては、不飽和高級脂
肪酸となすことにより得られる組成物の透明度がよく、
好ましいもので炭素数１６以上の不飽和高級脂肪酸を構
成因子とする１、２−ジグリセリドが好ましい。従って
、また１、２−ジグリセリドにおいてそのＲ１またはＲ
２のいずれか一方が不飽和高級脂肪酸、他方が飽和高級
脂肪酸の残基である化合物であってもよく、さらにＲ１
，Ｒｚがラジール基であってもよい。特に好ましくはＲ
１が不飽和高級脂肪酸（Ｃ＋ｔｈ＋＋、　Ｃ＋ｓ＝＋、
　　Ｃｚ。、１．Ｃｚｚ＋＋、　　ＣＩＩｊＬ　　Ｃｌ
ｌ１３．　　Ｃｇ＋＋ｚ、　　Ｃｚｏ：ｚ、　Ｃｔｏ＋
＜）残基、Ｒ２が飽和高級脂肪酸（Ｃ，。。、　Ｃ，４
，。

、ＣＩ＆＋。、　　Ｃ１１＋。、Ｃ３゜、。）残基また
は不飽和高級脂肪酸（Ｃ１＆ｌｌ、　Ｃ−ｓ＋＋、　Ｃ
ｚ。＋Ｉ＋Ｃ２□、、、　　Ｃ１１□＋　　Ｃ１ｇ１Ｌ
　　Ｃｌ。！　２　＋　　ＣＭ　Ｏｒ　２　＋　　Ｃ２
□４）残基である１、２−ジグリセリドであり、例えば
、１−パルミトオレオイル−２−ラウロイル−グリセロ
ール、１パルミトオレオイル−２−バルミトイル−グリ
セロール、■−オレオイルー２−バルミトイル−グリセ
ロール、１−リルオイルー２−ラウロイルーグリセロー
ル、１−リルオイル−２−ミリストイル−グリセロール
、１−リルオイルー２−バルミトイルーグリセロール、
１−リルオイルーステアロイルーグリセロール、１−リ
ルノイルーラウロイルーグリセロール、１−リルノイル
−２−ミリストイル−グリセロール、１−リルノイルー
２−バルミトイルーグリセロール、１−リルノイルー２
−ステアロイルーグリセロール、１−　（１１，１４−
エイコセノイル）−２ミリストイル−グリセロール、１
−　（１１，１４−エイコセノイル）−２−バルミトイ
ル−グリセロール、ｌ（８，１１，１４，１７−ニイコ
サテトラエノイル）−２−ラウロイル−グリセロール、
１−　（８，１１，１４，１７−ニイコサテトラエノイ
ル）−２−バルミトイル−グリセロール、１．２−シリ
ルオイル−グリセロール、１．２−ジパルミトイル−グ
リセロール、１，２−シリルノイル−グリセロール等が
挙げられる。また、簡便な１．２−ジグリセリドを得る
に当たっては、ホスホリパーゼＣとレシチンとの反応に
よって生成される１、２−ジグリセリド、ホスファチジ
ン酸ホスファターゼとホスファチジン酸との反応によっ
て生成される１、２−ジグリセリド、ホスホリパーゼＤ
、ホスファチジン酸ホスファターゼとレシチンとの反応
によって生成される１、２−ジグリセリドを用いてもよ
い。さらに、これらの１．２−ジグリセリドは単離、精
製することなく反応前のホスホリパーゼＣとレシチンか
らなる含有物、ホスファチジン酸ホスファターゼとホス
ファチジン酸からなる含有物、ホスホリパーゼＤ、ホス
ファチジン酸ホスファターゼとレシチンからなる含有物
を１．２−ジグリセリドの代わりに用いてもよい。

以上例示した基質である１、２−ジグリセリドの本発明
組成物への含有量は、０．３　ｍＭ〜１．０鱈の範囲で
使用するのが好ましい。

次に、本発明組成物に用いる界面活性剤としては、例え
ばポリオキシエチレン（ＰＯＥ）脂肪アルコールエーテ
ルとしては、例えば花王アトラス社製のＥＭＵＬＧＥＮ
１０６（ＰＯＥラウリルアルコールエーテル：ＨＬＢｌ
ｏ、５）、ＥＭＬＩＬＧＥＮ１０８（ＰＯＥラウリルア
ルコールエーテル：ＨＬＢ１２．１）、ＥＭＵＬＧＥＮ
２２０（ＰＯＥセチルアルコールエーテル：ＨＬ８１４
．２）、ＥＭＵＬＧＥＮ４０８（ＰＯＥオレイルアルコ
ールエーテル：ＨＬＢｌｏ、０）、Ｂｒ１ｊ３５（ｐｏ
ｅ（２３）ラウリルアルコールエーテル：ＨＬＢ１６．
９）、Ｂｒ１ｊ７８（ＰＯＥ（２０）アテアリルアルコ
ールエーテル：Ｉ（ＬＢ１５．３）、Ｂｒ１ｊ９８（Ｐ
ＯＥ１２０）オレイルアルコールエーテル：ＨＬＢ１５
．３）　、　ＥＭＵＬＧＥＮ３４０（ＰＯＥステアリル
エーテル：ＨＬＢ１７．３）、共栄社油脂社製のノ二′
オライドＡＬ−１１（ＰＯＥラウリルエーテル：ＨＬＢ
１４．０）　、ノニオライトＡＯ−２０（ＰＯＥオレイ
ルエーテル： ズ社製のＮＩＫｌ［ＯＬ　ＢＢ−２０（ＰＯＥヘヘニル
エーテル：ＨＬＢ１７、０）、ＮＩＫＫＯＬ　ＢＬ−９
ＥＸ．ＮＩＫＫＯＬ　ＢＯ−１０ＴＸ，ＮＩＫＫＯＬ　
８Ｃ１５ＴＸ，ＮＩＫＫＯＬ　ＢＢ５　、日本エマルジ
ツン社製のエマレックスＢＡＩＯ（ＰＯＥブチルアルコ
ールエーテル：ＨＬＢ１６、９）　、エマレックスＢＡ
１５（ＰＯＥブチルアルコールエーテル：ＨＬＢ１８．
７）　、エマレックス１３０　（ＰＯＥセチルアルコー
ルエーテル：ＨＬＢ１６．０）、エマレックス１００　
（ＰＯＥセチルアルコールエーテル：ＨＬＢ１４．５）
　、エマレ・ノクス５５０（ＰＯＥオレイルアルコール
エーテル：ｉｌＬＢ１８、２）、エマレックス７００　
（ＰＯＥラウリルアルコールエーテル：ＨＬＢ１６．７
）　、日本油脂社製のノニオンＥ−２１３　（ＰＯＥオ
レイルアルコールエーテル：ＨＬＢ１３．６）　、ノニ
オンＥ−２２０　（ＰＯＥオレイルアルコールエーテル
：ＨＬＢ１５．３）、ノニオンＦ−２２５　（ＰＯＥセ
チルアルコールエ−チル：ＨＬＢ１６．４）　、ノニオ
ンＳ−２１５（ＰＯＥステアリルアルコールエーテル：
ＨＬＢ１４．２）　、ノニオンＴ−２０８，５（ＰＯＥ
　）リゾシルアルコールエーテル：ＨＬＢ１３．０）、
ライオン油脂社製リポノックスＯＣＳ　（ＰＯＥアルキ
ルエーテル：ＨＬＢ１５．０）　、リポノックスＬＣＲ
（ＰＯＥアルキルエーテル：ＨＬ８１６．２）　、リポ
ノックス０（ＰＯＥアルキルエーテル、ＨＬＢ１４．３
）等が使用できる。

アルコールエーテルとしては、例えば旭電化工業社製の
Ａｄｅｋａ　ｔｏ　ｌ　（アデカトール）５０−１２０
（第２級直鎖アルコールエトキシレート：ＨＬＢ１２．
Ｏ）　、アデカトール５ｏ−１４５（第２級直鎖アルコ
ールエトキシレート：ＨＬＢ１４．５）　、アデカトー
ルＬＯ−９（第１級直鎖アルコールエトキシレート：Ｈ
ＬＢ１３．０）　、アデカトールＬＯ’１２（第１級直
鎖アルコールエトキシレートＨＬＢ１４．Ｏ）、アデカ
トールＬＯ−１５（第１級アルコールエトキシレート１
５．０　）　、アデカトールＮＰ−７２０（ノニルフェ
ノールエトキシレー）　：ＨＬＢ１４．（１）　、アデ
カトールＮＰ−６９５（ノニルフェノールエトキシレー
ト：ＨＬＢ１３．Ｏ）等が使用できる。

ＰＯＥアルキルアリールエーテルとしては、例えば花王
アトラス社製のＥＭＵＬＧＥＮ８１０　（ＰＯＥオクチ
ルフェニールエーテル：ＨＬＢ１３．１）　、　ＥＭＵ
ＬＧＥＮ９１１　（ＰＯＥエノルフヱニールエーテル：
　ＨＬＢ１３．７）　、　ＥＭＵＬＧＥＮ９３０　（Ｐ
ＯＥノニルフェニールエーテル：ＨＬＢ１５．１）、Ｅ
ＭＵＬＧＥＮ９５０　（ＰＯＥノニルフェニールエーテ
ル：ＨＬＢ１８．２）　、共栄社油脂社製のノニオライ
トＰＯ−９（ＰＯＥオクチルフェニールエーテル：ＨＬ
Ｂ１３．２）　、ノニオライトＰＡ−１５（ＰＯＥアル
キルフェニールエーテル： 本エマルジョン社製のエマレックスＮＰ４５（ＰＯＥア
ルキルフェノールエーテル：ＨＬＢ１３．２）、エマレ
ックスＯＰ−２５　（ＰＯＥアルキルフェノールエーテ
ル：ＨＬＢ１５、８）、日本油脂社製のノニオンＮＳ−
２１５（ＰＯＥノニルフェノールエーテル：ＨＬＢ１５
．Ｏ）　、ノニオンＭＳ−２２０（Ｐ０Ｅノニルフェノ
ールエーテル：ＨＬＢ１６．Ｏ）　、ノニオンＨＳ−２
２０　（ＰＯＥノニルフェノールエーテル：ｌＩＬＢ１
６．２）、ライオン油脂社製のりボノックスＮＣＭ　（
ＰＯＥアルキルフェノールエーテル：ＨＬ３１４．５）
　、リポノックスＮＣＮ　（ＰＯＥアルキルフェノール
エーテル：）！ＬＢ１４．８）　。

リポノックスＮＧＯ　（ＰＯＥアルキルフェノールエー
テル：ＨＬＢ１５．０）　、シェル社製のＮｏｎｉｄｅ
ｔ−４０（ＰＯＥアルキルアリールエーテル）、ローム
アンドハス社製のＴｔｒｉｔｏｎＸ−１００（１）Ｏｅ
アルキルアリールエーテル）、日光ケミカルズ社製のＮ
ＩＫＫＯＬ　ＮＰ−１８ＴＸ，ＮＩＫＫＯＬＮＰ−２０
，ＮｒにＫＯＬ　ＯＰ−４０等が使用できる。

ＰＯＥ脂肪酸エステルとしては、例えば花王アトラス社
製のＥＭＡＮＯＮ１１１２（ＰＯＥモノラウレート：　
ＨＬＢ１３、７）　、Ｅ？ｌＡＮＯＮ４１１５（ＰＯＥ
モノオレイト：ＨＬＢ１３．４）、Ｍｙｒｊ　４５　（
ＰＯＥ　（８）ステアレー）　：ＩＬＢｌｌ．１）、Ｍ
ｙｒｉ５２（ＰＯＥ（４０）ステアレー）　：ＨＬＢ１
６．９）、Ｍｙｒｉ５３（ＰＯＥ（５０）ステアレート
：ＨＬＢ１７．９）　、共栄社油脂社製のノニオライト
Ｓ−１００（ＰＯＥステアレート：ＨＬＢ１５．６）　
、ノニオライトＴ−４０（ＰＯＥ　）−ル油脂肪酸エス
テル：）ＩＬＢｌｌ．５）、日本エマルジョン社製のエ
マレックス２０２　（ＰＯＥオレート：ｆ（ＬａＩ３．
１）、エマレックス２０３　（ＰＯＥオレート：ＨＬＢ
１７．６）、エマレックス８００　（ＰＯＥモノラウレ
ート：ＨＬＢ１５．８）　、ノニオンＰ−１０　（ＰＯ
Ｅモノパルミテート：４１ＬＢ１５．７）　、ノニオン
Ｓ−１０（ＰＯＥモノステアート：　）ＩＬＢ１５、２
）、ノニオンＳ−４０　（ＰＯＥモノステアレート：Ｈ
ＬＢ１８、２）、日光ケミカルズ社製のＭＹＬ−ｔｏ，
ＭＹＯ−１０等が使用できる。

ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えば花王
アトラス社製のＥＭＡＳＯＬ１１３０（ＰＯＥソルビタ
ンモノラウレート：ｌ（ＬａＩ６．３）、Ｅ阿ＡＳＯＬ
３１３０　（ＰＯＥソルビタンモノステアレート：ＨＬ
Ｂ１４．９）、Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＯＥ（２０）ソルビ
タンモノラウレート：ＨＬＢ１６．７）　＋　Ｔｗｅｅ
ｎ４０　（ＰＯＥ　（２０）ソルビタンモノパルミテー
ト：ＨＬＢ１５．６）　、　Ｔｗｅｅｎ８０　（ＰＱＥ
　（２０）ソルビタンモノオレイト：　ＨＬＢ１５、０
）　、共栄社油脂社製のノニオライトＴＷＬ−２０（Ｐ
ＯＥ（２０）ソルビタンモノラウレート：■ＬＢ１６．
２）、ノニオライトＴＭＳ−１３　（ＰＯＥ　（１３）
ソルビタンモノステアレート：ＨＬＢ１２．５）　、第
一工業製薬社製のＳＯＬＧＥＮ　ＴＭ０１　（ＰＯＩ！
ソルビタンモノラウレート：ＨＬＢ１６．７）、ＳＯＬ
ＧＥＮ　ＴＭ０１（ＰＯＥソルビタンモノオレート：Ｈ
ＬＢ１５．０）、日光ケミカルズ社製のＮＩＫＫＯＬ　
ＴＳＤＬ−２０２ＯＬ（ＰＯＥソルビタンオリーブ脂肪
酸：ＨＬＢ１６．５）、ＮＩＫＫＯＬ　ＴＬｌｏ、ＮＩ
ＫＫＯＬ　Ｔｏ−１０６、日本エマルジョン社製のエマ
レックスＥＴ−　２０００　（ＰＯＥソルビタンラウリ
レート：ＨＬＢ１６．６）　、日本油脂社製のノニオン
ＬＴ−２２１　（ＰＯＥソルビタンラウリレー）　：Ｈ
ＬＢ１６．７）　、ノニオンＳＴ２２１　（ＰＯＥソル
ビタンステアレート：ＨＬＢ１４．９）　、ノニオン０
Ｔ−２２１（ＰＯＥソルビタンオレート：ＨＬＢ１５．
Ｏ）　、東邦化学工業社製の５ｏｒｂｏｎ　Ｔ−２０（
ＰＯＥソルビタンモノラウレート：ＨＬＢ１６．７）、
５ｏｒｂｏｎ　Ｔ−４０（ＰＯＥソルビタンモノパルミ
テート：ＨＬＢ１５．７）、５ｏｒｂｏｎ　Ｔ−８０（
ＰＯＥソルビタンモノオレート：ＨＬＢ１５．０）等が
使用できる。

ＰＯＥソルビトール脂肪酸エステルとしては、例えば花
王アトラス社製のＡｔ１ｏｘ１０４５＾（ＰＯＥソルビ
トールオレイトラウレート：ＨＬＢ１３．２）、Ａｔ１
ｏｘｌ１９６（ＰＯＥソルビトールオレイト：ＨＬＢｌ
ｌ、４）、Ｇ−１０４５（ＰＯＥソルビタールラウレー
）　：ＨＬＢｌｌ、５）　、Ｇ−１４４１（ＰＯＥソル
ビトールラノリン誘導体二肛Ｂ１４）　、日光ケミカル
ズ社製のＮＩＫＫＯＬ　ＴＳＯＬ−１０２ＯＬ（ＰＯＥ
ソルビトールオリーブ脂肪酸エステル；ＨＬＢ１６．０
）、ＮｒＫＫＯＬ　ＧＬ−１等が使用できる。

ＰＯＥヒマシ油誘油体導体ＯＥ硬化硬化ヒマシ油体導体
ては、例えば花王アトラス社製のＧ−１２８８（ヒマシ
油酸化エチレン付加物：ＨＬＢ１６．Ｏ）、Ｇ−１２９
５（ＰＯＥ硬化硬化ヒマ酸油酸化エチレン付加物ＬＢ１
７．５）Ｇ−１２９２（硬化ヒマシ油酸化エチレン付加
物：）ＩＬＢＩＯ１８）、日光ケミカルズ社製のＮＩＫ
ＫＯＬ　Ｃｏ−６０ＴＸ（ＰＯＥ（６０）ヒマシ油：Ｈ
ＬＢ１４．１）等が使用できる。

ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステルとしては、例えば日光
ケミカルズ社製のＮ［ＫＯＬ　ＴＧＳＯ２１５（ＰＯＥ
グリセリン植物油脂肪酸エステル：ＨＬＢ１４．Ｏ）　
、　ＮＩＫＫＯＬＴＧＳＯ２２０（ＰＯＥグリセリン植
物油脂肪酸エステル：ＨＬＢ１５．５）、ＮＩＫＩＩＯ
Ｌ　ＴＯ３ＯＬ−２０１０（ＰＯＥジグリセリンオリー
ブ油：ＨＬＢ１２．５）が使用できる。

ＰＯＥラウリン誘導体としては、例えば花王アトラス社
製のＧ−１７９０，Ｇ−１７９５、日光ケミカルズ社製
のＢ−＾−５等が使用できる。

ＰＯＥアルキルチオエーテル、ＰＯＥプロピレングリコ
ールモノ脂肪酸エステル等のＰＯＥ系非イオン性界面活
性剤、ポリオキシプロピレンブロックとＰＯＥブロック
を有するブロック系非イオン性界面活性剤としては、例
えば旭電化工業社製のＰｌｕｒｏｎｉｃ　（プルロニン
ク）Ｌ１２１．プルロニンク（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｌ１
２２等が使用できる。

その他にもソルビタン、マンニトール、ソルビトール、
シー１ｗ等の炭素数６以上の多価アルコールと、天然油
脂であるラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、イ
ソステアリン酸等の脂肪酸炭素数１２以上の高級脂肪酸
とのエステルである多価アルコール系非イオン性界面活
性剤等が使用できる。

これらの非イオン性界面活性剤は、特に１．２−ジグリ
セリドとＰＯＥアルキルアリールエーテル系界面活性剤
やアルコールエトキシレート系界面活性剤またはブロッ
ク形界面活性剤との組合せが好ましく、本発明にこれら
非イオン性界面活性剤を用いることにより、基質である
１、２−ジグリセリドを水に可溶化せしめることから、
安定に長期間保存でき、かつ水可溶化の形態であるため
に分光学的な測定方法に有効に使用でき、再現性の良好
なリパーゼ活性測定用試薬組成物を捷供できる。

以上例示した非イオン性界面活性剤は、通常ＨＬ８１０
程度以上、好ましくはＨＬＢＩＩ程度以上のものを用い
ることが好ましく、二種以上の非イオン性界面活性剤を
併用してＨＬＢＩＯ程度以上に調製して用いてもよい。

さらに、本発明組成物への含有量は、０．０５％〜０．
２χの範囲で使用するのが好ましい。

次に、本発明で用いるモノグリセリドリパーゼは、基質
として１，２−ジグリセリドから分解されたモノグリセ
リドに対して強ぐ作用しうる酵素であれば何れでもよく
、特に好ましくはバチルス　ステアロサーモフィラスＨ
−１６５（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１６７３）由来のモノグ
リセリドリパーゼ（特開昭６３−２４５６７２号）を用
いればよい。さらに、本発明組成物への含有量は、０．
４ＬＩ／ｍ１〜２．５Ｕ／ｍｊ２の範囲で使用するのが
好ましい。

次に、本発明に用いるグリセロキナーゼは、例えばマグ
ネシウムイオン共存下、グリセロールとアデノシン三リ
ン酸（ＡＴＰ）に作用し、グリセロリン酸とＡＤＰを生
成する酵素であり、例えばストレプトマイセス属、キャ
ンシダ属、バチルス属に由来するもの等がある。これら
の本発明組成物への含有量としては、０．０５１Ｊ／　
ｍｌｌ−３Ｕ／ｗｉｔの範囲で使用するのが好ましい。

次に、本発明に用いるグリセロリン酸オキシダーゼは、
酵素存在下、グリセロリン酸に作用し、ジヒドロキシア
セトンリン酸と過酸化水素を生成する酵素であり、例え
ば、ストレプトコツカス属、ペデイオコッカス属、アエ
ロコツカス属に由来するもの等がある。これらの本発明
組成物への含有量としては、１５１１／　ｍｌ−１５０
υ／■！の範囲で使用するのが好ましい。

次に、本発明に用いるパーオキシダーゼは、過酸化水素
と色原体に作用し、酸化カップリングを起こし、発色物
質と水を生成する酵素であり、例えば、ホースラデイツ
シュに由来するもの等がある。これらの本発明組成物へ
の含有量としては、０．２５Ｌｌ／　ｍＱ〜３υ／閤２
の範囲で使用するのが好ましい。

次に、本発明に用いる水素供与体としては、そのカプラ
ーとともに色原体としてパーオキシダゼと過酸化水素の
共存下酸化カップリングを起こし、発色物質に変換する
ものであればよく、例えばフェノール類として例えばフ
ェノール、２．４−ジクロロフェノール、３．５−ジク
ロロ−２−ヒドロキンベンゼンスルホン酸、ｐ−ヒドロ
キシベンゾエート等、また例えばアニリン誘導体として
例えばＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）１トルイジン（ＴＯＯ３）　、Ｎ−エチル−
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）１′ニリ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）１−アニシジン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）−３，５ジメトキシアニリン等が好ま
しい、これら水素供与体として例示したフェノール類ま
たはアニリン誘導体の本発明組成物への含有量としては
、０．０２％〜０．１χの範囲で使用するのが好ましい
。

次に、本発明に用いる水素供与体に対するカプラーとし
ては、好ましくは水素供与体としてフェノール類または
アニリン誘導体を用いる場合の組み合わせとして４−ア
ミノアンチピリンであり、その他３−メチルー２−ベン
ゾチアゾリンヒドラジン、ジアミノアンチピリン、１−
（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−２，３−ジエチル−
４−アミノ−ピラゾン５．１−（ｐ−アミノ−フェニル
）−２，３−ジメチル−４アミノ−ピラゾロン−５，１
−（ｐ−アセトアミノフェニル）−２，３−ジエチル−
４−アミノ−ピラゾロン−５等を使用することができ、
これらの本発明組成物への含有量としては、０．Ｏ１％
〜０．１１の範囲で使用するのが好ましい。

その他、リパーゼの活性を安定かつ感度良く測定せしめ
るための添加物として、必要に応じ、酵素、活性化剤、
保存剤、安定化剤等を適宜用いることが好ましく、例え
ば塩化カルシウムを組成物全量に対し０．５　ｍＭ〜［
１、塩化マグネシウムを０゜５　＋ｓＭ〜４　ｍＭ、塩
化アンモニウムを０．５　ｍＭ〜６０＋Ｍ、コリパーゼ
を５０／鴎２〜７５０／５ｆｆｉ、デオキシコール酸を
６１１Ｍ〜１５１ｍＭ、ＡＴＰを０．０５ｄ〜１ｍＭ等
を適宜用いればよい。

以上、本発明組成物を用いたリパーゼ活性測定への使用
にあたっては、上述した本発明組成物を構成する物質を
組成として１ｍｆの試薬とし、これを検体を含む被検液
に通常５〜２０μｌを用い、全体量を５０μｌ〜１００
０μｌとした後、好ましくは３７°Ｃで１−１０分間反
応せしめ、吸光度を測定すればよい。

さらに、本発明の組成物は、リパーゼ活性を測定するに
当り、ｌ液で用いても、あるいは２液以上の組成に分け
て用いても適用が可能であるが、２液に分けて測定する
のがより好ましく、また２液以上に分けて測定する場合
″、発色前液あるいは発色時液ならいずれの液に鉄錯体
を添加してもよい。尚、本発明組成物は１液で用いる場
合その系はｐＨ〜９であり特に好ましくはＰＨ８，２で
ある。

次いで、本発明の実施例を挙げて詳しく述べるが、本発
明は何らこれらによって限定されるものではない。

〈実施例〉 ゛実施例１ フェロシアン化カリウムの添加濃度によるビリルビン影
響回避への効果 〔第一試薬）ｐＨ６，８ （東洋醸造社製） グリ七ロリン酸オキシダーゼ ４０、ＯＵ／　ｍｌ Ｌ　コリパーゼ（東洋醸造社製）　　　　４０．ＯＬＩ
／　ｍｌ”　　ＢＥＳＩｌ衝液・　・Ｎ、Ｎ−ビス（２
−ヒＦｕキンエチル）−２−７ミノエタンスＪシ参ン酸 ”Ｌ２−ジグリセリド・・精製した卵黄レシチンにホス
ホリパーゼＣを作用させ て、調製した天然型基質 ′″”Ｔ　ＯＯＳ　　・　・　Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキン−３−スルネプロビル）−一トルイシンナト
リウム 上記第一試薬にフェロシアン化カリウム（和光純薬社製
）の濃度がＯ〜３０　ｎｍｏｌｅ／　ｍ　ｊ！となるよ
うに調製した。

〔第二試薬ＣｐＨ８，７ ｊ　　　　　　　　（＄４化７１龍１ しデオキシコール酸（東洋醸造社製）　　３６．０ｍＭ
””　　ＴＡＰＳＩｌ衝液　・　・　Ｎ−トリス（ヒＦ
Ｏキシエチル）メチル−３７ミノプロパンスルネン　酸 〔検体〕 （Ａ）血清（ビリルビン濃度：　０．２＋Ｉ１ｇ／ｄｉ
）（Ｂ）ビリルビン添加血清（（Ａ）＋ビリルビン２０
ｍｇ／ｄｌ） ビリルビン測定：”総ビリルビン］１−）ＩＡテストワ
コー″　（和光純薬社製） 上記の第一試薬３００μｌに検体（Ａ）　、　（Ｂ）を
それぞれ５μｌ加え、３７℃で５分間反応せしめた後、
第二試薬１００μｌを加え第一試薬と第二試薬の混合比
率を３：１とし、さらに３７°Ｃで反応せしめ、５４６
ｎｍの波長（日立７０５０自動分析機）で３分目から５
分目までの１分間当りの吸光度変化を測定し、リパーゼ
活性を求めた。

その結果、ビリルビン無添加の検体（Ａ）の場合第１図
に示すとうり、フェロシアン化カリウムを添加すること
により多少測定感度が変動するが、フェロシアン化カリ
ウムの添加濃度による影響はみられなかった。

これに対しビリルビン添加の検体（Ｂ）の場合は、第２
図に示すとうり、フェロシアン化カリウム無添加の場合
には測定値に負の影響を与えているが、０．５ｎｍｏｌ
ｅ／量！以上のフェロシアン化カリウムの添加によって
負誤差は改善され、特に１ｒ＋ｍｏｌｅ／ｍ１以上のフ
ェロシアン化カリウムの添加により良好に改善された。

このように、フェロシアン化カリウムの添加が少量では
リパーゼ活性測定に対して充分な改善効果がみられず、
多量すぎると測定値に変化はないが、ブランク値が上昇
したため、好ましいフェロシアン化物イオンの添加濃度
は、１　ｎｍｏｌｅ／　ｍ　ｌ　−ＩＳｎｓｏｌｅ／　
ｔｍ　ｌであった。

実施例２ フェロシアン化カリウムの添加有無のそれぞれの系での
ビリルビン影響回避に対する効果〔試薬〕 実施例１と同様の第一試薬：第二試薬を用い、フェロシ
アン化カリウムを無添加の場合と、第一試薬へフェロシ
アン化カリウムを最終濃度が５ｒ＋ｍｏ１ｅ／ｍｆｆ１
となるように添加した場合とに各試薬を調製した。

〔検体〕

ビリルビン添加血清（血清：ビリルビン・９：１）ビリ
ルビン濃度はＯ〜２０ｔａｇ／ｄ　Ｉに調製（ビリルビ
ン：パ干渉チエツクＡ“（国際試薬社製））上記の試薬
および検体を用い、実施例１と同様の測定法にてリパー
ゼ活性測定を行った。その結果を、フェロシアン化カリ
ウム無添加の場合を一○−０−１５ｒ＋ｍｏｌｅ／　ｍ
　ｌ添加の場合を−・−・−とし、第３図に示した。こ
の結果から、フェロシアン化カリウム無添加の場合は、
検体中のビリルビン濃度を増加していくと測定値への負
の影響は大きくなったが、測定系にフェロシアン化カワ
ウムを５　ｎｍｏｌｅ／　ｓ４添加させた場合は、ビリ
ルビンの負影響が回避され、測定値も回復した。

実施例３ ビリルビン影響回避に対するフェロシアン化カリウムと
アルブミンの相互作用 〔試薬〕 実施例１と同様の第一試薬、第二試薬を用い、第一試薬
にフェロシアン化カリウムおよびアルブミンを下記の濃
度になるように調製した。

（Ａ）フェロシアン化カリウム　無添加アルブミン　無
添加 （Ｂ）フェロシアン化カリウム５ｎｗｂｏｌｅ／　ｖａ
ｌアルブミン　無添加 （Ｃ）フェロシアン化カリウム５ｎｍｏｌｅ／　ｍｌア
ルブミン０．２７２ 〔検体〕 実施例２と同様の検体を用いた。

上記の試薬および検体を用い、実施例１と同様の測定法
にてリパーゼ活性測定を行った。その結果、試薬（Ａ）
の場合を−〇−Ｏ−１試薬（Ｂ）の場合を−・−・−１
試薬（Ｃ）の場合を一〇−〇−とし、第４図に示した。

この結果から、アルブミンの添加によるビリルビン影響
回避の効果に差はみうけられず、アルブミンとヅエロシ
アン化カリウムとの間に相互作用はみられなかった。

実施例４ 鉄錯体（ＥＤＴＡ−Ｆｅ）の添加によるビリルビン影響
回避に対する効果 〔試薬〕 実施例１と同様の第一試薬、第二試薬を用い、鉄錯体と
してＥＤＴＡ−Ｆｅ　（和光純薬社製）を無添加の場合
と、第一試薬へＥＤＴＡ−Ｆｅを最終濃度が１００ｎ１
００ｎ／５ｆｆｉとなるように添加した場合の各試薬を
調製した。

〔検体］ 検体は、実施例１と同様の検体を用いた。

上記の試薬および検体を用い、リパーゼ活性測定を行っ
た。

その結果、各々におけるリパーゼ活性は第１表に示すと
うりであった。

第１表 この結果から、鉄錯体の添加によるビリルビン影響回避
の効果は、測定値が１００χは回復しないものの、フェ
ロシアン化物イオンを添加した場合と同様の効果が認め
られた。すなわち、鉄錯体の濃度が増加すると、ブラン
ク値の上昇、測定感度の低下等があるので、添加濃度は
、１０ｎｍｏｌｅ／　ｍｊｉ！〜２５０ｎｌＩｏＩｅ／
ｌＩｌが好ましいと認めらレタ。

〈発明の効果〉 上記の通り、本発明は、基質として１．２−ジグリセリ
ド、非イオン性界面活性剤、モノグリセリド゛リパーゼ
、グリセロールキナーゼ、グリ七ロリン酸オキシダーゼ
、水素供与体とそのカプラー、パーオキシダーゼ、鉄錯
体等を含有するリパーゼ活性測定用試薬組成物であり、
測定系におけるビリルビン影響を回避するために鉄錯体
である例えばフェロシアン化物イオンまたはＥＤＴＡ−
Ｆｅイオンを添加することにより、アルブミンの共存に
よるビリルビン影響回避の効果改善を何ら必要とするこ
となく、この鉄錯体により測定系における生体内ビリル
ビン影響を良好に回避することを可能とした有用なリパ
ーゼ活性測定用試薬組成物を提供する。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１でのビリルビン無添加検体におけるフ
ェロシアン化カリウム添加によるビリルビン影響回避効
果を示し、第２図は同様に実施例１でのビルリビン添加
検体におけるフェロシアン化カリウム添加による効果を
示す、第３図は実施例２でのフェロシアン化カリウムの
添加有無による効果を示し、第４図は実施例３でのビリ
ルビン影響回避に対するフェロシアン化カリウムとアル
ブミンの相互作用を示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも１，２−ジグリセリド、非イオン性界
   面活性剤、モノグリセリドリパーゼ、グリセロールキナ
   ーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、水素供与体とその
   カプラー、パーオキシダーゼ、鉄錯体を含有することを
   特徴とするリパーゼ活性測定用試薬組成物。
2. （２）鉄錯体として、フェロシアン化物イオンを１ｎｍ
   ｏｌｅ／ｍｌ〜１５ｎｍｏｌｅ／ｍｌを含有する請求項
   第１項記載の試薬組成物。
3. （３）鉄錯体として、エチレンジアミン四酢酸鉄イオン
   を１０ｎｍｏｌｅ／ｍｌ〜２５０ｎｍｏｌｅ／ｍｌ含有
   する請求項第１項記載の試薬組成物。
4. （４）水素供与体とそのカプラーが、フェノール類また
   はアニリン誘導体と４−アミノアンチピリンの組み合わ
   せである請求項第１項記載の試薬組成物。
5. （５）少なくとも組成物全量に対し１，２−ジグリセリ
   ドの含量が０．３ｍＭ〜１．０ｍＭ、非イオン性界面活
   性剤の含量が０．０５％〜０．２％、モノグリセリドリ
   パーゼの含量が０．４Ｕ／ｍｌ〜２．５Ｕ／ｍｌ、グリ
   セロールキナーゼの含量が０．０５Ｕ／ｍＩｌ〜３Ｕ／
   ｍｌ、グリセロリン酸オキシダーゼの含量が１５Ｕ／ｍ
   ｌ〜１５０Ｕ／ｍｌ、フェノール類またはアニリン誘導
   体の含量が０．０２％〜０．１％、４−アミノアンチピ
   リンの含量が０．０１％〜０．１％、パーオキシダーゼ
   の含量が０．２５Ｕ／ｍｌ〜３Ｕ／ｍｌである請求項第
   １項記載の試薬組成物。