JP4620881B2 - アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法および生体成分測定用試薬 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法および生体成分測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アスコルビン酸はその強い還元力により食品の酸化を防止する目的で食品に添加されることが多い。また、これを摂取すれば生体中の血清、尿などでその濃度が高まることが知られている。したがって、アスコルビン酸が添加された食品の分析や血清、尿などの生体試料中成分を分析する臨床検査の分野において測定試料中のアスコルビン酸により測定が妨害されることが知られており、この影響の回避方法が種々報告されている。その中でもアスコルビン酸オキシダーゼを測定試薬中に含有させ試料由来のアスコルビン酸を酸化することで影響を回避する方法がよく用いられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
アスコルビン酸オキシダーゼは溶液中では容易に失活しやすいため、試薬保存中にアスコルビン酸の分解能が低下する欠点があった。アスコルビン酸の分解能の低下を防止する手段として、アスコルビン酸オキシダーゼに種々の安定化剤を添加することが行われている。安定化剤の例としては、硼酸、シュクロースなどがあげられ、これらの方法によってアスコルビン酸オキシダーゼの溶液中での安定性は改善される。しかし、アスコルビン酸の測定への干渉を完全に回避するには至らず、液状で長期間アスコルビン酸の干渉を回避する能力を維持することは困難であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記現状に鑑み、長期間にわたってアスコルビン酸の測定値への干渉を回避することが可能な方法を鋭意検討した結果、アスコルビン酸オキシダーゼとカルボン酸および／またはその塩（以後、カルボン酸（塩）と略する）を共存させることによって、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化され、上記課題を解決するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、アスコルビン酸オキシダーゼを含有する溶液にカルボン酸（塩）類の１種または２種以上を配合させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法に関する。また、本発明は、アスコルビン酸オキシダーゼとカルボン酸（塩）類の１種または２種以上とを含有する生体成分測定用試薬に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明に使用するアスコルビン酸オキシダーゼとしては、特に限定されないが、例えば、カボチャ、キュウリなどのウリ科植物から得られたもの、微生物由来のものを挙げることができる。また、これらが遺伝子組替え技術により作製されたものや化学修飾されたものなどについても含まれる。
【０００７】
本発明に用いられるカルボン酸（塩）としては、ヒドロキシポリカルボン酸（塩）としてはＬ−酒石酸およびＬ−酒石酸ナトリウム、Ｌ−酒石酸カリウム、Ｌ−酒石酸ナトリウムカリウムなどの酒石酸（塩）、クエン酸、クエン酸ナトリウムなどのクエン酸（塩）があげられる。ジカルボン酸としては、コハク酸、3、3−ジメチルグルタル酸、アジピン酸、α−ケトグルタル酸などのジカルボン酸およびその塩類があげられる。
【０００８】
モノカルボン酸としては、ピルビン酸、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸リチウム、プロピオン酸などのモノカルボン酸およびその塩類があげられる。これらカルボン酸（塩）は単独であるいは２種類以上を組み合わせて使用できるが、好ましくはピルビン酸、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸リチウムなどのピルビン酸（塩）である。
【０００９】
本発明の生体成分測定用試薬は、少なくともアスコルビン酸オキシダーゼおよびカルボン酸（塩）類を含む溶液であれば、試薬構成は一液でも二液以上でもよくあるいは凍結乾燥形態でもよい。
この試薬のカルボン酸（塩）の含有濃度としては、０.１重量％以上であればアスコルビン酸オキシダーゼ安定化効果が得られるが、好ましくは０.１〜１０重量％、さらに好ましくは０.５〜５.０重量％である。
【００１０】
本発明において対象となり得る生体成分測定用試薬としては、とくに限定されるものではないが、公知の酸化酵素を用いる系があげられる。具体例をあげると、ビリルビンオキシダーゼを用いた直接型あるいは総ビリルビン測定試薬、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略する）を用いたグルコース測定試薬、コレステロールオキシダーゼとＰＯＤを用いた遊離コレステロール測定試薬、グリセロールキナーゼとグリセロール−３−リン酸オキシダーゼとＰＯＤを用いた中性脂肪測定試薬、ホスホリパーゼＤとコリンオキシダーゼとＰＯＤを用いたリン脂質測定試薬、クレアチンアミジノヒドラーゼとザルコシンオキシダーゼとＰＯＤを用いたクレアチニン測定試薬、ウリカーゼとＰＯＤを用いた尿酸測定試薬などである。
【００１１】
以下、直接型ビリルビン測定用試薬に関して具体的に説明する。この試薬に用いる緩衝液はｐＨ６.５以下が適当であり、望ましくはｐＨ４.７〜６.５までの間に緩衝能を持つものであればなんでもよく、例えば、フタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液、リンゴ酸−水酸化ナトリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液等が挙げられる。緩衝液の濃度は１０〜５００mMが適し、好ましくは３０〜２００mMである。
【００１２】
ビリルビンオキシダーゼとしては、例えば、ミロセシウム属またはトラキデルマ属に属する菌株から得られる酵素が挙げられ、その使用量は０.０１〜２００単位／mlが適し、好ましくは０.１〜２０単位／mlである。本発明に使用するアスコルビン酸オキシダーゼとしては、特に限定されないが、例えば、カボチャ、キュウリなどのウリ科植物から得られたもの、微生物由来のものを挙げることができる。また、これらが遺伝子組替え技術により作製されたものや化学修飾されたものなどについても含まれる。その濃度は、０.１〜１００単位／mlが適当である。
【００１３】
本発明の測定用試薬に用いられるカルボン酸（塩）としては、ヒドロキシポリカルボン酸（塩）としてはＬ−酒石酸およびＬ−酒石酸ナトリウム、Ｌ−酒石酸カリウム、Ｌ−酒石酸ナトリウムカリウムなどの酒石酸（塩）、クエン酸、クエン酸ナトリウムなどのクエン酸（塩）があげられる。ジカルボン酸としては、コハク酸、３,３−ジメチルグルタル酸、アジピン酸、α−ケトグルタル酸などのジカルボン酸およびその塩類があげられる。
【００１４】
モノカルボン酸としては、ピルビン酸、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸リチウム、プロピオン酸などのモノカルボン酸およびその塩類があげられる。これらカルボン酸（塩）は単独であるいは２種類以上を組み合わせて使用できるが、好ましくはピルビン酸、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸リチウムなどのピルビン酸（塩）である。この試薬のカルボン酸（塩）の含有濃度としては、０.１重量％以上であればアスコルビン酸オキシダーゼ安定化効果が得られるが、好ましくは０.１〜１０重量％、さらに好ましくは０.５〜５.０重量％である。
【００１５】
その他の成分として、直接型ビリルビンの分別に必要なアルカリ金属等のフッ化物塩やチオール基を有する化合物、サンプルに由来する測定誤差要因を解消したり正確な測定のためにp−トルエンスルホン酸、安息香酸等の芳香族カルボン酸、界面活性剤、アラニン、セリン等のアミノ酸、マンニトール等の糖類、ポリエチレングリコール等のポリオール類、ＮaＣl等の塩類、アルブミン等の蛋白質、防腐剤等を添加することができる。
【００１６】
本発明においては、前記成分を適宜選択して常法により混合することにより、直接型ビリルビン測定用試薬を得ることができる。好ましい具体例において、第１液は、pＨ４.７〜６.５に調製されたフタル酸緩衝液１０〜２００mM、トリトンＸ−１００ ０.００５〜０.５重量％、アラニン５〜１００mM、p−トルエンスルホン酸１〜１００mM、人血清アルブミン０.００１〜１重量％、フッ化ナトリウム０.０５〜２００mMおよびＮ−アセチルシステイン０.０２〜１０mMを含み、第２液は、アスコルビン酸オキシダーゼ０.１〜１００単位／ml、カルボン酸（塩）０.１〜１０重量％、ビリルビンオキシダーゼ０.０５〜１００単位／mlおよびｐＨ４.７〜６.５に調製されたフタル酸緩衝液１０〜２００mMを含む。
【００１７】
かくして得られた本発明の試薬(２液系)を用いて直接型ビリルビンを測定する具体的な方法を以下に示す。まず、前記の直接型ビリルビン測定用第１液(０.６ml)に各種ビリルビンを含む検体(血清等)を適量加え、分光光度計のセル室内にて予備加温後、４６０nmにおける吸光度を測定する。これに、前記の直接型ビリルビン測定用第２液(０.１５ml)を添加し、１〜１０分間反応させて直接型ビリルビンのみを酸化させた後、４６０nmにおける吸光度を測定し、この値と先に測定した吸光度の液量補正値とから吸光度変化量(Ａ)を求める。次に、既知濃度の直接型ビリルビンを含む標準物質を同様に測定し吸光度変化量(Ｂ)を求める。検体を作用させて求めた吸光度変化量および標準物質を作用させて求めた吸光度変化量から、次式により検体中の直接型ビリルビン含量を求めることができる。
検体中の直接型ビリルビン濃度(mg／dl)
＝(Ａ／Ｂ)×標準物質中の直接型ビリルビン濃度(mg／dl)
なお、検体量としては０.００５〜０.１mlが好ましい。測定波長は４６０nmに限定されるものではなく、４００〜４８０nmの任意の波長を選ぶことができる。また、第１液、第２液、検体の液量は適宜変化させることができる。
【００１８】
次に、総ビリルビン測定用試薬に関して説明する。この試薬に用いる緩衝液はｐＨ７〜１１が適当で、望ましくはｐＨ７.５〜１０までの間に緩衝能を持つものであればなんでもよく、例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ緩衝液等が挙げられる。緩衝液の濃度は１０〜５００mMが適し、好ましくは３０〜２００mMである。
【００１９】
ビリルビンオキシダーゼとしては、例えば、ミロセシウム属またはトラキデルマ属に属する菌株から得られる酵素が挙げられ、その必要量は０.０１〜２００単位／mlが適し、好ましくは０.１〜２０単位／mlである。
【００２０】
その他の成分として、チオール基を有する化合物、p−トルエンスルホン酸、安息香酸等の芳香族カルボン酸、界面活性剤、アラニン、セリン等のアミノ酸、マンニトール等の糖類、ポリエチレングリコール等のポリオール類、ＮaＣl等の塩類、アルブミン等の蛋白質等を必要に応じて添加することができる。
【００２１】
本発明においては、前記成分を適宜選択して常法により混合することにより、総ビリルビン測定用試薬を得ることができる。
【００２２】
次にビリルビン以外の生体成分を測定するための測定用試薬、すなわち、グルコースオキシダーゼとＰＯＤを用いたグルコース測定試薬、コレステロールオキシダーゼとＰＯＤを用いた遊離コレステロール測定試薬、グリセロールキナーゼとグリセロール−３−リン酸オキシダーゼとＰＯＤを用いた中性脂肪測定試薬、ホスホリパーゼＤとコリンオキシダーゼとＰＯＤを用いたリン脂質測定試薬、クレアチンアミジノヒドラーゼとザルコシンオキシダーゼとＰＯＤを用いたクレアチニン測定試薬、ウリカーゼとＰＯＤを用いた尿酸測定試薬などのようにオキシダーゼとＰＯＤと組み合わせ発色反応を行う原理の試薬は、オキシダーゼ、ＰＯＤ、色原体、カプラーとアスコルビン酸オキシダーゼ、カルボン酸（塩）からなる。
【００２３】
ここで用いられるＰＯＤとしては、西洋ワサビ由来のものを用いることができる。また各オキシダーゼにより生じる過酸化水素の呈色には色原体とカプラーが必要であり、色原体としてはＮ-エチル-Ｎ-(２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル)-３,５-ジメチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ-アセチルシステイン、フェノール、２−クロロフェノール、４−クロロフェノール、２,４−ジクロロフェノールなどのフェノール誘導体、もしくはアニリン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ,Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ,Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ,Ｎ−ジエチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ'−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジンなどのアニリン誘導体などが挙げられる。また，カプラーとしては、４−アミノアンチピリン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンなどが挙げられる。オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、色原体、カプラーの添加量は測定に支障をきたさない限り特に限定されるものではない。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例をもって詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、実施例中、略号は以下のものを示す。
ＴＯＯＳ：Ｎ-エチル-Ｎ-(２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル)-３,５-ジメチルアニリン、
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸、
ＢＥＳ：Ｎ,Ｎ'-ビス（２−ヒドロキシエチル) -２-アミノエタンスルホン酸、
ＭＥＳ：２−（モルフォリノ）エタンスルホン酸、
ＴＥＳ：Ｎ-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-２-アミノエタンスルホン酸、
ＴＡＰＳ：Ｎ-トリス（ヒドロキシメチル）メチル-３-アミノプロパンスルホン酸、
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、
【００２５】
実施例 １：血清中の遊離コレステロールの測定
下記試薬Ａ〜Ｃを調製した。
試薬Ａ：
（第１試薬）ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２.０ｍＭ、ＭＥＳ １００ｍＭ、ｐＨ６.３
（第２試薬） コレステロールオキシダーゼ １.５Ｕ／ｍｌ、４-アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、ＭＥＳ １００ｍＭ、ｐＨ６.３
試薬Ｂ：
（第１試薬）ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２.０ｍＭ，ＭＥＳ １００ｍＭ、ｐＨ６.３、アスコルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ （カボチャ由来）
（第２試薬）コレステロールオキシダーゼ １.５Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、ＭＥＳ １００ｍＭ、ｐＨ６.３
試薬Ｃ：
（第１試薬）ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２.０ｍＭ，ＭＥＳ １００ｍＭ、ｐＨ６.３、アスコルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ、ピルビン酸ナトリウム １.０％
（第２試薬） コレステロールオキシダーゼ １.５Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、ＭＥＳ １００ｍＭ、ｐＨ６.３
さらに試薬Ａ〜Ｃを、１年間１０℃で静置したものをそれぞれ試薬Ａ'〜Ｃ'とした。
【００２６】
サンプルとしては下記サンプル１〜６を用意した。
（サンプル１）人プール血清：蒸留水＝９：１、
（サンプル２）人プール血清：２００mg/dlアスコルビン酸水溶液＝９：１、
（サンプル３）人プール血清：４００mg/dlアスコルビン酸水溶液＝９：１、
（サンプル４）人プール血清：６００mg/dlアスコルビン酸水溶液＝９：１、
（サンプル５）人プール血清：８００mg/dlアスコルビン酸水溶液＝９：１、
（サンプル６）人プール血清：１０００mg/dlアスコルビン酸水溶液＝９：１。
【００２７】
各サンプル４μｌに、サンプル１〜６のそれぞれに対応して、各試薬Ａ〜Ｃ'（Ａ、Ａ'、Ｂ、Ｂ'、ＣおよびＣ'を意味する；以下同様）の第１試薬を２００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、試薬Ａ〜Ｃ'の第２試薬を１００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとに、あらかじめ標準液を用いて作成した検量線から遊離コレステロール濃度を求めた。その結果を表１に示す。表中、数字は単位 mg/dlを示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】
表１から明らかなように、試薬ＡおよびＡ'ではアスコルビン酸の影響を受けて遊離コレステロールを正確に測定できない。またアスコルビン酸オキシダーゼのみを含む試薬Ｂでは１０℃、１年間保存処理しない場合にはアスコルビン酸の干渉回避が可能であるが、長期間保存した試薬Ｂ'では高濃度のアスコルビン酸の干渉を回避する能力が失われていた。しかし本発明の試薬Ｃでは保存する前後いずれにおいてもアスコルビン酸濃度が高いサンプルでもその影響を回避することできる。
【００３０】
実施例 ２：血清中の尿酸の測定
下記試薬Ｄ〜Ｆを調製した。
試薬Ｄ：
（第１試薬）ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２.０ｍＭ、ＢＥＳ１００ｍＭ、ｐＨ７.０、
（第２試薬）ウリカーゼ １Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、ＢＥＳ１００ｍＭ、ｐＨ７.０、
試薬Ｅ：
（第１試薬）ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２.０ｍＭ、ＢＥＳ１００ｍＭ、ｐＨ７.０、アスコルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ（Acremonium sp.由来）
（第２試薬）ウリカーゼ １Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、ＢＥＳ１００ｍＭ、ｐＨ７.０
試薬Ｆ：
（第１試薬）ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２.０ｍＭ、ＢＥＳ１００ｍＭ、ｐＨ７.０、アスコルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ（Acremonium sp.由来）、ピルビン酸ナトリウム ０.２％
（第２試薬）ウリカーゼ １Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン、０.６ｍＭＢＥＳ１００ｍＭ、ｐＨ７.０
また実施例１と同様に、それぞれの試薬を１０℃、１年間静置した試薬Ｄ'〜Ｆ'を用意した。サンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００３１】
各サンプル６μｌに、サンプル１〜６のそれぞれに対応して、各試薬Ｄ〜Ｆ'の第１試薬を２００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、各試薬Ｄ〜Ｆ'の第２試薬を１００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとに、あらかじめ標準液を用いて作成した検量線から尿酸濃度を求めた。その結果を表２に示す。表中、数字は単位 mg/dlを示す。
【００３２】
【表２】
【００３３】
表２から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、本発明の試薬Ｆは長期間にわたって妨害物質の干渉を回避することできる。
【００３４】
実施例 ３：中性脂肪の測定
下記試薬Ｇ〜Ｉを調製した。
試薬Ｇ：
（第１試薬）グリセロールキナーゼ １Ｕ／ｍｌ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ ５Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２ｍＭ、ＡＴＰ ３ｍＭ、ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ，ｐＨ７.０、
（第２試薬）リポプロテインリパーゼ ３Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ，ｐＨ７.０、
試薬Ｈ：
（第１試薬）グリセロールキナーゼ １Ｕ／ｍｌ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ ５Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２ｍＭ、ＡＴＰ ３ｍＭ、ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ，ｐＨ７.０、アスコルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ（Acremonium sp.由来）
（第２試薬）リポプロテインリパーゼ ３Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ７.０
試薬Ｉ：
（第１試薬）グリセロールキナーゼ １Ｕ／ｍｌ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ ５Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２ｍＭ、ＡＴＰ ３ｍＭ、ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ７.０、アスコルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ（Acremonium sp.由来）、ピルビン酸ナトリウム １.０％
（第２試薬）リポプロテインリパーゼ ３Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、 ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ，ｐＨ７.０
実施例１と同じく、１０℃、１年間保存した試薬Ｇ'〜Ｉ'を用意した。またサンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００３５】
各サンプル３μｌに、サンプル１〜６のそれぞれに対応して、試薬Ｇ〜Ｉ'の第１試薬を２５０μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、試薬Ｇ〜Ｉ'の第２試薬を１２５μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとにあらかじめ標準液を用いて作成した検量線から中性脂肪濃度を求めた。その結果を表３に示す。表中の数値は単位 mg/dlを示す。
【００３６】
【表３】
【００３７】
表３から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、本発明の試薬Ｉは長期間にわたって妨害物質の影響を回避することできる。
【００３８】
実施例 ４：血清リン脂質の測定
下記試薬Ｊ〜Ｌを調製した。
試薬Ｊ：
（第１試薬）ホスフォリパーゼＤ ０.５Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２ｍＭ、トリス緩衝液 ５０ｍＭ
（第２試薬）コリンオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、トリス緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ７.７
【００３９】
試薬Ｋ：
（第１試薬）ホスフォリパーゼＤ ０.５Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２ｍＭ、トリス緩衝液 ５０ｍＭ，ｐＨ７.７、アスコルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ（Acremonium sp.由来）
（第２試薬）コリンオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、トリス緩衝液 ５０ｍＭ，ｐＨ７.７
【００４０】
試薬Ｌ：
（第１試薬）ホスフォリパーゼＤ ０.５Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２ｍＭ、トリス緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ７.７、アスコルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ、ピルビン酸ナトリウム １.０％
（第２試薬）コリンオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、トリス緩衝液、ｐＨ７.７
実施例１と同じく、１０℃、1年間保存した試薬Ｊ'〜Ｌ'を用意した。
５０ｍＭサンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００４１】
各サンプル３μｌに、サンプル１〜６のそれぞれに対応して、試薬Ｊ〜Ｌ'の第１試薬を２５０μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、試薬Ｊ〜Ｌ'の第２試薬を１２５μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとにあらかじめ標準液を用いて作成した検量線からリン脂質濃度を求めた。その結果を表４に示す。表中の数値は単位 mg/dlを示す。
【００４２】
【表４】
【００４３】
表４から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、本発明の試薬Ｌは長期間にわたって妨害物質の影響を回避することできる。
【００４４】
実施例 ５：血清クレアチニンの測定
下記試薬Ｍ〜Ｏを調製した。
試薬Ｍ：
（第１試薬）クレアチンアミジノヒドロラーゼ １００Ｕ／ｍｌ、ザルコシンオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２ｍＭ、ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ８.０
（第２試薬）
クレアチニンアミドヒドロラーゼ ３００Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ８.０
【００４５】
試薬Ｎ：
（第１試薬）クレアチンアミジノヒドロラーゼ １００Ｕ／ｍｌ、ザルコシンオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２ｍＭ、ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ８.０、アスコルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ（Acremonium sp.由来）
（第２試薬）クレアチニンアミドヒドロラーゼ ３００Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、 ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ８.０
【００４６】
試薬Ｏ：
（第１試薬）クレアチンアミジノヒドロラーゼ １００Ｕ／ｍｌ、ザルコシンオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２ｍＭ、ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ８.０、アスコルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ（Acremonium sp.由来）、ピルビン酸ナトリウム １.０％
（第２試薬）クレアチニンアミドヒドロラーゼ ３００Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ ＴＡＰＳ緩衝液、ｐＨ８.０
実施例１と同じく、１０℃、1年間保存した試薬Ｍ'〜Ｏ'を用意した。
５０ｍＭサンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００４７】
各サンプル６μｌに、サンプル１〜６のそれぞれに対応して、試薬Ｍ〜Ｏ'の第１試薬を３００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、試薬Ｍ〜Ｏ'の第２試薬を１００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとにあらかじめ標準液を用いて作成した検量線からクレアチニン濃度を求めた。その結果を表５に示す。表中、数値は単位 mg/dlを示す。
【００４８】
【表５】
【００４９】
表５から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、本発明の試薬Ｏは長期間にわたって妨害物質の影響を回避することできる。
【００５０】
実施例 ６：血清直接ビリルビンの測定
下記試薬Ｐ〜Ｔを調製した。
試薬Ｐ：
（第１試薬）フタル酸水素カリウム緩衝液 １２０ｍＭ，ｐＨ５.５、 Ｎ-アセチルシステイン ２.５ｍＭ ＥＤＴＡ ０.１ｍＭ、 p-トルエンスルホン酸 ５０ｍＭ、 ＮａＦ ２.５ｍＭ
（第２試薬）フタル酸水素カリウム緩衝液 １２０ｍＭ，ｐＨ５.５、ビリルビンオキシダーゼ ０.１ Ｕ／ｍＬ、アスコルビン酸オキシダーゼ４Ｕ／ｍＬ
【００５１】
試薬Ｑ：
（第１試薬）フタル酸水素カリウム緩衝液 １２０ｍＭ，ｐＨ５.５、 Ｎ-アセチルシステイン ２.５ｍＭ ＥＤＴＡ ０.１ｍＭ、 p-トルエンスルホン酸 ５０ｍＭ、 ＮａＦ ２.５ｍＭ
（第２試薬）フタル酸水素カリウム緩衝液 １２０ｍＭ，ｐＨ５.５、ビリルビンオキシダーゼ ０.１ Ｕ／ｍＬ、アスコルビン酸オキシダーゼ ４Ｕ／ｍＬ（Acremonium sp.由来）、ピルビン酸ナトリウム ０.５％
試薬Ｒ：
（第１試薬）フタル酸水素カリウム緩衝液 １２０ｍＭ、ｐＨ５.５、 Ｎ-アセチルシステイン ２.５ｍＭ ＥＤＴＡ ０.１ｍＭ、p-トルエンスルホン酸 ５０ｍＭ、ＮａＦ ２.５ｍＭ
（第２試薬）フタル酸水素カリウム緩衝液 １２０ｍＭ、ｐＨ５.５、ビリルビンオキシダーゼ ０.１ Ｕ／ｍＬ、アスコルビン酸オキシダーゼ ４Ｕ／ｍＬ（Acremonium sp.由来）、ピルビン酸ナトリウム １.０％
【００５２】
試薬Ｓ：
（第１試薬）フタル酸水素カリウム緩衝液 １２０ｍＭ、ｐＨ５.５、Ｎ-アセチルシステイン ２.５ｍＭ ＥＤＴＡ ０.１ｍＭ、p-トルエンスルホン酸 ５０ｍＭ、ＮａＦ ２.５ｍＭ
（第２試薬）フタル酸水素カリウム緩衝液 １２０ｍＭ、ｐＨ５.５、ビリルビンオキシダーゼ ０.１Ｕ／ｍＬ、アスコルビン酸オキシダーゼ ４Ｕ／ｍＬ（Acremonium sp.由来）、ピルビン酸ナトリウム ２.０％
試薬Ｔ：
（第１試薬）フタル酸水素カリウム緩衝液 １２０ｍＭ、ｐＨ５.５、Ｎ-アセチルシステイン ２.５ｍＭ ＥＤＴＡ ０.１ｍＭ、p-トルエンスルホン酸 ５０ｍＭ、ＮａＦ ２.５ｍＭ
（第２試薬）フタル酸水素カリウム緩衝液 １２０ｍＭ、ｐＨ５.５、ビリルビンオキシダーゼ ０.１ Ｕ／ｍＬ、アスコルビン酸オキシダーゼ ４Ｕ／ｍＬ（Acremonium sp.由来）、ピルビン酸ナトリウム ５.０％
実施例１と同様に、２５℃、１ヶ月静置した試薬Ｐ'〜Ｔ'を調製した。サンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００５３】
サンプル１４μｌに、サンプル１〜６のそれぞれに対応して、各試薬Ｐ〜Ｔ'の第１試薬を２８０μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、各試薬Ｐ〜Ｔ'の第２試薬を７０μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に４５０ nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとに、あらかじめ標準液を用いて作成した検量線からビリルビン濃度を求めた。
その結果を表７に示す。表中、数字は単位 mg/dlを示す。
【００５４】
【表６】
【００５５】
表６から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、本発明の試薬Ｑ〜Ｔは長期間にわたってその影響を回避して血清直接ビリルビンを測定することができる。
【００５６】
【発明の効果】
本発明によれば、カルボン酸を添加するという非常に簡単で、経済的な方法により、アスコルビン酸オキシダーゼを液状で長期間安定化させることができ、サンプルに含まれるアスコルビン酸の影響をうけずに目的の生体液中の成分を正確に定量することができるようになる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、アスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法および生体成分測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アスコルビン酸はその強い還元力により食品の酸化を防止する目的で食品に添加されることが多い。また、これを摂取すれば生体中の血清、尿などでその濃度が高まることが知られている。したがって、アスコルビン酸が添加された食品の分析や血清、尿などの生体試料中成分を分析する臨床検査の分野において測定試料中のアスコルビン酸により測定が妨害されることが知られており、この影響の回避方法が種々報告されている。その中でもアスコルビン酸オキシダーゼを測定試薬中に含有させ試料由来のアスコルビン酸を酸化することで影響を回避する方法がよく用いられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
アスコルビン酸オキシダーゼは溶液中では容易に失活しやすいため、試薬保存中にアスコルビン酸の分解能が低下する欠点があった。アスコルビン酸の分解能の低下を防止する手段として、アスコルビン酸オキシダーゼに種々の安定化剤を添加することが行われている。安定化剤の例としては、硼酸、シュクロースなどがあげられ、これらの方法によってアスコルビン酸オキシダーゼの溶液中での安定性は改善される。しかし、アスコルビン酸の測定への干渉を完全に回避するには至らず、液状で長期間アスコルビン酸の干渉を回避する能力を維持することは困難であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記現状に鑑み、長期間にわたってアスコルビン酸の測定値への干渉を回避することが可能な方法を鋭意検討した結果、アスコルビン酸オキシダーゼとカルボン酸および／またはその塩（以後、カルボン酸（塩）と略する）を共存させることによって、アスコルビン酸オキシダーゼが安定化され、上記課題を解決するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、アスコルビン酸オキシダーゼを含有する溶液にカルボン酸（塩）類の１種または２種以上を配合させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法に関する。また、本発明は、アスコルビン酸オキシダーゼとカルボン酸（塩）類の１種または２種以上とを含有する生体成分測定用試薬に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明に使用するアスコルビン酸オキシダーゼとしては、特に限定されないが、例えば、カボチャ、キュウリなどのウリ科植物から得られたもの、微生物由来のものを挙げることができる。また、これらが遺伝子組替え技術により作製されたものや化学修飾されたものなどについても含まれる。
【０００７】
本発明に用いられるカルボン酸（塩）としては、ヒドロキシポリカルボン酸（塩）としてはＬ−酒石酸およびＬ−酒石酸ナトリウム、Ｌ−酒石酸カリウム、Ｌ−酒石酸ナトリウムカリウムなどの酒石酸（塩）、クエン酸、クエン酸ナトリウムなどのクエン酸（塩）があげられる。ジカルボン酸としては、コハク酸、3、3−ジメチルグルタル酸、アジピン酸、α−ケトグルタル酸などのジカルボン酸およびその塩類があげられる。
【０００８】
モノカルボン酸としては、ピルビン酸、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸リチウム、プロピオン酸などのモノカルボン酸およびその塩類があげられる。これらカルボン酸（塩）は単独であるいは２種類以上を組み合わせて使用できるが、好ましくはピルビン酸、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸リチウムなどのピルビン酸（塩）である。
【０００９】
本発明の生体成分測定用試薬は、少なくともアスコルビン酸オキシダーゼおよびカルボン酸（塩）類を含む溶液であれば、試薬構成は一液でも二液以上でもよくあるいは凍結乾燥形態でもよい。
この試薬のカルボン酸（塩）の含有濃度としては、０.１重量％以上であればアスコルビン酸オキシダーゼ安定化効果が得られるが、好ましくは０.１〜１０重量％、さらに好ましくは０.５〜５.０重量％である。
【００１０】
本発明において対象となり得る生体成分測定用試薬としては、とくに限定されるものではないが、公知の酸化酵素を用いる系があげられる。具体例をあげると、ビリルビンオキシダーゼを用いた直接型あるいは総ビリルビン測定試薬、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略する）を用いたグルコース測定試薬、コレステロールオキシダーゼとＰＯＤを用いた遊離コレステロール測定試薬、グリセロールキナーゼとグリセロール−３−リン酸オキシダーゼとＰＯＤを用いた中性脂肪測定試薬、ホスホリパーゼＤとコリンオキシダーゼとＰＯＤを用いたリン脂質測定試薬、クレアチンアミジノヒドラーゼとザルコシンオキシダーゼとＰＯＤを用いたクレアチニン測定試薬、ウリカーゼとＰＯＤを用いた尿酸測定試薬などである。
【００１１】
以下、直接型ビリルビン測定用試薬に関して具体的に説明する。この試薬に用いる緩衝液はｐＨ６.５以下が適当であり、望ましくはｐＨ４.７〜６.５までの間に緩衝能を持つものであればなんでもよく、例えば、フタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液、リンゴ酸−水酸化ナトリウム緩衝液、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液等が挙げられる。緩衝液の濃度は１０〜５００mMが適し、好ましくは３０〜２００mMである。
【００１２】
ビリルビンオキシダーゼとしては、例えば、ミロセシウム属またはトラキデルマ属に属する菌株から得られる酵素が挙げられ、その使用量は０.０１〜２００単位／mlが適し、好ましくは０.１〜２０単位／mlである。本発明に使用するアスコルビン酸オキシダーゼとしては、特に限定されないが、例えば、カボチャ、キュウリなどのウリ科植物から得られたもの、微生物由来のものを挙げることができる。また、これらが遺伝子組替え技術により作製されたものや化学修飾されたものなどについても含まれる。その濃度は、０.１〜１００単位／mlが適当である。
【００１３】
本発明の測定用試薬に用いられるカルボン酸（塩）としては、ヒドロキシポリカルボン酸（塩）としてはＬ−酒石酸およびＬ−酒石酸ナトリウム、Ｌ−酒石酸カリウム、Ｌ−酒石酸ナトリウムカリウムなどの酒石酸（塩）、クエン酸、クエン酸ナトリウムなどのクエン酸（塩）があげられる。ジカルボン酸としては、コハク酸、３,３−ジメチルグルタル酸、アジピン酸、α−ケトグルタル酸などのジカルボン酸およびその塩類があげられる。
【００１４】
モノカルボン酸としては、ピルビン酸、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸リチウム、プロピオン酸などのモノカルボン酸およびその塩類があげられる。これらカルボン酸（塩）は単独であるいは２種類以上を組み合わせて使用できるが、好ましくはピルビン酸、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸リチウムなどのピルビン酸（塩）である。この試薬のカルボン酸（塩）の含有濃度としては、０.１重量％以上であればアスコルビン酸オキシダーゼ安定化効果が得られるが、好ましくは０.１〜１０重量％、さらに好ましくは０.５〜５.０重量％である。
【００１５】
その他の成分として、直接型ビリルビンの分別に必要なアルカリ金属等のフッ化物塩やチオール基を有する化合物、サンプルに由来する測定誤差要因を解消したり正確な測定のためにp−トルエンスルホン酸、安息香酸等の芳香族カルボン酸、界面活性剤、アラニン、セリン等のアミノ酸、マンニトール等の糖類、ポリエチレングリコール等のポリオール類、ＮaＣl等の塩類、アルブミン等の蛋白質、防腐剤等を添加することができる。
【００１６】
本発明においては、前記成分を適宜選択して常法により混合することにより、直接型ビリルビン測定用試薬を得ることができる。好ましい具体例において、第１液は、pＨ４.７〜６.５に調製されたフタル酸緩衝液１０〜２００mM、トリトンＸ−１００ ０.００５〜０.５重量％、アラニン５〜１００mM、p−トルエンスルホン酸１〜１００mM、人血清アルブミン０.００１〜１重量％、フッ化ナトリウム０.０５〜２００mMおよびＮ−アセチルシステイン０.０２〜１０mMを含み、第２液は、アスコルビン酸オキシダーゼ０.１〜１００単位／ml、カルボン酸（塩）０.１〜１０重量％、ビリルビンオキシダーゼ０.０５〜１００単位／mlおよびｐＨ４.７〜６.５に調製されたフタル酸緩衝液１０〜２００mMを含む。
【００１７】
かくして得られた本発明の試薬(２液系)を用いて直接型ビリルビンを測定する具体的な方法を以下に示す。まず、前記の直接型ビリルビン測定用第１液(０.６ml)に各種ビリルビンを含む検体(血清等)を適量加え、分光光度計のセル室内にて予備加温後、４６０nmにおける吸光度を測定する。これに、前記の直接型ビリルビン測定用第２液(０.１５ml)を添加し、１〜１０分間反応させて直接型ビリルビンのみを酸化させた後、４６０nmにおける吸光度を測定し、この値と先に測定した吸光度の液量補正値とから吸光度変化量(Ａ)を求める。次に、既知濃度の直接型ビリルビンを含む標準物質を同様に測定し吸光度変化量(Ｂ)を求める。検体を作用させて求めた吸光度変化量および標準物質を作用させて求めた吸光度変化量から、次式により検体中の直接型ビリルビン含量を求めることができる。
検体中の直接型ビリルビン濃度(mg／dl)
＝(Ａ／Ｂ)×標準物質中の直接型ビリルビン濃度(mg／dl)
なお、検体量としては０.００５〜０.１mlが好ましい。測定波長は４６０nmに限定されるものではなく、４００〜４８０nmの任意の波長を選ぶことができる。また、第１液、第２液、検体の液量は適宜変化させることができる。
【００１８】
次に、総ビリルビン測定用試薬に関して説明する。この試薬に用いる緩衝液はｐＨ７〜１１が適当で、望ましくはｐＨ７.５〜１０までの間に緩衝能を持つものであればなんでもよく、例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ緩衝液等が挙げられる。緩衝液の濃度は１０〜５００mMが適し、好ましくは３０〜２００mMである。
【００１９】
ビリルビンオキシダーゼとしては、例えば、ミロセシウム属またはトラキデルマ属に属する菌株から得られる酵素が挙げられ、その必要量は０.０１〜２００単位／mlが適し、好ましくは０.１〜２０単位／mlである。
【００２０】
その他の成分として、チオール基を有する化合物、p−トルエンスルホン酸、安息香酸等の芳香族カルボン酸、界面活性剤、アラニン、セリン等のアミノ酸、マンニトール等の糖類、ポリエチレングリコール等のポリオール類、ＮaＣl等の塩類、アルブミン等の蛋白質等を必要に応じて添加することができる。
【００２１】
本発明においては、前記成分を適宜選択して常法により混合することにより、総ビリルビン測定用試薬を得ることができる。
【００２２】
次にビリルビン以外の生体成分を測定するための測定用試薬、すなわち、グルコースオキシダーゼとＰＯＤを用いたグルコース測定試薬、コレステロールオキシダーゼとＰＯＤを用いた遊離コレステロール測定試薬、グリセロールキナーゼとグリセロール−３−リン酸オキシダーゼとＰＯＤを用いた中性脂肪測定試薬、ホスホリパーゼＤとコリンオキシダーゼとＰＯＤを用いたリン脂質測定試薬、クレアチンアミジノヒドラーゼとザルコシンオキシダーゼとＰＯＤを用いたクレアチニン測定試薬、ウリカーゼとＰＯＤを用いた尿酸測定試薬などのようにオキシダーゼとＰＯＤと組み合わせ発色反応を行う原理の試薬は、オキシダーゼ、ＰＯＤ、色原体、カプラーとアスコルビン酸オキシダーゼ、カルボン酸（塩）からなる。
【００２３】
ここで用いられるＰＯＤとしては、西洋ワサビ由来のものを用いることができる。また各オキシダーゼにより生じる過酸化水素の呈色には色原体とカプラーが必要であり、色原体としてはＮ-エチル-Ｎ-(２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル)-３,５-ジメチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ-アセチルシステイン、フェノール、２−クロロフェノール、４−クロロフェノール、２,４−ジクロロフェノールなどのフェノール誘導体、もしくはアニリン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ,Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ,Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン、Ｎ,Ｎ−ジエチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ'−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジンなどのアニリン誘導体などが挙げられる。また，カプラーとしては、４−アミノアンチピリン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンなどが挙げられる。オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、色原体、カプラーの添加量は測定に支障をきたさない限り特に限定されるものではない。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例をもって詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、実施例中、略号は以下のものを示す。
ＴＯＯＳ：Ｎ-エチル-Ｎ-(２-ヒドロキシ-３-スルホプロピル)-３,５-ジメチルアニリン、
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸、
ＢＥＳ：Ｎ,Ｎ'-ビス（２−ヒドロキシエチル) -２-アミノエタンスルホン酸、
ＭＥＳ：２−（モルフォリノ）エタンスルホン酸、
ＴＥＳ：Ｎ-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-２-アミノエタンスルホン酸、
ＴＡＰＳ：Ｎ-トリス（ヒドロキシメチル）メチル-３-アミノプロパンスルホン酸、
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、
【００２５】
実施例 １：血清中の遊離コレステロールの測定
下記試薬Ａ〜Ｃを調製した。
試薬Ａ：
（第１試薬）ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２.０ｍＭ、ＭＥＳ １００ｍＭ、ｐＨ６.３
（第２試薬） コレステロールオキシダーゼ １.５Ｕ／ｍｌ、４-アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、ＭＥＳ １００ｍＭ、ｐＨ６.３
試薬Ｂ：
（第１試薬）ペルオキシダーゼ １０ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２.０ｍＭ，ＭＥＳ １００ｍＭ、ｐＨ６.３、アスコルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ （カボチャ由来）
（第２試薬）コレステロールオキシダーゼ １.５Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、ＭＥＳ １００ｍＭ、ｐＨ６.３
試薬Ｃ：
（第１試薬）ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２.０ｍＭ，ＭＥＳ １００ｍＭ、ｐＨ６.３、アスコルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ、ピルビン酸ナトリウム １.０％
（第２試薬） コレステロールオキシダーゼ １.５Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、ＭＥＳ １００ｍＭ、ｐＨ６.３
さらに試薬Ａ〜Ｃを、１年間１０℃で静置したものをそれぞれ試薬Ａ'〜Ｃ'とした。
【００２６】
サンプルとしては下記サンプル１〜６を用意した。
（サンプル１）人プール血清：蒸留水＝９：１、
（サンプル２）人プール血清：２００mg/dlアスコルビン酸水溶液＝９：１、
（サンプル３）人プール血清：４００mg/dlアスコルビン酸水溶液＝９：１、
（サンプル４）人プール血清：６００mg/dlアスコルビン酸水溶液＝９：１、
（サンプル５）人プール血清：８００mg/dlアスコルビン酸水溶液＝９：１、
（サンプル６）人プール血清：１０００mg/dlアスコルビン酸水溶液＝９：１。
【００２７】
各サンプル４μｌに、サンプル１〜６のそれぞれに対応して、各試薬Ａ〜Ｃ'（Ａ、Ａ'、Ｂ、Ｂ'、ＣおよびＣ'を意味する；以下同様）の第１試薬を２００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、試薬Ａ〜Ｃ'の第２試薬を１００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとに、あらかじめ標準液を用いて作成した検量線から遊離コレステロール濃度を求めた。その結果を表１に示す。表中、数字は単位 mg/dlを示す。
【００２８】
【表１】
表１から明らかなように、試薬ＡおよびＡ'ではアスコルビン酸の影響を受けて遊離コレステロールを正確に測定できない。またアスコルビン酸オキシダーゼのみを含む試薬Ｂでは１０℃、１年間保存処理しない場合にはアスコルビン酸の干渉回避が可能であるが、長期間保存した試薬Ｂ'では高濃度のアスコルビン酸の干渉を回避する能力が失われていた。しかし本発明の試薬Ｃでは保存する前後いずれにおいてもアスコルビン酸濃度が高いサンプルでもその影響を回避することできる。
【００３０】
実施例 ２：血清中の尿酸の測定
下記試薬Ｄ〜Ｆを調製した。
試薬Ｄ：
（第１試薬）ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２.０ｍＭ、ＢＥＳ１００ｍＭ、ｐＨ７.０、
（第２試薬）ウリカーゼ １Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、ＢＥＳ１００ｍＭ、ｐＨ７.０、
試薬Ｅ：
（第１試薬）ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２.０ｍＭ、ＢＥＳ１００ｍＭ、ｐＨ７.０、アスコルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ（Acremonium sp.由来）
（第２試薬）ウリカーゼ １Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、ＢＥＳ１００ｍＭ、ｐＨ７.０
試薬Ｆ：
（第１試薬）ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２.０ｍＭ、ＢＥＳ１００ｍＭ、ｐＨ７.０、アスコルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ（Acremonium sp.由来）、ピルビン酸ナトリウム ０.２％
（第２試薬）ウリカーゼ １Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン、０.６ｍＭＢＥＳ１００ｍＭ、ｐＨ７.０
また実施例１と同様に、それぞれの試薬を１０℃、１年間静置した試薬Ｄ'〜Ｆ'を用意した。サンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００３１】
各サンプル６μｌに、サンプル１〜６のそれぞれに対応して、各試薬Ｄ〜Ｆ'の第１試薬を２００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、各試薬Ｄ〜Ｆ'の第２試薬を１００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとに、あらかじめ標準液を用いて作成した検量線から尿酸濃度を求めた。その結果を表２に示す。表中、数字は単位 mg/dlを示す。
【００３２】
【表２】
表２から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、本発明の試薬Ｆは長期間にわたって妨害物質の干渉を回避することできる。
【００３４】
実施例 ３：中性脂肪の測定
下記試薬Ｇ〜Ｉを調製した。
試薬Ｇ：
（第１試薬）グリセロールキナーゼ １Ｕ／ｍｌ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ ５Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２ｍＭ、ＡＴＰ ３ｍＭ、ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ，ｐＨ７.０、
（第２試薬）リポプロテインリパーゼ ３Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ，ｐＨ７.０、
試薬Ｈ：
（第１試薬）グリセロールキナーゼ １Ｕ／ｍｌ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ ５Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２ｍＭ、ＡＴＰ ３ｍＭ、ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ，ｐＨ７.０、アスコルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ（Acremonium sp.由来）
（第２試薬）リポプロテインリパーゼ ３Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ７.０
試薬Ｉ：
（第１試薬）グリセロールキナーゼ １Ｕ／ｍｌ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ ５Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２ｍＭ、ＡＴＰ ３ｍＭ、ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ７.０、アスコルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ（Acremonium sp.由来）、ピルビン酸ナトリウム １.０％
（第２試薬）リポプロテインリパーゼ ３Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、 ＴＥＳ緩衝液 ５０ｍＭ，ｐＨ７.０
実施例１と同じく、１０℃、１年間保存した試薬Ｇ'〜Ｉ'を用意した。またサンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００３５】
各サンプル３μｌに、サンプル１〜６のそれぞれに対応して、試薬Ｇ〜Ｉ'の第１試薬を２５０μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、試薬Ｇ〜Ｉ'の第２試薬を１２５μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとにあらかじめ標準液を用いて作成した検量線から中性脂肪濃度を求めた。その結果を表３に示す。表中の数値は単位 mg/dlを示す。
【００３６】
【表３】
表３から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、本発明の試薬Ｉは長期間にわたって妨害物質の影響を回避することできる。
【００３８】
実施例 ４：血清リン脂質の測定
下記試薬Ｊ〜Ｌを調製した。
試薬Ｊ：
（第１試薬）ホスフォリパーゼＤ ０.５Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２ｍＭ、トリス緩衝液 ５０ｍＭ
（第２試薬）コリンオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、トリス緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ７.７
【００３９】
試薬Ｋ：
（第１試薬）ホスフォリパーゼＤ ０.５Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２ｍＭ、トリス緩衝液 ５０ｍＭ，ｐＨ７.７、アスコルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ（Acremonium sp.由来）
（第２試薬）コリンオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、トリス緩衝液 ５０ｍＭ，ｐＨ７.７
【００４０】
試薬Ｌ：
（第１試薬）ホスフォリパーゼＤ ０.５Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２ｍＭ、トリス緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ７.７、アスコルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ、ピルビン酸ナトリウム １.０％
（第２試薬）コリンオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、トリス緩衝液、ｐＨ７.７
実施例１と同じく、１０℃、1年間保存した試薬Ｊ'〜Ｌ'を用意した。
５０ｍＭサンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００４１】
各サンプル３μｌに、サンプル１〜６のそれぞれに対応して、試薬Ｊ〜Ｌ'の第１試薬を２５０μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、試薬Ｊ〜Ｌ'の第２試薬を１２５μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとにあらかじめ標準液を用いて作成した検量線からリン脂質濃度を求めた。その結果を表４に示す。表中の数値は単位 mg/dlを示す。
【００４２】
【表４】
表４から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、本発明の試薬Ｌは長期間にわたって妨害物質の影響を回避することできる。
【００４４】
実施例 ５：血清クレアチニンの測定
下記試薬Ｍ〜Ｏを調製した。
試薬Ｍ：
（第１試薬）クレアチンアミジノヒドロラーゼ １００Ｕ／ｍｌ、ザルコシンオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２ｍＭ、ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ８.０
（第２試薬）
クレアチニンアミドヒドロラーゼ ３００Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ８.０
【００４５】
試薬Ｎ：
（第１試薬）クレアチンアミジノヒドロラーゼ １００Ｕ／ｍｌ、ザルコシンオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２ｍＭ、ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ８.０、アスコルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ（Acremonium sp.由来）
（第２試薬）クレアチニンアミドヒドロラーゼ ３００Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ、 ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ８.０
【００４６】
試薬Ｏ：
（第１試薬）クレアチンアミジノヒドロラーゼ １００Ｕ／ｍｌ、ザルコシンオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ペルオキシダーゼ １０Ｕ／ｍｌ、ＴＯＯＳ ２ｍＭ、ＴＡＰＳ緩衝液 ５０ｍＭ、ｐＨ８.０、アスコルビン酸オキシダーゼ ２Ｕ／ｍｌ（Acremonium sp.由来）、ピルビン酸ナトリウム １.０％
（第２試薬）クレアチニンアミドヒドロラーゼ ３００Ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチピリン ０.６ｍＭ ＴＡＰＳ緩衝液、ｐＨ８.０
実施例１と同じく、１０℃、1年間保存した試薬Ｍ'〜Ｏ'を用意した。
５０ｍＭサンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００４７】
各サンプル６μｌに、サンプル１〜６のそれぞれに対応して、試薬Ｍ〜Ｏ'の第１試薬を３００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、試薬Ｍ〜Ｏ'の第２試薬を１００μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に５４６nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとにあらかじめ標準液を用いて作成した検量線からクレアチニン濃度を求めた。その結果を表５に示す。表中、数値は単位 mg/dlを示す。
【００４８】
【表５】
表５から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、本発明の試薬Ｏは長期間にわたって妨害物質の影響を回避することできる。
【００５０】
実施例 ６：血清直接ビリルビンの測定
下記試薬Ｐ〜Ｔを調製した。
試薬Ｐ：
（第１試薬）フタル酸水素カリウム緩衝液 １２０ｍＭ，ｐＨ５.５、 Ｎ-アセチルシステイン ２.５ｍＭ ＥＤＴＡ ０.１ｍＭ、 p-トルエンスルホン酸 ５０ｍＭ、 ＮａＦ ２.５ｍＭ
（第２試薬）フタル酸水素カリウム緩衝液 １２０ｍＭ，ｐＨ５.５、ビリルビンオキシダーゼ ０.１ Ｕ／ｍＬ、アスコルビン酸オキシダーゼ４Ｕ／ｍＬ
【００５１】
試薬Ｑ：
（第１試薬）フタル酸水素カリウム緩衝液 １２０ｍＭ，ｐＨ５.５、 Ｎ-アセチルシステイン ２.５ｍＭ ＥＤＴＡ ０.１ｍＭ、 p-トルエンスルホン酸 ５０ｍＭ、 ＮａＦ ２.５ｍＭ
（第２試薬）フタル酸水素カリウム緩衝液 １２０ｍＭ，ｐＨ５.５、ビリルビンオキシダーゼ ０.１ Ｕ／ｍＬ、アスコルビン酸オキシダーゼ ４Ｕ／ｍＬ（Acremonium sp.由来）、ピルビン酸ナトリウム ０.５％
試薬Ｒ：
（第１試薬）フタル酸水素カリウム緩衝液 １２０ｍＭ、ｐＨ５.５、 Ｎ-アセチルシステイン ２.５ｍＭ ＥＤＴＡ ０.１ｍＭ、p-トルエンスルホン酸 ５０ｍＭ、ＮａＦ ２.５ｍＭ
（第２試薬）フタル酸水素カリウム緩衝液 １２０ｍＭ、ｐＨ５.５、ビリルビンオキシダーゼ ０.１ Ｕ／ｍＬ、アスコルビン酸オキシダーゼ ４Ｕ／ｍＬ（Acremonium sp.由来）、ピルビン酸ナトリウム １.０％
【００５２】
試薬Ｓ：
（第１試薬）フタル酸水素カリウム緩衝液 １２０ｍＭ、ｐＨ５.５、Ｎ-アセチルシステイン ２.５ｍＭ ＥＤＴＡ ０.１ｍＭ、p-トルエンスルホン酸 ５０ｍＭ、ＮａＦ ２.５ｍＭ
（第２試薬）フタル酸水素カリウム緩衝液 １２０ｍＭ、ｐＨ５.５、ビリルビンオキシダーゼ ０.１Ｕ／ｍＬ、アスコルビン酸オキシダーゼ ４Ｕ／ｍＬ（Acremonium sp.由来）、ピルビン酸ナトリウム ２.０％
試薬Ｔ：
（第１試薬）フタル酸水素カリウム緩衝液 １２０ｍＭ、ｐＨ５.５、Ｎ-アセチルシステイン ２.５ｍＭ ＥＤＴＡ ０.１ｍＭ、p-トルエンスルホン酸 ５０ｍＭ、ＮａＦ ２.５ｍＭ
（第２試薬）フタル酸水素カリウム緩衝液 １２０ｍＭ、ｐＨ５.５、ビリルビンオキシダーゼ ０.１ Ｕ／ｍＬ、アスコルビン酸オキシダーゼ ４Ｕ／ｍＬ（Acremonium sp.由来）、ピルビン酸ナトリウム ５.０％
実施例１と同様に、２５℃、１ヶ月静置した試薬Ｐ'〜Ｔ'を調製した。サンプルとしては実施例１と同じサンプル１〜６を用意した。
【００５３】
サンプル１４μｌに、サンプル１〜６のそれぞれに対応して、各試薬Ｐ〜Ｔ'の第１試薬を２８０μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、各試薬Ｐ〜Ｔ'の第２試薬を７０μｌ添加し、３７℃で５分間加温後、精製水を対照に４５０ nmの吸光度を測定した。得られた吸光度をもとに、あらかじめ標準液を用いて作成した検量線からビリルビン濃度を求めた。
その結果を表７に示す。表中、数字は単位 mg/dlを示す。
【００５４】
【表６】
表６から明らかなように、アスコルビン酸濃度が高いサンプルにおいても、本発明の試薬Ｑ〜Ｔは長期間にわたってその影響を回避して血清直接ビリルビンを測定することができる。
【００５６】
【発明の効果】
本発明によれば、カルボン酸を添加するという非常に簡単で、経済的な方法により、アスコルビン酸オキシダーゼを液状で長期間安定化させることができ、サンプルに含まれるアスコルビン酸の影響をうけずに目的の生体液中の成分を正確に定量することができるようになる。
Claims (3)
- ピルビン酸（塩）の１種または２種以上を配合させることを特徴とするアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
- アスコルビン酸オキシダーゼを含有する溶液中のピルビン酸（塩）の濃度が０.１重量％以上である請求項１に記載のアスコルビン酸オキシダーゼの安定化方法。
- アスコルビン酸オキシダーゼとピルビン酸（塩）の１種または２種以上とを含有する体液中の生体成分測定用試薬であって、試薬中のピルビン酸（塩）の濃度が０.１重量％以上である生体成分測定用試薬。
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