CN101975753B

CN101975753B - 血清中胆固醇酯的两步酶测定方法

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Publication number: CN101975753B
Application number: CN2010102845926A
Authority: CN
Inventors: 李立和
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-09-17
Filing date: 2010-09-17
Publication date: 2012-10-31
Anticipated expiration: 2030-09-17
Also published as: CN101975753A

Abstract

本发明公开了一种血清中胆固醇酯的两步酶测定方法，属于利用可见光，通过测试反应结果颜色的变化来测试材料的方法。本发明的技术方案是：试剂II中仅有胆固醇酯水解酶有效组分，双色原物质及其它有效组分同在试剂I中；其测定方法为：血清先与试剂I于37℃温浴3～5分钟，血清中游离胆固醇与试剂I反应生成醌亚胺，加入试剂II后于37℃温浴4～7分钟，胆固醇酯水解后生成胆固醇，经反应生成红色的醌亚胺。仪器在500nm～520nm波长处检测，以试剂I反应产生的醌亚胺为空白，由试剂II反应产生的醌亚胺可测出胆固醇酯的含量。本发明检测时不受内源性游离胆固醇影响，其使用方法和范围与原有两步酶法相同，是一种快捷、准确性更高的胆固醇酯检测方法。

Description

血清中胆固醇酯的两步酶测定方法

技术领域

本发明属于一种包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种用生化分析仪快捷、准确检测血清中胆固醇酯的两步酶测定方法。

背景技术

血清中胆固醇以两种形式存在，一种为游离胆固醇(FC)；另一种为胆固醇与脂肪酸结合的胆固醇酯(CHE)。胆固醇酯正常值为2.34～3.38mmol/L(占总胆固醇的60～80％)。测胆固醇酯(CHE)具有临床意义，其增高常见于胆道梗阻、甲状腺功能减退、高脂血症和动脉粥样硬化等病症。其降低常见于严重肝病、甲状腺功能亢进、严重感染和营养不良等病症。胆固醇酯增高更易患心脑血管疾病。当胆固醇水平随着年龄或饮食条件的改变而上升时，胆固醇酯也同时上升。胆固醇酯与总胆固醇(TC)比值正常值为0.6～0.8∶1。胆固醇酯与总胆固醇比值有临床意义：(1)鉴别肝内外黄疸：阻塞性黄疸比值正常，肝细胞性黄疸比值降低。(2)增高：预示肝细胞损伤、病毒性肝炎早期、家族性卵磷酯胆固醇酰基转移酶缺乏等病症。因此临床上经常需要检测胆固醇酯。

血清中胆固醇的测定方法一般可分为化学法、酶法和色谱法3大类。早期测定方法是萃取法和化学法。美国疾病控制中心总胆固醇的测定方法为Lidberman-Burchard改良法。目前世界上大多数国家及我国检测血清胆固醇一般都采用酶法。另外还可采用高效液相色谱仪测定血清中的胆固醇及总胆固醇，但其检测成本高，速度慢、不易自动化、难以在临床推广。

目前国内几乎所有临床实验室都采用酶法测定胆固醇。采用酶法检测血清胆固醇的水平，一般都包括以下几个基本反应步骤：先用表面活性剂将脂蛋白分解成胆固醇、胆固醇酯和蛋白质。再选用最合适的胆固醇酯酶水解胆固醇酯，生成胆固醇和脂肪酸。水解后的胆固醇和血清中原有的游离胆固醇被胆固醇氧化酶氧化生成H₂O₂，在过氧化物酶(POD)的催化下，H₂O₂和4-氨基安替比林(4-AAP)、2，4-二氯酚(也可使用4-氯酚、苯酚衍生物、苯胺盐和苯磺酸盐，下面就以2，4-二氯酚为代表叙述，其他色原不再重复提起，)形成有色染料(常为醌亚胺类)，这些物质的生成量与样本中胆固醇的含量成正比。最后通过分光光度法计算出相应的胆固醇浓度。由于与血清中原有的游离胆固醇反应结果一起计算，所以计算结果是总胆固醇浓度。具体反应见化学反应式1～4。

现在许多临床实验室都采用生化分析仪测定血清中胆固醇，采用的也是酶法，其方法是将胆固醇酯水解酶、胆固醇氧化酶、POD、4-氨基安替比林和2，4-二氯酚、表面活性剂及防腐剂等组分溶解Tris-HCl缓冲液中(CHOD-PAP法)配制成单一试剂。此法具有简便快速、微量、精密度高的优点，且特异性强，反应线性范围宽，易达到终点。但由于血清中胆固醇酯水解后产生的胆固醇与血清中原有的游离胆固醇都参与了反应，所以用一步法测定的是血清中总胆固醇即游离胆固醇与胆固醇酯之和。目前许多实验室采用两步法测定，既将上述单一试剂分成两部分，以胆固醇氧化酶、POD、2，4-二氯酚为试剂I，以胆固醇酯水解酶、4-氨基安替比林作为试剂II。也有的以胆固醇酯水解酶、2，4-二氯酚为试剂I，以胆固醇氧化酶、4-氨基安替比林和POD作为试剂II。检测时先加入试剂I，反应完后再加入试剂II，分两次加入反应试剂进行测定，上述两步法中第一套试剂在加入试剂I后血清与试剂I反应，但不能生成有色染料，加入试剂II后，游离胆固醇和胆固醇酯均转化生成有色染料。第二套试剂在加入试剂I后就将胆固醇酯水解，游离胆固醇和胆固醇酯同时生成有色染料，其两步法测定结果还是总胆固醇。因此不管一步法还是两步法测定结果均为总胆固醇。如果要测定胆固醇酯，需测定总胆固醇后，再测定游离胆固醇，相减计算出胆固醇酯的含量。同样液相色谱测定也是如此，做两次测定后再相减计算，因此使检测都不能实现自动化。

发明内容：

为了能简单、方便、快捷及准确地测定胆固醇酯，本发明提供一种经济方便易行，准确性高、能够不受内源性胆固醇影响的血清中胆固醇酯的两步酶测定方法。

本发明采用的技术方案是：试剂I中含有双色原物质，胆酸钠、抗坏血酸氧化酶、POD、胆固醇氧化酶、表面活性剂及适量防腐剂；试剂II内含有胆固醇酯水解酶及适量防腐剂；其测定方法为：待测血清样品先与试剂I于37℃温浴3～5分钟，血清中游离胆固醇与试剂I反应生成醌亚胺，加入试剂II后于37℃温浴4～7分钟，胆固醇酯水解后产生胆固醇，经反应也生成醌亚胺；仪器在500nm～520nm波长处检测，以试剂I反应产生的醌亚胺为空白，从试剂II反应产生的醌亚胺计算出胆固醇酯的含量，计算公式为：

OD_CHE＝OD₂-OD₁×[SV+R₁V₁)/(SV+R₁V₁+R₂V₂)]

胆固醇酯浓度＝F×OD_CHE

其中OD_CHE是胆固醇酯产生的吸光度，OD₁是样品加入试剂I反应后测得的吸光度，OD₂是样品加入试剂II反应后测得的吸光度，SV是血清样品的体积，R₁V₁是试剂I的体积，R₂V₂是试剂II的体积，F是校正因数。

所述试剂I中双色原物质一个为4-氨基安替比林，另一个选自2，4-二氯酚、4-氯酚、苯酚衍生物、苯胺盐和苯磺酸盐中的任意一种。

试剂I中表面活性剂选自Triton X-100。

试剂I及试剂II中防腐剂选自Proclin-300。

试剂的配比为：试剂I每升Tris-HCl缓冲液内含Tris100mmol～200mmol、2，4-二氯酚2.0mmol～4.0mmol、4-氨基安替比林0.8mmol～2.4mmol、胆酸钠3.0mmol～5.5mmol、Triton X-1000.08g～0.15g、抗坏血酸氧化酶1000～1200U、POD 800U～1600U、胆固醇氧化酶800～1600U、Proclin-300 100μl～300μl；试剂II每升Tris-HCl缓冲液内含Tris 100mmol～200mmol、胆固醇酯水解酶800U～2400U、Proclin-300100μl～300μl。

上述试剂I和试剂II中Tris-HCl缓冲液的pH值为7.7±0.2。

上述测定所用各物品的体积比为：样品∶试剂I∶试剂II＝1∶75～80∶25～20。

本发明的试剂虽与原有的两步酶法试剂总组分相同，但是两种试剂各自组分与原有的试剂不同。本发明试剂II中只有胆固醇酯水解酶一种有效组分，4-氨基安替比林与2，4-二氯酚及其它有效组分同在试剂I。而且由于游离胆固醇和胆固醇酯水解生成的胆固醇生成的醌亚胺先后呈色，测定效果明显不同。其原理为：

第一步反应

第二步反应

本发明试剂I中含有胆固醇氧化酶、POD、4-氨基安替比林和2，4-二氯酚双色原物质等组分，试剂II仅含有胆固醇酯水解酶一种有效组分。血清先与试剂I温浴，由于试剂I中包含有除胆固醇酯水解酶外其它有效组分，因此在试剂I的反应中游离胆固醇生成醌亚胺，加入试剂II后，胆固醇酯通过胆固醇酯水解酶水解生成胆固醇，经胆固醇氧化酶、POD、4-氨基安替比林和2，4-二氯酚双色原物质作用，使得胆固醇酯水解后也生成红色的醌亚胺。通过设置仪器测定参数，仪器将试剂I反应生成的醌亚胺设为空白，由试剂II反应生成的醌亚胺计算出CHE的含量，这样测定结果消除了原有游离胆固醇干扰的影响。

本发明与现有技术相比有如下优点：

1.本发明的方法检测时不受内源性胆固醇影响。由于游离胆固醇在加入试剂I就完成反应，不会参与以后的反应。而加入试剂II后胆固醇酯才开始反应，仪器也才开始计算，因此排除了游离胆固醇的影响，使检测数据能真实反映胆固醇酯的状况。

2.本发明采用自动化仪器一次测定就能直接得出胆固醇酯的结果，与现有两步法技术和液相色谱需要分别作两次测定，再进行计算相比，本发明的测定方法能自动化，减少检测成本和时间，提高了检测效率。

3.同时由于只需一次检测，因而减少了检测时的误差，提高了准确率。

4.本发明使用方法和范围与原有两步酶法相同，不增加实验人员的负担，不增加试剂成本。

如上所述，本发明是一种经济方便易行，准确性更高的CHE检测方法。今后可广泛应用于临床检测和常规体检中。

具体实施方式：

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1

试剂的组成：

a.试剂I：

每升Tris-HCl缓冲液(pH7.6)内含Tris 150mmol、2，4-二氯酚3.0mmol、胆酸钠4.2mmol、TritonX-1000.12g、抗坏血酸氧化酶1100U、胆固醇氧化酶1200U、POD 1200U、4-氨基安替比林1.6mmol、Proclin-300 200μl。

b.试剂II：

每升Tris-HCl缓冲液(pH7.7)内含Tris 150mmol、胆固醇酯水解酶1600U、Proclin-300 200μl。

c.标准液：3.2mmol/L胆固醇酯标准血清。

其中，Triton X-100为表面活性剂，Proclin-300为液体高效防腐剂，胆酸钠为抑菌剂。

实施例2.

试剂I中将2，4-二氯酚改为4-氯酚。含量不变。其他成分都不变，试剂II不变。

实施例3

测定程序

双试剂法：在日本OLYMPUS AU2700全自动化生化分析仪上，仪器自动将2μl样品加入到150μl试剂I中混匀，37℃孵育3分钟，加入50μl试剂II混匀，37℃孵育5.1分钟，全自动分析仪在500nm波长处检测。仪器自动计算出胆固醇酯结果。具体见表1

表1.本发明自动化生化分析仪测试条件

反应OD_CHE计算值＝OD₂-OD₁×[(SV+R₁V₁)/(SV+R₁V₁+R₂V₂)]

胆固醇酯浓度＝F×OD_CHE

其中OD_CHE是胆固醇酯产生的吸光度。OD₁是样品加入试剂I反应后测得的吸光度，OD₂是样品加入试剂II反应后测得的吸光度，SV是血清样品的体积，R₁V₁是试剂I的体积，R₂V₂是试剂II的体积。F是校正因数。

加入试剂II后OD₁的稀释倍数为[(SV+R₁V₁)/(SV+R₁V₁+R₂V₂)]，加入试剂II后的吸光度即为OD₁×[(SV+R₁V₁)/(SV+R₁V₁+R₂V₂)]。所以，由胆固醇酯产生的醌亚胺的吸光度为：OD_CHE＝OD₂-OD₁×[(SV+R₁V₁)/(SV+R₁V₁+R₂V₂)]，即OD_CHE＝OD₂-(2+150)/(2+150+50)×OD₁。只要测出OD₁和OD₂即可计算出胆固醇酯的浓度。

下面通过采用本方法与高效液相色谱法(HPLC)测定胆固醇酯比较来说明本研究方法的准确性。

1.检测对象：待检者32例，其中男18人，平均年龄42.5岁；女性14人，平均年龄39.5岁，空腹静脉采血2mL。

2.采用方法及试剂

2.1试剂：

(1)本发明方法采用实施例1中的试剂I、试剂II；

(2)单试剂方法采用将试剂I、试剂II合并成一个试剂，其容量、各组分含量都不变。

2.2.仪器：(1)日本Olympus AU2700型全自动生化分析仪； (2)日本岛津LC-10A高效液相色谱仪。

2.3.方法

2.3.1单一试剂方法样品∶试剂＝1∶100。37℃，反应时间8.1分钟，500nm波长处终点法测定。

2.3.2.本发明方法样品∶试剂I∶试剂II＝1∶75∶25。37℃，样品与试剂I温浴3分钟，加入试剂II，反应5.1分钟，500nm波长处终点法测定。

2.3.3.HPLC法测定采用岛津LC-10A高效液相色谱仪，流动相为含1％异丙醇和0.5％乙腈的正己烷，流速1.2ml/min，检测波长230nm。取样品制备中的正己烷层直接进样，测定总胆固醇时进样体积5μl，测定游离胆固醇时10μl。将标准溶液的浓度对胆固醇/内标峰面积比进行线性回归，得回归方程，用于样品胆固醇浓度计算。胆固醇酯浓度由总胆固醇和游离胆固醇相减得出。

本发明方法与HPLC法测定结果比较：结果显示两种方法无显著性差异(t＝0.6810，P＞0.05，n＝32)，呈良好相关性，Y_两步酶法＝1.013X_HPLC法-0.2590，R²＝0.9969，本发明方法测定结果为胆固醇酯。本发明方法与单一试剂法有高度显著性差异(t＝26.32，P＜0.01，n＝32)，单一试剂法测定结果为总胆固醇，具体数据见表2。

表2.三种方法测定待检者血清胆固醇酯结果比较(mmol/L)

经过以上比较可看出，本发明虽与现有试剂配方组成相同，但因4-氨基氨替比林与2，4-二氯酚同在试剂I中，试剂II仅有胆固醇酯水解酶，所以血清加入试剂I后发生的反应与现有加入试剂I后的反应不同，实际效果也完全不一样。因此，本发明通过改变试剂I、II的组分能够保证血清中胆固醇酯检测的准确性。

Claims

1.一种血清中胆固醇酯的两步酶测定方法，其特征在于试剂I中含有4-氨基安替比林和苯酚衍生物的双色原物质、胆酸钠、抗坏血酸氧化酶、过氧化物酶、胆固醇氧化酶、表面活性剂及适量防腐剂；试剂II内含有胆固醇酯水解酶及适量防腐剂；其测定方法为：待测血清样品先与试剂I于37℃温浴3～5分钟，血清中游离胆固醇与试剂I反应生成醌亚胺，加入试剂II后于37℃温浴4～7分钟，胆固醇酯水解后产生胆固醇，经反应也生成醌亚胺；仪器在500nm～520nm波长处检测，以试剂I反应产生的醌亚胺为空白，从试剂II反应产生的醌亚胺计算出胆固醇酯的含量，计算公式为：

OD_CHE＝OD₂-OD₁×[(SV+R₁V₁)/(SV+R₁V₁+R₂V₂)]

胆固醇酯浓度＝F×OD_CHE

2.根据权利要求1所述的血清中胆固醇酯的两步酶测定方法，其特征在于试剂I中的双色原物质一个为4-氨基安替比林，另一个还选自2，4-二氯酚、4-氯酚、苯胺盐和苯磺酸盐中的任意一种。

3.根据权利要求2所述的血清中胆固醇酯的两步酶测定方法，其特征在于试剂I每升Tris-HCl缓冲液内含Tris100mmol～200mmol、2，4-二氯酚2.0mmol～4.0mmol、4-氨基安替比林0.8mmol～2.4mmol、胆酸钠3.0mmol～5.5mmol、TritonX-1000.08g～0.15g、抗坏血酸氧化酶1000U～1200U、过氧化物酶800U～1600U、胆固醇氧化酶800～1600U、Proclin-300100μl～300μl；试剂II每升Tris-HCl缓冲液内含Tris100mmol～200mmol、胆固醇酯水解酶800U～2400U、Proclin-300100μl～300μl。

4.根据权利要求3所述的血清中胆固醇酯的两步酶测定方法，其特征在于试剂I和试剂II中Tris-HCl缓冲液的pH值为7.7±0.2。

5.根据权利要求1所述的血清中胆固醇酯的两步酶测定方法，其特征在于测定所用各物品的体积比为：样品∶试剂I∶试剂II＝1∶75～80∶25～20。