CN1570648A - 高低密度脂蛋白胆固醇联合测定方法及试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高低密度脂蛋白胆固醇联合测定方法及试剂，它是利用脂蛋白与表面活性剂的亲和性差异，加入试剂1或试剂2，在聚离子表面活性剂的作用下，血清中的CM、VLDL及LDL－C或HDL－C形成可溶性复合物，它们表面的游离胆固醇在胆固醇酯酶(CHER)、胆固醇氧化酶(CHO)的催化下反应生成H2O2，在过氧化物酶(POD)的作用下，H2O2被清除，加入试剂3，在一种特殊的选择性表面活性剂作用下，只有HDL－C或LDL－C颗粒可溶，利用Trinder反应测定HDL－C或LDL－C的含量，本发明方法及试剂操作简便快捷、准确度高、重复性好、抗干扰能力强。
Description
技术领域
本发明涉及一种高低密度脂蛋白胆固醇联合测定方法及试剂。
背景技术
众多流行病学与临床研究证实，动脉粥样硬化(AS)、冠心病(CHD)的发生与血清中高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平呈负相关，而与低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平呈正相关，临床上常用高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的比值来表示冠心病的发病倾向，称为冠心病指数，因此，HDL-C、LDL-C是当前临床实验室血脂测定中最有价值的心脑血管疾病的危险因素指标。
目前尽管HDL-C、LDL-C的测定方法很多，超速离心法、色谱法、电泳法及沉淀法等，但因特殊仪器、技术操作、环境等诸多因素的限制，使得上述方法均不属于临床实验室的最佳方法。超速离心法为美国疾病与预防中心(CDC)定为测定HDL-C、LDL-C的参考方法，也为NCEP所推荐，但因需用特殊仪器及对操作技术要求高，一般临床实验室难以开展。虽然沉淀法因其操作简单，准确，在国内临床实验室应用较广，但需要进行血清分离，且标本分离过程中易受温度、时间、转速等因素的影响，而造成测定结果偏差较大。色谱法及电泳法也因仪器、操作要求高等种种原因使得临床实验室也较少应用，多用于脂蛋白的研究。此外，上述方法的共同局限性就是都不能进行自动化分析。如今，实验室仪器设备自动化已逐渐成为临床实验室的发展趋势，这样毋需对标本进行分离的直接检测方法就应运而生。从目前国内的直接法检测试剂来看，尚存在技术不成熟问题，例如，中国专利公开号CN-1281981A公开的测定试剂，因其成份中一些金属离子浓度过高，易和一些聚阴离子形成絮状物而影响测定结果。又如中国专利公开号CN-1379234A的测定试剂，其成份中Mg2+较高，不仅可抑制试剂中各种酶的活性，且在pH值呈碱性的缓冲体系中，易形成Mg(OH)2沉淀而影响测定。由于上述技术问题的存在，使得国产直接法测定高低密度脂蛋白试剂无法很好地被广泛应用。进口试剂技术上已经较成熟，但价格较高，在国内有些基层医院也无法开展。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简便快捷、准确度高、重复性好、抗干扰能力强的高低密度脂蛋白胆固醇联合测定方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术解决方案是：利用脂蛋白与表面活性剂的亲和性差异，加入试剂1或试剂2，在聚离子表面活性剂的作用下，血清中的CM、VLDL及LDL-C或HDL-C形成可溶性复合物，它们表面的游离胆固醇在胆固醇酯酶(CHER)、胆固醇氧化酶(CHO)的催化下反应生成H2O2，在过氧化物酶(POD)的作用下，H2O2被清除，加入试剂3，在一种特殊的选择性表面活性剂作用下，只有HDL-C或LDL-C颗粒可溶，利用Trinder反应测定HDL-C或LDL-C的含量。
本发明的另一目的是提供上述高低密度脂蛋白胆固醇联合测定方法中使用的试剂。
本发明试剂由试剂1、试剂2、试剂3组成，它们的组成分别是：
试剂1：
HEPES-NaoH缓冲液 20~80mmol/L
聚阴离子表面活性剂 1~6g/L
胆固醇酯酶 0.5~6KU/L
胆固醇氧化酶 0.3~2KU/L
过氧化物酶 0.5~12KU/L
胆酸钠 0.5~1.8mmol/L
亚铁氰化钾 0.001~0.005mmol/L
抗坏血酸氧化酶 0.5~2KU/L
聚乙二醇8000 20~50g/L
TOOS 2~5mmol/L
稳定剂 0.2~2g/L
防腐剂 0.1~2.5g/L
试剂2：
HEPES-NaoH缓冲液 20~80mmol/L
聚阴离子表面活性剂 1~5g/L
胆固醇酯酶 0.5~6KU/L
胆固醇氧化酶 0.3~2KU/L
过氧化物酶 0.5~12KU/L
亚铁氰化钾 0.001~0.005mmol/L
抗坏血酸氧化酶 0.5~2KU/L
TOOS 2~5mmol/L
胆酸钠 0.5~3mmol/L
皂苷 0.1~0.4mmol/L
Brij-35 2~4g/L
试剂3：
HEPES-NaoH缓冲液 20~80mmol/L
4-安基安替比林 0.05~0.2g/L
防腐剂 0.1~2.5g/L
胆酸钠 0.5~1.8mmol/L
Genapolx-080 2~4g/L
稳定剂 0.2~2g/L
为了提高测定准确度，本发明试剂盒选择了特异性强的表面活性剂，在第一步反应中试剂1或试剂2中的表面活性剂能改变HDL-C或LDL-C以外的脂蛋白结构并解离，所释放出来的微粒化胆固醇与胆固醇酶试剂反应，产生的H2O2在缺乏偶联剂时被消耗而不显色，此时HDL-C或LDL-C颗粒均是完整的，加试剂3使HDL-C或LDL-C迅速解离释放胆固醇参与Trinder反应而显色。在试剂1和试剂2中聚阴离子表面活性剂可选聚氧乙烯亚烷基苯基醚、毛地黄皂苷、Thesit等，其中以聚氧乙烯亚烷基苯基醚最佳。防腐剂可选用柳酸汞、ProClin400进行防腐，以ProClin400为最佳，其不但具有良好的防腐作用，且对酶活性无抑制。中国专利公开号CN-1379234A的试剂中，选用叠氮钠作防腐剂，大量试验证实，叠氮钠在防腐的同时对试剂中各种酶的活性抑制较大，易造成测定结果的不准确及反应在规定时间内达不到平衡，另外叠氮钠对长期使用人员的皮肤接触中会有致癌的危险。稳定剂可选用海澡糖、牛血清白蛋白、庶糖、α-环糊精。本发明试剂盒具有较稳定的缓冲体系和反应体系，各组份的最佳组合保证了规定效期内的稳定性。为了增加抗干扰的能力，本发明试剂1、试剂2中加入了抗坏血酸氧化酶，亚铁氰化钾等成份，可减少黄疸、溶血时测定标本的干扰。为了提高测定灵敏度，本发明试剂显色剂筛选TOOS，使反应的灵敏度可达到0.08mmol/L，且呈色稳定。
由于本发明高低密度脂蛋白胆固醇联合测定方法无需对标本进行沉淀、离心等前处理，因此操作简便快捷；由于本发明可以联合检测血清中的HDL-C、LDL-C，因而大大降低了成本，使得在国内基层实验室也有能力开展HDL-C、LDL-C直接法测定项目；本发明测定试剂中不含Mg2+，不会影响血清Mg2+的测定，也不会与自动生化分析仪中可能残留的OH-结合生成沉淀而堵塞管道，因而特别适合于自动生化分析仪使用
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的描述。
附图说明
图1是实施例1中高密度脂蛋白胆固醇直接法(即本发明方法)与沉淀法的相关性图。
图2是实施例1中低密度脂蛋白胆固醇直接法(即本发明方法)与沉淀法的相关性图。
图3是实施例2中高密度脂蛋白胆固醇直接法(即本发明方法)与沉淀法的相关性图。
图4是实施例2中低密度脂蛋白胆固醇直接法(即本发明方法)与沉淀法的相关性图。
图5是实施例3中高密度脂蛋白胆固醇直接法(即本发明方法)与沉淀法的相关性图。
图6是实施例3中低密度脂蛋白胆固醇直接法(即本发明方法)与沉淀法的相关性图。
具体实施方式
实施例1
试剂1：
pH值7.5HEPES-NaoH缓冲液 50mmol/L
聚氧乙烯亚烷基苯基醚 4g/L
胆固醇酯酶 4KU/L
胆固醇氧化酶 2KU/L
过氧化物酶 8KU/L
抗坏血酸氧化酶 1KU/L
聚乙二醇8000 30g/L
TOOS 4mmol/L
亚铁氰化钾 0.002mmol/L
胆酸钠 1mmol/L
牛血清白蛋白 2mmol/L
ProClin400 0.5g/L
试剂2：
pH值7.5HEPES-NaoH缓冲液 50mmol/L
聚氧乙烯亚烷基苯基醚 4g/L
胆固醇酯酶 4KU/L
胆固醇氧化酶 2KU/L
过氧化物酶 8KU/L
抗坏血酸氧化酶 1KU/L
皂苷 0.2mmol/L
TOOS 4mmol/L
亚铁氰化钾 0.002mmol/L
胆酸钠 1mmol/L
Brij-35 3g/L
试剂3：
pH值7.5HEPES-NaoH缓冲液 50mmol/L
4-氨基安替比林 0.10g/L
牛血清白蛋白 2mmol/L
胆酸钠 1.2mmol/L
Genapolx-080 3g/L
ProClin400 0.5g/L
本实施例描述的高低密度脂蛋白胆固醇联合检测试剂，使用采用具有双试剂功能的自动生化分析仪，以日立7170为例，其操作如下：
高密度脂蛋白胆固醇操作
| 加入物 | 空白管 | 校准管 | 质控管 | 样品管 |
| 蒸馏水 | 3μl | ------ | ------ | ------ |
| 校准液 | ------ | 3μl | ------ | ------ |
| 质控品 | ------ | ------ | 3μl | ------ |
| 样品 | ------ | ------ | ------ | 3μl |
| 试剂1 | 300μl | 300μl | 300μl | 300μl |
| 混匀，37℃预温5分钟，主波长546nm/次波长660nm读取各管吸光度A1 | ||||
| 试剂3 | 100μl | 100μl | 100μl | 100μl |
| 混匀，37℃预温5分钟，读取各管吸光度A2，计算ΔA＝A1-A2。 | ||||
低密度脂蛋白胆固醇操作
| 加入物 | 空白管 | 校准管 | 质控管 | 样品管 |
| 蒸馏水 | 3μl | ------ | ------ | ------ |
| 校准液 | ------ | 3μl | ------ | ------ |
| 质控品 | ------ | ------ | 3μl | ------ |
| 样品 | ------ | ------ | ------ | 3μl |
| 试剂2 | 300μl | 300μl | 300μl | 300μl |
| 混匀，37℃预温5分钟，主波长546nm/次波长660nm读取各管吸光度A1 | ||||
| 试剂3 | 100μl | 100μl | 100μl | 100μl |
| 混匀，37℃预温5分钟，读取各管吸光度A2，计算ΔA＝A1-A2。 |
结果计算：(样本中高、低密度脂蛋白胆固醇浓度计算相同)
血清高、低密度脂蛋白胆固醇浓度(mmol/L)＝ΔA样品/ΔA校准×校准液浓度
用本实施例介绍的测定试剂与沉淀法同时测定了30例临床标本HDL-C、LDL-C含量，结果如表1和图1、图2所示。
表1
| 24 | 2.31 | 2.36 | 3.66 | 3.76 | |
| 25 | 2.26 | 2.25 | 3.98 | 4.12 | |
| 26 | 3.00 | 3.10 | 4.01 | 4.16 | |
| 27 | 2.13 | 2.14 | 4.26 | 4.20 | |
| 28 | 2.31 | 2.28 | 4.55 | 4.66 | |
| 29 | 2.68 | 2.69 | 4.86 | 4.98 | |
| 30 | 2.89 | 2.92 | 4.98 | 5.25 |
从表1和图1、图2可以看出，本发明的方法尽管操作简单，也与常规的沉淀方法显示良好的相关性。
实施例2
本实施例使用的高低密度脂蛋白胆固醇联合检测试剂，是在实施例1中的胆固醇酯酶4KU/L、胆固醇氧化酶2KU/L改变为以下的浓度和组合，进行实施例1同样的测定，结果如表2和图3、图4所示。
胆固醇酯酶 2KU/L
胆固醇氧化酶 1KU/L
表2
| 13 | 1.33 | 1.34 | 13 | 2.47 | 2.60 |
| 14 | 1.45 | 1.47 | 14 | 2.55 | 2.66 |
| 15 | 1.57 | 1.65 | 15 | 2.62 | 2.75 |
| 16 | 1.89 | 1.85 | 16 | 2.73 | 2.85 |
| 17 | 1.84 | 1.88 | 17 | 2.45 | 2.49 |
| 18 | 1.82 | 1.84 | 18 | 2.69 | 2.67 |
| 19 | 2.03 | 1.88 | 19 | 2.77 | 2.84 |
| 20 | 1.99 | 1.89 | 20 | 2.80 | 2.99 |
| 21 | 1.64 | 1.69 | 21 | 2.88 | 2.80 |
| 22 | 1.87 | 1.98 | 22 | 3.12 | 3.07 |
| 23 | 2.01 | 1.99 | 23 | 2.45 | 2.55 |
| 24 | 2.31 | 2.20 | 24 | 3.66 | 3.88 |
| 25 | 2.26 | 2.18 | 25 | 3.98 | 4.35 |
| 26 | 3.00 | 2.90 | 26 | 4.01 | 4.29 |
| 27 | 2.13 | 2.32 | 27 | 4.26 | 4.15 |
| 28 | 2.31 | 2.56 | 28 | 4.55 | 4.99 |
| 29 | 2.68 | 2.78 | 29 | 4.86 | 5.18 |
| 30 | 2.89 | 3.15 | 30 | 4.98 | 5.32 |
由以上结果可见，与实施例1相比胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶减少1/2的时候也可以获得大致相同的结果。
实施例3
本实施例使用的高低密度脂蛋白胆固醇联合检测试剂，是将实施例1中的pH值为7.5的HEPES-NaoH缓冲液由50mmol/L改为20mmol/L，进行实施例1同样的测定，结果如表3和图5、图6所示。
表3
| 2 | 0.94 | 1.02 | 2 | 1.09 | 1.07 |
| 3 | 1.06 | 1.15 | 3 | 1.17 | 1.15 |
| 4 | 1.15 | 1.18 | 4 | 1.35 | 1.46 |
| 5 | 1.09 | 1.07 | 5 | 1.48 | 1.52 |
| 6 | 1.32 | 1.30 | 6 | 1.59 | 1.57 |
| 7 | 1.20 | 1.25 | 7 | 1.66 | 1.62 |
| 8 | 1.22 | 1.24 | 8 | 1.88 | 1.90 |
| 9 | 1.27 | 1.29 | 9 | 1.96 | 1.90 |
| 10 | 1.30 | 1.29 | 10 | 2.28 | 2.35 |
| 12 | 1.28 | 1.29 | 12 | 2.31 | 2.39 |
| 13 | 1.33 | 1.36 | 13 | 2.47 | 2.46 |
| 14 | 1.45 | 1.47 | 14 | 2.55 | 2.59 |
| 15 | 1.57 | 1.60 | 15 | 2.62 | 2.66 |
| 16 | 1.89 | 1.95 | 16 | 2.73 | 2.70 |
| 17 | 1.84 | 1.88 | 17 | 2.45 | 2.39 |
| 18 | 1.82 | 1.90 | 18 | 2.69 | 2.75 |
| 19 | 2.03 | 2.10 | 19 | 2.77 | 2.80 |
| 20 | 1.99 | 2.22 | 20 | 2.80 | 2.88 |
| 21 | 1.64 | 1.66 | 21 | 2.88 | 3.02 |
| 22 | 1.87 | 1.97 | 22 | 3.12 | 3.33 |
| 23 | 2.01 | 2.15 | 23 | 2.45 | 2.60 |
| 24 | 2.31 | 2.45 | 24 | 3.66 | 3.78 |
| 25 | 2.26 | 3.01 | 25 | 3.98 | 4.20 |
| 26 | 3.00 | 3.12 | 26 | 4.01 | 3.89 |
| 27 | 2.13 | 2.20 | 27 | 4.26 | 4.39 |
| 28 | 2.31 | 2.29 | 28 | 4.55 | 5.12 |
| 29 | 2.68 | 2.70 | 29 | 4.86 | 5.02 |
| 30 | 2.89 | 2.92 | 30 | 4.98 | 5.21 |
从表3和图5、图6可以看出，与实施例1相比pH值为7.5的HEPES-NaoH缓冲液减少1/2的时候也可以获得大致相同的结果，因此可以降低测定成本。
Claims (6)
1、一种高低密度脂蛋白胆固醇联合测定方法，其特征在于：利用脂蛋白与表面活性剂的亲和性差异，加入试剂1或试剂2，在聚离子表面活性剂的作用下，血清中的CM、VLDL及LDL-C或HDL-C形成可溶性复合物，它们表面的游离胆固醇在胆固醇酯酶(CHER)、胆固醇氧化酶(CHO)的催化下反应生成H2O2，在过氧化物酶(POD)的作用下，H2O2被清除，加入试剂3，在一种特殊的选择性表面活性剂作用下，只有HDL-C或LDL-C颗粒可溶，利用Trinder反应测定HDL-C或LDL-C的含量。
2、一种权利要求1所述方法中使用的试剂，其特征在于由试剂1、试剂2、试剂3组成，它们的组成分别是：
试剂1：
HEPES-NaoH缓冲液 20~80mmol/L
聚阴离子表面活性剂 1~6g/L
胆固醇酯酶 0.5~6KU/L
胆固醇氧化酶 0.3~2KU/L
过氧化物酶 0.5~12KU/L
胆酸钠 0.5~1.8mmol/L
亚铁氰化钾 0.001~0.005mmol/L
抗坏血酸氧化酶 0.5~2KU/L
聚乙二醇8000 20~50g/L
TOOS 2~5mmol/L
稳定剂 0.2~2g/L
防腐剂 0.1~2.5g/L
试剂2：
HEPES-NaoH缓冲液 20~80mmol/L
聚阴离子表面活性剂 1~5g/L
胆固醇酯酶 0.5~6KU/L
胆固醇氧化酶 0.3~2KU/L
过氧化物酶 0.5~12KU/L
亚铁氰化钾 0.001~0.005mmol/L
抗坏血酸氧化酶 0.5~2KU/L
TOOS 2~5mmol/L
胆酸钠 0.5~3mmol/L
皂苷 0.1~0.4mmol/L
Brij-35 2~4g/L
试剂3：
HEPES-NaoH缓冲液 20~80mmol/L
4-安基安替比林 0.05~0.2g/L
防腐剂 0.1~2.5g/L
胆酸钠 0.5~1.8mmol/L
Genapolx-080 2~4g/L
稳定剂 0.2~2g/L
3、根据权利要求2所述的试剂，其特征在于其中聚阴离子表面活性剂选用聚氧乙烯亚烷基苯基醚。
4、根据权利要求2或3所述的试剂，其特征在于其中防腐剂选用ProClin400。
5、根据权利要求2或3所述的试剂，其特征在于其中稳定剂选用牛血清白蛋白。
6、根据权利要求4所述的试剂，其特征在于其中稳定剂选用牛血清白蛋白。
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