CN110029145A - 低密度脂蛋白胆固醇测定试剂、其制备方法及其使用方法 - Google Patents

低密度脂蛋白胆固醇测定试剂、其制备方法及其使用方法 Download PDF

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Abstract

低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，其特征在于：包括一个独立包装的单试剂，所述单试剂内的物质及配比如下：pH为5‑8的缓冲液、4‑氨基安替比林、胆固醇氧化酶、胆固醇酯酶、过氧化物酶、表面活性剂、显色剂和防腐剂。由于在试剂剂型上，是单试剂剂型，即一套试剂中只有一瓶全液体开盖上机即用试剂，即所有试剂的组分，在制作成成品后，在储存、运输和使用中，都以液体形态保存于一个试剂瓶中。优点是使用方便，稳定性好，在2‑8℃下贮存18个月，可满足医院快捷、准确、节约的要求。本发明的目的是提供一种能够准确、稳定、方便的、直接对血清样本进行低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的单试剂剂型，成本低，解决了双试剂耗损高的问题。

Description

低密度脂蛋白胆固醇测定试剂、其制备方法及其使用方法
技术领域
本发明涉及脂蛋白胆固醇测定试剂，特别是涉及低密度脂蛋白胆固醇测定试剂。
本发明还涉及上述低密度脂蛋白胆固醇的制备方法以及该低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的使用方法。
背景技术
胆固醇由体细胞合成和来自对食物的吸引,是细胞膜的组分和类固醇激素、胆汗酸的前体。血液中的脂蛋白是脂肪和载脂蛋白的复合物，由它转动胆固醇。脂蛋白有四种形式：高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白LDL、极低密度脂蛋白VLDL和乳糜微粒CM。LDL参与将胆固醇运送至外周细胞，而HDL负责从细胞中吸收胆固醇。四种形式的脂蛋白与冠状动脉粥样硬化有着明确的关系。低密度脂蛋白胆固醇LDL-C作用于动脉内膜形成动脉粥样硬化斑块，与冠心病以及相关的死亡率有着非常密切的关系。即使总胆固醇在正常范围内，LDL-C浓度的升高也预示了高度危险。
LDL-C测定没有决定性方法，LRC(脂类研究所)和CDC的参考方法是超速离心结合沉淀法，称β定量法。1972年，Friendewald等介绍一个简单的，根据TC、HDL和TG含量来计算LDL-C的公式(F公式)，该公式是建立在TG(mg/dl)÷5＝VLDL-C的基础上。因此，在实际应用中此公式计算有不少限制。但由于F公式计算简便，曾为临床实验室广泛使用。
20世纪80年代发展的选择性沉淀法，称第一代的直接测定法，加入相对特异的试剂沉淀LDL，离心后测定上层液中的胆固醇含量，和TC之差即LDL-C。第二代方法是20世纪90年代初发展的免疫分离法和肝素磁珠法，这两法只是在沉淀法的基础上对标本处理上用新的方法取代了离心步骤，并无实质性的改进，在我国并未推广。第三代方法：于1998年首先由日本学者报道，适合自动分析仪用的匀相测定法。由于匀相测定法免去了标本预处理步骤，可直接上机测定，在自动分析仪普及的基础上很快被临床实验室接受。中华医学会检验分会已推荐匀相测定法作为临床实验室测定LDL-C的常规方法。
目前生化诊断的主要产品形态是双试剂剂型，即产品由R1和R2两个试剂瓶组合而成。市面双试剂原理为：第一步反应中，具有特异选择性的强离子缓冲液与表面活性剂作用于血清中CM、VLDL、HDL，所释放出的胆固醇在CHER和CHOD的催化反应下生成H2O2，产生的H2O2在缺乏偶联剂时被消耗而不显色。第二步，在另一表面活性剂的作用下，LDL颗粒中的胆固醇被释放出来，并与胆固醇酶试剂反应，用标准Trinder反应即可测定LDL-C。双试剂剂型存在高损耗问题，仅直接损耗就高达25％。这么高的损耗，意味着用户买来的试剂有四分之一是白白倒掉了。而现有的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测定试剂盒都是液体双试剂剂型，较单试剂剂型存在以下不足：
(1)试剂损耗高
试剂的直接损耗主要来自生化分析仪的【仪器多加】和【瓶底残留】这两个因素。双试剂损耗计算见下表(1)：
同样是【仪器多加】和【瓶底损耗】问题，单试剂剂型较双试剂剂型有着先天的优势。以下是单试剂直接损耗的计算(表2)：
从以上计算中可以看出，在直接损耗上，单试剂比双试剂减少17％，具有明显的优势。
(2)单试剂使用更为方便
对用户来说，全液体单瓶上机要比双试剂双瓶上机要方便许多。减少了用户补加试剂的工作量，方便用户在试剂盘中查找试剂，减少了试剂放置错误的几率。
(3)双试剂测定时间长、仪器工作负荷大
双试剂完成一个测定反应过程需要10分钟时间；单试剂仅需要5分钟。单试剂节省用户操作时间，也降低了全自动生化分析仪的工作负荷，对延长仪器使用寿命，降低仪器维护成本，都有明显的帮助。
(4)双试剂占用仪器试剂位置多
单试剂比双试剂节省一个仪器试剂位置，这十分受到中小用户的欢迎，方便这些用户同时开展更多的检测项目。
发明内容
本发明是为了解决现有技术中的不足而完成的，本发明的目的是提供一种能够准确、稳定、方便的、直接对血清样本进行低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的单试剂剂型，成本低，解决了试剂耗损高的问题。
本发明的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，包括一个独立包装的单试剂，所述单试剂内的物质及浓度如下：5-100mmol/L的pH为5-8的缓冲液、0.2-2mmol/L的4-氨基安替比林、0.1-2KU/L的胆固醇氧化酶、0.1-2KU/L的胆固醇酯酶、0.1-10KU/L的过氧化物酶、0.05-10g/L的表面活性剂、0.05-0.5mmol/L的显色剂和0.005-10g/L的防腐剂。
本发明的一种低密度脂蛋白胆固醇测定试剂还可以是：
所述缓冲液为MES、PIPES或磷酸盐溶液。
所述表面活性剂为非离子表面活性剂或聚氧乙烯类表面活性剂。
所述显色剂为酚或酚的衍生物。
所述显色剂为苯酚、4-氯酚或TOOS。
所述防腐剂为NaN3或ProClin 300。
本发明的一种低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的制备方法，包括以下步骤：A.制备试剂：在室温条件下，将pH为5-8的缓冲液1.066-35.814g、4-氨基安替比林0.04065-0.4065g、胆固醇氧化酶0.1-2KU、胆固醇酯酶0.1-2KU、过氧化物酶0.1-10KU、表面活性剂0.05-10g、显色剂0.0047-0.1657g和防腐剂0.005-10g依次加入一定量的纯水中配置成总体积为1L的溶液，搅拌25-35分钟后，封闭包装，包装内的各物质浓度为pH为5-8的缓冲液5-100mmol/L、4-氨基安替比林0.2-2mmol/L、胆固醇氧化酶0.1-2KU/L、胆固醇酯酶0.1-2KU/L、过氧化物酶0.1-10KU/L、表面活性剂0.05-10g/L、显色剂0.05-0.5mmol/L和防腐剂0.005-10g/L；B.组合包装：将包装后的试剂、校准品和说明书组装在盒内，试剂盒在2-8℃保存。
本发明的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，由于在试剂剂型上，是单试剂剂型，即一套试剂中只有一瓶全液体开盖上机即用试剂(R号瓶)，也就是所有试剂的组分，在制作成成品后，在储存、运输和使用中，都以液体形态保存于一个试剂瓶中。优点是使用方便，节省试剂，稳定性好，在2-8℃下贮存18个月，可满足医院快捷、准确、节约的要求。
本发明的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，能够准确、直接地用于对血清样本进行低密度脂蛋白胆固醇浓度的测定。本发明是利用各类脂蛋白物理化学性质不同，它们与不同的表面活性剂可产生特异性反应。选用对低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)具有选择性的表面活性剂，可仅使测定样本中的LDL-C与胆固醇氧化酶(COD)、胆固醇酯酶(CE)产生显色反应。本发明将以上原理实际应用到临床体外测定低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)中，制作出可在生化分析仪上使用的全液体单瓶上机试剂(单试剂)。在反应原理上，本发明的特点是直接对血清中的LDL-C进行测定，区别与目前使用的，先清除血清中其它类型的脂蛋白胆固醇，再对血清中剩余的LDL-C进行测定的方法。
本发明的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的使用方法，可以直接用于对血清样本进行测定。
本发明的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，其中，MES为2-(N-吗啉代)-乙基磺酸，PIPES为1,4-哌嗪二乙磺酸，TOOS为N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，NaN3为叠氮化钠。
具体实施方式
下面对本发明的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂、制备方法及其使用方法作进一步详细说明。
本发明的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，包括一个独立包装的单试剂，所述单试剂内的物质及浓度如下：5-100mmol/L的pH为5-8的缓冲液、0.2-2mmol/L的4-氨基安替比林、0.1-2KU/L的胆固醇氧化酶、0.1-2KU/L的胆固醇酯酶、0.1-10KU/L的过氧化物酶、0.05-10g/L的表面活性剂、0.05-0.5mmol/L的显色剂和0.005-10g/L的防腐剂。这样，由于单试剂盒解决了产品高损耗的问题，而且对用户来说单试剂盒比双试剂盒更方便，单试剂盒不仅减少了用户补加试剂的工作量，同时还方便在试剂盘中查找试剂，减少试剂错放的几率并且单试剂测定时间更快，既省时又降低了仪器的工作负荷，对延长仪器实用寿命、降低仪器维护成本都有很明显的帮助。
本发明的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，在前面技术方案的基础上具体可以是：所述缓冲液为MES、PIPES或磷酸盐溶液。这样，由于本发明缓冲液最适的pH为5-8，所以优选的pH为5-8范围内较稳定的缓冲液为MES、PIPES或磷酸盐溶液，可以保持试剂的稳定性。在前面技术方案的基础上还可以是：所述表面活性剂为非离子表面活性剂或聚氧乙烯类表面活性剂。这样，非离子表面活性剂或聚氧乙烯类表面活性剂是只作用于LDL的表面活性剂，不用先清除血清中其它类型的脂蛋白胆固醇，方便省时且不会破坏试剂内部的稳定性。优选的表面活性剂有聚氧乙烯(40)山梨醇四油脂酸、聚氧乙烯(60)山梨醇四油脂酸、聚氧乙烯(60)山梨醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯甘油醚单硬脂酸酯、聚醚、聚氧乙烯(10)硬脂醇醚或聚氧乙烯(20)硬脂醇醚等。
本发明的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，在前面技术方案的基础上具体还可以是：所述显色剂为酚或酚的衍生物。这样，由于酚或酚的衍生物是Trinder显色反应中灵敏度较好的显示剂，能提高准确度，优选的显色剂是苯酚、4-氯酚或TOOS等。在前面技术方案的基础上具体还可以是：所述显色剂为苯酚、4-氯酚或TOOS。这样，苯酚、4-氯酚或TOOS较其他显色剂灵敏度高，稳定性强。前面技术方案的基础上具体还可以是：所述防腐剂为NaN3或ProClin 300。这样，NaN3是诊断试剂最常用的防腐剂；ProClin 300防腐剂具有广谱抗菌活性，能在比较长的时间内抑制细菌、真菌和酵母菌等微生物的生长；同时，它又能保持体系中酶的活性，因此它是一种理想的可替代硫汞撒、叠氮化钠和庆大霉素等生物防腐剂。
本发明的一种低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的制备方法，包括以下步骤：A.制备试剂：在室温条件下，将pH为5-8的缓冲液1.066-35.814g、4-氨基安替比林0.04065-0.4065g、胆固醇氧化酶0.1-2KU、胆固醇酯酶0.1-2KU、过氧化物酶0.1-10KU、表面活性剂0.05-10g、显色剂0.0047-0.1657g和防腐剂0.005-10g依次加入一定量的纯水中配置成总体积为1L的溶液，搅拌25-35分钟后，封闭包装，包装内的各物质浓度为pH为5-8的缓冲液5-100mmol/L、4-氨基安替比林0.2-2mmol/L、胆固醇氧化酶0.1-2KU/L、胆固醇酯酶0.1-2KU/L、过氧化物酶0.1-10KU/L、表面活性剂0.05-10g/L、显色剂0.05-0.5mmol/L和防腐剂0.005-10g/L；B.组合包装：将包装后的试剂、校准品和说明书组装在盒内，试剂盒在2-8℃保存。这样，通过上述步骤，可制备出稳定、准确度好的全液体低密度脂蛋白胆固醇单试剂，解决了临床上双试剂损耗高、测定时间长、占用仪器位置多等问题。
本发明还提供了上述低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的使用方法，能够直接用于对血清样本进行测定。利用各类脂蛋白物理化学性质不同，它们与不同的表面活性剂可产生特异性反应，选用对低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)具有选择性的表面活性剂，可仅使测定样本中的LDL-C与胆固醇氧化酶(COD)、胆固醇酯酶(CE)产生显色反应。
下面对本发明的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂、制备方法及其使用方法作进一步详细说明。
本发明的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂成分和各成分的含量如下：
序号 反应试剂名称 实验浓度 实验加入量
1 缓冲液(pH 6.3) 5-100mmol/L 1.066-35.814g
2 4-氨基安替比林 0.2-2mmol/L 0.04065-0.4065g
3 胆固醇氧化酶 0.1-2KU/L 0.1-2KU
4 胆固醇酯酶 0.1-2KU/L 0.1-2KU
5 过氧化物酶 0.1-10KU/L 0.1-10KU
6 表面活性剂 0.05-10g/L 0.05-10g
7 显色剂 0.05-0.5mmol/L 0.0047-0.1657g
8 防腐剂 0.005-10g/L 0.005-10g
本发明的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂制备方法，包括以下步骤：
A.制备试剂：在室温下，将上表中各原料依次加入纯水中配置成1L溶液，搅拌25-35分钟后，封闭包装。
B.组合包装：将试剂、校准品、说明书组装在盒内，试剂盒在2-8℃保存。
通过上述步骤，可能制备出可以稳定、准确度好的全液体低密度脂蛋白胆固醇单试剂。
本发明还提供了上述低密度胆固醇测定试剂的使用方法，能够准确测定低密度胆固醇含量。
A.试剂配制
本试剂为液体单试剂，开盖即用。
B.基本参数
波长(主/副):505/700nm 反应类型：终点法
反应方向：向上 校准方式：Linear
反应温度：37℃ 比色杯光径：1cm
测定结果如下：
A.准确度(测定国家标准物质GBW09179)
靶值 实测值 偏差
2.478 2.57 3.83％
B.重复性
(2.5±0.5)mmol/l (5±1)mmol/l
1 2.65 5.26
2 2.68 5.23
3 2.65 5.25
4 2.67 5.24
5 2.67 5.22
6 2.69 5.24
7 2.66 5.23
8 2.67 5.23
9 2.66 5.21
10 2.66 5.21
均值 2.67 5.23
SD 0.0126 0.0162
CV 0.47％ 0.31％
C.日间精密度
序号 浓度1 浓度2
1 1.46 2.68
2 1.45 2.67
3 1.44 2.68
4 1.45 2.69
5 1.44 2.63
6 1.44 2.64
7 1.48 2.68
8 1.45 2.66
9 1.47 2.69
10 1.47 2.68
11 1.43 2.63
12 1.43 2.63
13 1.46 2.68
14 1.47 2.68
15 1.47 2.68
16 1.45 2.66
17 1.46 2.7
18 1.46 2.65
19 1.47 2.67
20 1.46 2.68
均值 1.46 2.67
SD 0.0143 0.0214
CV 0.98％ 0.80％
实施例1：
本实施例描述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，缓冲液pH范围5-8，缓冲液采用MES,表面活性剂采用聚氧乙烯甘油醚单硬脂酸酯，显色剂采用苯酚，防腐剂采用NaN3，加入纯水中配置成1L的溶液：
序 反应试剂名称 实验浓 实验加入量
1 MES(pH 6.3) 50mmol/L 10.66g
2 4-氨基安替比林 0.38mmol/L 0.0772g
3 胆固醇氧化酶 2KU/L 2KU
4 胆固醇酯酶 1KU/L 1KU
5 过氧化物酶 10KU/L 10KU
6 聚氧乙烯甘油醚单硬脂酸酯 1.5g/L 1.5g
7 苯酚 0.25mmol/L 0.0235g
8 NaN3 2g/L 2g
实施例2：
本实施例描述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，缓冲液pH范围5-8，缓冲液采用PIPES,表面活性剂采用聚氧乙烯甘油醚单硬脂酸酯，显色剂采用TOOS，防腐剂采用ProClin300，加入纯水中配置成1L的溶液：
序号 反应试剂名称 实验浓度 实验加入量
1 PIPES(pH 6.3) 50mmol/L 15.1185g
2 4-氨基安替比林 0.38mmol/L 0.0772g
3 胆固醇氧化酶 2KU/L 2KU
4 胆固醇酯酶 1KU/L 1KU
5 过氧化物酶 10KU/L 10KU
6 聚氧乙烯甘油醚单硬脂酸酯 1.5g/L 1.5g
7 TOOS 0.25mmol/L 0.0828g
8 ProClin 300 2g/L 2g
实施例3：
本实施例描述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，缓冲液pH范围5-8，缓冲液采用磷酸盐,表面活性剂采用聚氧乙烯甘油醚单硬脂酸酯，显色剂采用4-氯酚，防腐剂采用NaN3，加入纯水中配置成1L的溶液：
序号 反应试剂名称 实验浓度 实验加入量
1 磷酸盐(pH 6.3) 50mmol/L 17.907g
2 4-氨基安替比林 0.38mmol/L 0.0772g
3 胆固醇氧化酶 2KU/L 2KU
4 胆固醇酯酶 1KU/L 1KU
5 过氧化物酶 10KU/L 10KU
6 聚氧乙烯甘油醚单硬脂酸酯 1.5g/L 1.5g
7 4-氯酚 0.25mmol/L 0.0321g
8 NaN3 2g/L 2g
实施例4：
本实施例描述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，缓冲液pH范围5-8，缓冲液采用PIPES,表面活性剂采用聚氧乙烯甘油醚单硬脂酸酯，显色剂采用苯酚，防腐剂采用NaN3，加入纯水中配置成1L的溶液：
序号 反应试剂名称 实验浓度 实验加入量
1 PIPES(pH 6.3) 50mmol/L 15.1185g
2 4-氨基安替比林 0.38mmol/L 0.0772g
3 胆固醇氧化酶 2KU/L 2KU
4 胆固醇酯酶 1KU/L 1KU
5 过氧化物酶 10KU/L 10K
6 聚氧乙烯甘油醚单硬脂酸酯 1.5g/L 1.5g
7 苯酚 0.25mmol/L 0.0235g
8 NaN3 2g/L 2g
上述仅对本发明中的几种具体实施例加以说明，但并不能作为本发明的保护范围，凡是依据本发明中的设计精神所作出的等效变化或修饰，均应认为落入本发明的保护范围。

Claims (8)

1.低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，其特征在于：包括一个独立包装的单试剂，所述单试剂内的物质及浓度如下：5-100mmol/L的pH为5-8的缓冲液、0.2-2mmol/L的4-氨基安替比林、0.1-2KU/L的胆固醇氧化酶、0.1-2KU/L的胆固醇酯酶、0.1-10KU/L的过氧化物酶、0.05-10g/L的表面活性剂、0.05-0.5mmol/L的显色剂和0.005-10g/L的防腐剂。
2.根据权利要求1所述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，其特征在于：所述缓冲液为MES、PIPES或磷酸盐溶液。
3.根据权利要求1所述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，其特征在于：所述表面活性剂为非离子表面活性剂或聚氧乙烯类表面活性剂。
4.根据权利要求1所述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，其特征在于：所述显色剂为酚或酚的衍生物。
5.根据权利要求4所述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，其特征在于：所述显色剂为苯酚、4-氯酚或TOOS。
6.根据权利要求1所述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，其特征在于：所述防腐剂为NaN3或ProClin 300。
7.根据权利要求1所述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
A.制备试剂：在室温条件下，将pH为5-8的缓冲液1.066-35.814g、4-氨基安替比林0.04065-0.4065g、胆固醇氧化酶0.1-2KU、胆固醇酯酶0.1-2KU、过氧化物酶0.1-10KU、表面活性剂0.05-10g、显色剂0.0047-0.1657g和防腐剂0.005-10g依次加入一定量的纯水中配置成总体积为1L的溶液，搅拌25-35分钟后，封闭包装，包装内的各物质浓度为pH为5-8的缓冲液5-100mmol/L、4-氨基安替比林0.2-2mmol/L、胆固醇氧化酶0.1-2KU/L、胆固醇酯酶0.1-2KU/L、过氧化物酶0.1-10KU/L、表面活性剂0.05-10g/L、显色剂0.05-0.5mmol/L和防腐剂0.005-10g/L；
B.组合包装：将包装后的试剂、校准品和说明书组装在盒内，试剂盒在2-8℃保存。
8.根据权利要求7所述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的使用方法，其特征在于：所述单试剂直接用于对血清样本进行测定。
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