CN1379234A - 低密度脂蛋白胆固醇测定方法及试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低密度脂蛋白胆固醇测定方法及试剂,它是首先第一步利用多聚物和表面活性剂对低密度脂蛋白(LDL)的特异作用形成稳定复合物掩蔽,其它脂蛋白在缺乏偶联剂条件下,在表面活性剂、胆固醇酶联试剂作用下被反应清除;然后第二步通过加入表面活性剂释放出低密度脂蛋白胆固醇(LDL－C),再在表面活性剂、胆固醇酶联试剂作用下参于完整的Trinder反应,在一定的波长处测得吸光度与低密度脂蛋白胆固醇(LDL－C)含量成正比,而求得低密度脂蛋白胆固醇(LDL－C)含量。该方法的试剂能够直接测定、无须标本前处理、不须沉淀和离心、不堵塞管道、稳定性强,特别适合进行批量自动分析,减少了测定过程中中间产物的干扰,提高了测定结果的精确度。
Description
本发明涉及一种低密度脂蛋白胆固醇的测定方法及试剂。
众多流行病学、遗传学与临床研究证明，血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平与动脉粥样硬化、冠心病(CHD)的发生率成正相关，通常以高含量低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)作为冠心病(CHD)的首要致病因素，所以，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测定方法的准确性至关重要，现今临床上常用的方法有Friedewaly公式化、化学沉淀法、电泳法、免疫分离法等，前两中最常用，但测定中易受高甘油三酯和血清预处理产生的误差影响。所以，研究一种标本用量少、测定简便快捷、干扰少、高精确度和高准确度的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测定方法和测定试剂适应自动化分析是十分必要的。
近年来，国内外也开发了一些在自动生化分析仪上使用的LDL-C直接测定试剂，其中，一些采用聚阴离子和二价金属盐复合物、糖化合物和二价金属盐复合物，如中国专利CN-1281981A公开了一种低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，它包括由α-磺化环状糊精、硫酸葡聚糖、MgCl2、二氯苯酚、N-乙基-N-(3-甲苯基)-N＇-琥珀酰乙烯二胺、3-(N-吗啡啉)-2-羟丙基磺酸缓冲液组成的试剂I和由胆固醇脂酶(CEH)、胆固醇氧化酶(COD)和过氧化物酶(POD)、4-氨基安替比林、聚氧乙烯-聚氧丙烯聚醚、3-(N-吗啡啉)-2-羟丙基磺酸缓冲液组成的试剂II，这种低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，需要高浓度的二价金属盐(如镁离子)，而这些二价金属盐和上述聚阴离子、糖化合物、非HDL脂蛋白形成的书絮状复合物，而这些二价金属盐复合物，检测完毕后被排泄，在排液管道中易与其他碱性废液反应形成盐而发生沉淀，造成管道堵塞，容易对自动分析仪造成不良影响及故障。
本发明的目的是为了解决上述技术的不足而提供一种使试剂能够直接测定、无须标本前处理、不须沉淀和离心、不堵塞管道、稳定性强，测定结果受外界干扰小、测定精度高的低密度脂蛋白胆固醇测定方法及试剂。
为了达到上述目的，本发明所设计的低密度脂蛋白胆固醇测定方法，其特征是首先第一步利用多聚物和表面活性剂对低密度脂蛋白(LDL)的特异作用形成稳定复合物掩蔽，其它脂蛋白在缺乏偶联剂条件下，在表面活性剂、胆固醇酶联试剂作用下被反应清除；然后第二步通过加入表面活性剂释放出低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，再在表面活性剂、胆固醇酶联试剂作用下参于完整的Trinder反应，根据不同敏感的显色剂，在波长546nm至700nm内选择确定的波长处测得吸光度与低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量成正比，而求得低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量。为了在第一步反应中对低密度脂蛋白(LDL)的特异作用形成稳定复合物掩蔽，所述的多聚物是聚乙烯硫酸盐或中性多聚物PEGME或硫酸葡聚糖或α-磺化环糊精及其相互组合。
根据本发明所提供的低密度脂蛋白胆固醇测定方法而提供的一种低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，它分为两个组份A、B，由胆固醇脂酶(CEH)、胆固醇氧化酶(COD)和过氧化物酶(POD)组成的胆固醇酶联试剂和4-氨基安替比林可以全部设在A组份中，也可以全部设在B组份中或A、B组份中分别设置；A、B组份的其它成份组成可以是：
A组份：
缓冲液 5-500mmol/L
多聚物 0.1mg-5000mg/L
防腐剂 0.005-10g/L
稳定剂 0.05-500g/L
表面活性剂 0.05g-10g/L
去干扰剂 0.005-5mmol/L或0.1-5KU/L
B组份：
缓冲液 5-500mmol/L
表面活性剂 0.05-10g/L
显色剂 0.1-10mmol/L
稳定剂 0.03-300g/L
防腐剂 0.005-10g/L
根据多聚物的不同选择，所述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的A、B两个组份可以是：
A组份：缓冲液 5-500mmol/L
聚乙烯硫酸盐 100mg-5000mg/L
中性多聚物PEGME 0.1-200mg/L
4-氨基安替比林 0.05-1g/L
防腐剂 0.005-10g/L
稳定剂 0.05-500g/L
稳定剂EDTA.2Na 0.1-20mmol/L
表面活性剂 0.05-10g/L
去干扰剂 0.005-5mmol/L 0.1-5KU/L
胆固醇脂酶(CEH) 0.2-10KU/L
胆固醇氧化酶(COD) 0.2-10KU/L
过氧化物酶(POD) 0.1-80KU/L
B组份：缓冲液 5-500mmol/L
表面活性剂 0.01-30g/L
显色剂 0.1-10mmol/L
稳定剂 0.03-300g/L
防腐剂 0.005-10g/L
根据多聚物的不同选择，所述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的A、B两个组份还可以是：
A组份：缓冲液 5-500mmol/L
硫酸葡聚糖 0.05-5g/L
α-磺化环糊精 0.1-5mmol/L
4-氨基安替比林 0.05-1g/L
防腐剂 0.005-10g/L
稳定剂 0.05-500g/L
去干扰剂 0.005-5mmol/L或0.1-5KU/L
B组份：缓冲液 5-500mmol/L
表面活性剂 0.1-20g/L
显色剂 0.1-10mmol/L
防腐剂 0.005-10g/L
胆固醇脂酶(CEH) 0.2-15KU/L
胆固醇氧化酶(COD) 0.2-20KU/L
过氧化物酶(POD) 0.1-50KU/L
为了在第一步反应中在对低密度脂蛋白(LDL)的特异作用形成稳定复合物掩蔽的同时，防止极低密度脂蛋白也被形成复合物掩蔽，所述的稳定剂包括EDTA-2Na，其含量可以在0.1-50mmol/L。
为了提高其稳定性，消除测定结果在测定过程中受外界的多种干扰，所述的表面活性剂可以是非离子表面活性剂：聚氧乙烯类表面活性剂：Brij聚氧乙烯月桂基醚系列、Tween失水山梨醇聚氧乙烯系列、Triton X-100、乳化剂OP、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯聚醚等，也可以是两性离子表面活性剂EMPIGEN BB、月桂基甜菜碱、椰油酰胺基乙基-N-羟乙基氨基丙酸钠，椰油酰胺基丙基-2-羟基-3磺基丙基甜菜碱，椰油酰胺基丙基甜菜碱，月桂酰胺基丙基甜菜碱，椰油基甜菜碱等。另外，也可以用胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、SDS、聚乙二醇，表面活性剂的用量因具体不同成份而定，不须特别限制。去干扰剂可以是EDTA.Fe3+、抗坏血酸氧化酶、亚铁氰化钾、亚铁氰化钠、铁氰化钠；稳定剂可以是BSA、聚乙二醇、多元醇、EDTA-2Na、二价金属离子、抗生素；防腐剂可以是NaN3、PC-300；显色剂可以是酚或酚的衍生物：TOOS、TOPS、TODB、MADB缓冲液可以是GOOd‘S系列缓冲液、Tris、磷酸盐；pH范围4.0-9.0
本发明所得到的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，使试剂能够直接测定、无须标本前处理、不须沉淀和离心、不堵塞管道、稳定性强，在2至8度温度下贮存，能稳定一年以上，并且，特别适合进行批量自动分析，由于在测定时，首先采取对低密度脂蛋白的复合掩蔽，然后除去其它脂蛋白，再释放低密度脂蛋白胆固醇进行反应测定，使之减少了测定过程中中间产物的干扰，提高了测定结果的精确度，它对满足医院快捷、准确的要求具有十分积极的现实意义。
下面通过实施例对本发明作进一步的描述，但本发明绝不限于以下的实施例或被这些实施例所限。
实施例1：
本实施例描述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，分为A、B两个组份，所述的多聚物是聚乙烯硫酸盐和中性多聚物PEGME，胆固醇脂酶(CEH)、胆固醇氧化酶(COD)、过氧化物酶(POD)和4-氨基安替比林全部设在A组份中。
A组份：PH6.5缓冲液MES 50mM
聚乙烯硫酸钾盐 5ml/L
中性多聚物PEGME 1.2mg/l
4-氨基安替比林 0.3g/L
防腐剂NaN3 0.6g/L
稳定剂EDTA-2Na 1mmol/L
BSA 2g/L
MgCl2 0.5Mm
聚氧乙烯表面活性剂 1.5g/L
去干扰剂亚铁氰化钾 0.05mmol/L
CEH 1000U/L
COD 2000U/L
POD 10KU/L
B组份：
PH7.0缓冲液Tris 100mM
表面活性剂胆酸钠 3mmol/L
Triton X-100 0.3ml/L
防腐剂NaN3 0.9g/L
显色剂TOOS 4.5mmol/L
稳定剂EDTA.2Na 0.5mmol/L
本实施例描述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的自动生化分析仪，如日立7060自动分析仪，操作如下：
计算：HDL-C(mmol/L)＝C标准*(ΔA测定/ΔA标准)
| 加入物 | 空白管 | 标准管 | 测定管 |
| 试剂A | 300μl | 300μl | 300μl |
| 蒸馏水 | 4μl | ||
| 标准液 | 4μl | ||
| 标本 | 4μl | ||
| 混合，置37℃预孵育3至5分钟，在主波长546nm/辅助波长660nm读取各管吸光度A1 | |||
| 试剂B | 100μl | 100μl | 100μl |
| 混匀，置37℃孵育5分钟，在主波长546nm/辅助波长660nm下读取各管吸光度A2；计算ΔA＝A2-A1 | |||
实施例2：
本实施例描述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，是将胆固醇脂酶(CEH)、胆固醇氧化酶(COD)和过氧化物酶(POD)全部设在B组份中，4-氨基安替比林设在A组份中，多聚物选用硫酸葡聚糖和α-磺化环糊精。稳定剂选用EDTA.2Na，表面活性剂选用聚氧乙烯-聚氧丙烯聚醚。
A组份：PH7.0缓冲液Pipes 50mM
硫酸葡聚糖 0,5g/L
α-磺化环糊精 0.5mmol/L
4-氨基安替比林 0.3g/L
防腐剂NaN3 0.6g/L
稳定剂EDTA.2Na 1mmol/L
BSA 10g/L
MgCl2 20mM
去干扰剂亚铁氰化钾 0.05mmol/L
抗坏血酸氧化酶 1KU/L
B组份：PH7.0缓冲液Pipes 100mM
聚氧乙烯-聚氧丙烯聚醚 4g/L
防腐剂NaN3 0.9g/L
显色剂TOOS 4.5mmol/L
胆固醇脂酶(CEH) 1kU/L
胆固醇氧化酶(COD) 3kU/L
过氧化物酶(POD) 20KU/L
稳定剂EDTA.2Na 0.5mmol/L
实施例3：
本实施例描述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，是将胆固醇脂酶(CEH)、胆固醇氧化酶(COD)、过氧化物酶(POD)和4-氨基安替比林都设在A组份中，多聚物选用硫酸葡聚糖、聚乙烯硫酸盐和中性多聚物PEGME。
A组份：PH7.0缓冲液Pipes 50mM
聚乙烯硫酸钾盐 5ml/L
中性多聚物PEGME 1.2mg/l
4-氨基安替比林 0.3g/L
防腐剂NaN3 0.6g/L
稳定剂EDTA-2Na 1mmol/L
BSA 10g/L
MgCl2 20mM
硫酸葡聚糖 0,5mM
聚氧乙烯表面活性剂 1g/L
去干扰剂亚铁氰化钾 0.05mmol/L
CEH 1000U/L
COD 2000U/L
POD 10KU/L
B组份：
PH7.0缓冲液Tris 100mM
防腐剂NaN3 0.9g/L
显色剂TOOS 4.5mmol/L
Thesit 3ml/L
稳定剂EDTA.2Na 0.5mmol/L
Claims (6)
1、一种低密度脂蛋白胆固醇测定方法，其特征是首先第一步利用多聚物和表面活性剂对低密度脂蛋白(LDL)的特异作用形成稳定复合物掩蔽，其它脂蛋白在缺乏偶联剂条件下，在表面活性剂、胆固醇酶联试剂作用下被反应清除；然后第二步通过加入表面活性剂释放出低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，再在表面活性剂、胆固醇酶联试剂作用下参于完整的Trinder反应，根据不同敏感的显色剂，在波长546nm至700nm内选择确定的波长处测得吸光度与低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量成正比，而求得低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量。
2、根据权利要求1所述的低密度脂蛋白胆固醇测定方法，其特征是所述的多聚物是聚乙烯硫酸盐或中性多聚物PEGME或硫酸葡聚糖或α-磺化环糊精及其相互组合。
3、一种低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，其特征是它分为两个组份A、B，由胆固醇脂酶(CEH)、胆固醇氧化酶(COD)和过氧化物酶(POD)组成的胆固醇酶联试剂和4-氨基安替比林可以全部设在A组份中，也可以全部设在B组份中或A、B组份中分别设置；A、B组份的其它成份组成是：
A组份：
缓冲液 5-500mmol/L
多聚物 0.1mg-5000mg/L
防腐剂 0.005-10g/L
稳定剂 0.05-500g/L
表面活性剂 0.05g-10g/L
去干扰剂 0.005-5mmol/L或0.1-5KU/L
B组份：
缓冲液 5-500mmol/L
表面活性剂 0.05-10g/L
显色剂 0.1-10mmol/L
稳定剂 0.03-300g/L
防腐剂 0.005-10g/L
4、根据权利要求3所述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，其特征是它分为两个组份A、B：
A组份：缓冲液 5-500mmol/L
聚乙烯硫酸盐 100mg-5000mg/L
中性多聚物PEGME 0.1-200mg/L
4-氨基安替比林 0.05-1g/L
防腐剂 0.005-10g/L
稳定剂 0.05-500g/L
稳定剂EDTA.2Na 0.1-20mmol/L
表面活性剂 0.05-10g/L
去干扰剂 0.005-5mmol/L或0.1-5KU/L
胆固醇脂酶(CEH) 0.2-10KU/L
胆固醇氧化酶(COD) 0.2-10KU/L
过氧化物酶(POD) 0.1-80KU/L
B组份：缓冲液 5-500mmol/L
表面活性剂 0.01-30g/L
显色剂 0.1-10mmol/L
稳定剂 0.03-300g/L
防腐剂 0.005-10g/L
5、根据权利要求3所述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，其特征是它分为两个组份A、B：
A组份：缓冲液 5-500mmol/L
硫酸葡聚糖 0.05-5g/L
α-磺化环糊精 0.1-5mmol/L
4-氨基安替比林 0.05-1g/L
防腐剂 0.005-10g/L
稳定剂 0.05-500g/L
去干扰剂 0.005-5mmol/L或0.1-5KU/L
B组份：缓冲液 5-500mmol/L
表面活性剂 0.1-20g/L
显色剂 0.1-10mmol/L
防腐剂 0.005-10g/L
胆固醇脂酶(CEH) 0.2-15KU/L
胆固醇氧化酶(COD) 0.2-20KU/L
过氧化物酶(POD) 0.1-50KU/L
6、根据权利要求3或4或5所述的低密度脂蛋白胆固醇测定试剂，其特征是所述的稳定剂包括EDTA-2Na，其含量是0.1-50mmol/L。
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