CN107505272B - 低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry

Abstract

本发明低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其使用方法涉及生化检测领域。其目的是为了提供一种稳定性高、毒性低、准确度和精密度高的低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒其使用方法。本发明的试剂盒包括试剂1：表面活性剂；聚乙二醇；十二烷基磺酸钠；Emulgen A9系列；胆固醇氧化酶；胆固醇酯酶；抗坏血酸氧化酶；过氧化氢酶；4‑氨基安替比林等；试剂2：聚乙二醇辛基苯基醚；胆酸盐；复合稳定剂；牛血清白蛋白；过氧化物酶；3‑乙基‑N‑(3‑磺丙基)‑3‑甲基苯胺钠盐等。本发明的试剂盒中加入的proclin系列是一种新型的生物防腐剂，与多种酶具有良好的相容性，具有较好的稳定性和低毒性，维持试剂的稳定性。

Description

低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及生化检测领域，特别是涉及一种借助于测定材料的化学物理性质来测定材料的试剂盒。
背景技术
除了和白蛋白结合的游离脂肪酸外，存在于血液的脂质掺入脂蛋白的结构中，并且它们以乳糜微粒(CHM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)等等的形式存在。胆固醇特别地分布于VLDL、LDL和HDL。已知LDL起运输胆固醇的作用，并且高水平的LDL促进动脉硬化。已知血液中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的测量成为动脉硬化发生和进行的指示物。
Burstein M等人(Rapid Method for the Isolation of Lipoproteins fromHuman Serum by Precipitation with Polyanions，J.Lipid Research11：583，1970)描述，主要地通过使用聚阴离子化合物使除了HDL外的脂蛋白特异凝集。然而，该文献描述的聚阴离子化合物特异地和非LDL(VLDL或者HDL)形成复合物是困难的。
CC Heuck和G Schlierf(Beta-lipoprotein cholesterol quantitation withpolycations，Clin Chem 1977 23：536-540)描述通过使用聚乙烯亚胺和阳离子交换树脂排除VLDL和HDL，从而定量脂蛋白胆固醇。然而，该文献描述的方法难以解决其要求孵育15分钟或更长，以及其需要两类试剂的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种稳定性高、特异性强、准确度和精密度高的低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒其使用方法。
本发明涉及一种低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂1和试剂2；
所述试剂1包括：
Figure BDA0001375853720000011
Figure BDA0001375853720000021
其余为GOOD’S缓冲液MOPS(3-(N-吗啡啉)丙磺酸)(MOPS为缓冲液的主要成分)，所述缓冲液pH值为7.0；
所述试剂2包括：
Figure BDA0001375853720000022
其余为GOOD’S缓冲液MOPS，所述缓冲液pH值为7.0。
环糊精是一类表面活性剂和相转移催化剂，能选择性地进行某些有机反应。
优选地，所述复合稳定剂包括吐温80 10～13g/L，谷氨酸20～30g/L，谷胱甘肽1～3g/L，海藻糖50～60g/L，十二烷基二甲基甜菜碱2～6g/L，卵磷脂3～6g/L，缓冲液100～120mmol/L；其为申请号为201610166107.2的多种抗体的复合稳定剂及其使用方法中的复合稳定剂。
优选地，所述试剂1包括：
Figure BDA0001375853720000023
Figure BDA0001375853720000031
其余为GOOD’S缓冲液MOPS，所述缓冲液pH值为7.0；
所述试剂2包括：
Figure BDA0001375853720000032
其余为GOOD’S缓冲液，所述缓冲液pH值为7.0。
本发明试剂盒采用过氧化氢酶(CAT)清除法测定血清中的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量。基本原理：反应第一步：试剂1中的表面活性剂1作用于血清中的HDL、VLDL、CM，使其释放出胆固醇部分，在胆固醇氧化酶(CHOD)、胆固醇脂酶(CHER)的催化作用下生成过氧化氢，H2O2被过氧化氢酶分解为H2O和O2；反应第二步：试剂2中的表面活性剂2与低密度脂蛋白(LDL)相互作用，使其胆固醇释放出来，胆固醇氧化酶(CHOD)、胆固醇脂酶(CHER)催化LDL-C生成H2O2，通过Trinder显色反应，进行LDL-C的含量测定。
本发明还涉及一种低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的使用方法，所述方法包括以下步骤：
该检测试剂盒的测定方法为两点终点法；
(1)将300份试剂1和3份待测样品混合均匀，37℃孵育后得到反应液1；
(2)然后加入100份试剂2混合均匀，得到反应液2，测定反应液2的吸光度A1；
(3)5min后再次测反应液2的吸光度A2，测定主波长为600nm、副波长为700nm；
(4)用步骤(1)-(3)的操作对低密度脂蛋白胆固醇标准液吸光度进行测定，测得吸光度A3和A4，测定主波长为600nm、副波长为700nm；
(5)用吸光度差值进行计算，根据式1计算低密度脂蛋白胆固醇浓度；
式1：
低密度脂蛋白胆固醇浓度＝△A样品/ΔA标准液×标准液浓度；
ΔA样品＝A2-A1；
ΔA标准液＝A4-A3；
上述份数均为体积份数。
本发明低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒其使用方法与现有技术不同之处在于：
1、本发明低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒加入的多种表面活性剂(环糊精、聚乙二醇、SDS)，在反应第一步可以起到保护LDL-C，且能够清除LDL-C，测试过程中不会产生沉淀，提高测试结果的准确性。试剂2中加入的曲拉通X-100、胆酸盐等表面活性剂，对于LDL的裂解具有较好的特异性。
2、本发明低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的显色反应以4-AAP作为显色底物，与TOOS偶联发生显色反应，试剂1中仅加入4-4-AAP，无显色反应，试剂2中TOOS后发生显色反应，然后通过比色法进行测定。
3、本发明低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒中的抗坏血酸氧化酶可以有效抵抗样本中存在的VC的干扰。加入的牛血清白蛋白与复合稳定剂中的各成分可以起到保持试剂中酶的稳定性作用。加入的蛋白酶抑制剂叠氮钠，能够有效抑制过氧化氢酶的活性，加入的proclin系列是一种新型的生物防腐剂，与多种酶具有良好的相容性，具有较好的稳定性和低毒性，维持试剂的稳定性。
附图说明
图1为本发明低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒理论值与测定值线性相关性图；
图2为对照试剂盒和本发明低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的线性相关性图。
具体实施方式
通过以下实施例和验证试验对本发明的低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒其使用方法作进一步的说明。
实施例1
本实施例的低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒原料及配比如下：
试剂盒由试剂1和试剂2组成；
试剂1如下：
Figure BDA0001375853720000051
其余为GOOD’S缓冲液MOPS(3-(N-吗啡啉)丙磺酸)(MOPS为缓冲液的主要成分)，所述缓冲液pH值为7.0；
试剂2如下：
Figure BDA0001375853720000052
其余为GOOD’S缓冲液MOPS，所述缓冲液pH值为7.0。
实施例2
本实施例的低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒原料及配比如下：
试剂盒由试剂1和试剂2组成；
试剂1如下：
Figure BDA0001375853720000061
其余为GOOD’S缓冲液MOPS(3-(N-吗啡啉)丙磺酸)(MOPS为缓冲液的主要成分)，所述缓冲液pH值为7.0；
试剂2如下：
Figure BDA0001375853720000062
其余为GOOD’S缓冲液MOPS，所述缓冲液pH值为7.0。
实施例3
本实施例的低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒原料及配比如下：
试剂盒由试剂1和试剂2组成；
试剂1如下：
Figure BDA0001375853720000071
其余为GOOD’S缓冲液MOPS，所述缓冲液pH值为7.0；
试剂2如下：
Figure BDA0001375853720000072
其余为GOOD’S缓冲液，所述缓冲液pH值为7.0。
上述实施例1-3中采用的复合稳定剂包括吐温80 10～13g/L，谷氨酸20～30g/L，谷胱甘肽1～3g/L，海藻糖50～60g/L，十二烷基二甲基甜菜碱2～6g/L，卵磷脂3～6g/L，缓冲液100～120mmol/L；其为申请号为201610166107.2的多种抗体的复合稳定剂及其使用方法中的复合稳定剂。
实施例4
采用实施例1-3制得的产品对样品中低密度脂蛋白胆固醇进行检测，步骤如下：
(1)将300份试剂1和3份待测样品混合均匀，37℃孵育后得到反应液1；
(2)然后加入100份试剂2混合均匀，得到反应液2，测定反应液2的吸光度A1；
(3)5min后再次测反应液2的吸光度A2，测定主波长为600nm、副波长为700nm；
(4)用步骤(1)-(3)的操作对低密度脂蛋白胆固醇标准液吸光度进行测定，测得吸光度A3和A4，测定主波长为600nm、副波长为700nm；
(5)用吸光度差值进行计算，根据式1计算低密度脂蛋白胆固醇浓度；
式1：
低密度脂蛋白胆固醇浓度＝△A样品/ΔA标准液×标准液浓度；
ΔA样品＝A2-A1；
ΔA标准液＝A4-A3；
上述份数均为体积份数。
验证试验
对上述实施例1～3中的产品进行测试，并与其他公司同类型产品进行对比，对照试剂盒为一国内市售的LDL-C检测试剂盒，其成分及配方为：试剂1包括Good’s缓冲液pH7.0；试剂2包括胆固醇酯酶2KU/L、胆固醇氧化酶2KU/L、过氧化物酶3KU/L。
测试1
配制低密度脂蛋白胆固醇不同浓度的标准样本，分别为0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mmol/L，分别用本发明试剂盒和对照试剂盒测定其浓度。结果如表1。
表1线性范围对比
Figure BDA0001375853720000081
结果可以看出：在0-10mmol/L浓度范围内，本发明试剂盒的测试值能够达到理论值且二者线性相关性较好(图1)，而对照试剂盒在样本浓度≧4.0mmol/L时，测试结果都低于理论值，不能满足要求，由此可见本试剂盒的线性范围较广。
测试2
以对照试剂盒和本发明试剂盒为材料，采用朗道校准品进行校准，以罗氏高值和低值质控进行测定，结果如表2。
表2准确度对比
Figure BDA0001375853720000091
结果表明：本发明试剂盒的测试结果更接近靶值，准确度比对照试剂盒高。
测试3
使用贝克曼AU480生化分析仪进行测定，以本试剂盒与对照试剂盒为材料，用朗道校准品进行校准，并测定40例临床样本的LDL-C的含量，结果表明本试剂盒测试结果与对照试剂所得结果有良好的相关性(如表3和图2)。
表3线性相关性测试结果对比
Figure BDA0001375853720000092
Figure BDA0001375853720000101
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式作出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括试剂1和试剂2；
所述试剂1包括：
环糊精 6~10g/L；
聚乙二醇2000 10~20g/L；
十二烷基磺酸钠 1~5g/L；
Emulgen A9系列 0.1~0.5%；
胆固醇氧化酶 7~10KU/L；
胆固醇酯酶 4~7KU/L；
抗坏血酸氧化酶 5~10KU/L；
过氧化氢酶 3~5KU/L；
4-氨基安替比林 1~5g/L；
proclin系列防腐剂 0.01~5g/L；
复合稳定剂 1wt%；
牛血清白蛋白 15~30g/L；
其余为GOOD’S缓冲液MOPS，所述GOOD’S缓冲液MOPS的pH值为7.0；
所述试剂2包括：
聚乙二醇辛基苯基醚 5~10g/L；
胆酸盐 1~10g/L；
复合稳定剂 1wt%；
牛血清白蛋白 15~30g/L；
过氧化物酶 10~40KU/L；
3-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐 1~5g/L；
叠氮钠 0.01~5g/L；
其余为GOOD’S缓冲液MOPS，所述GOOD’S缓冲液MOPS的pH值为7.0。
2.根据权利要求1所述的低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于：所述复合稳定剂包括吐温80 10~13g/L，谷氨酸20~30g/L，谷胱甘肽1~3g/L，海藻糖50~60g/L，十二烷基二甲基甜菜碱2~6g/L，卵磷脂3~6g/L，缓冲液100~120mmol/L。
3.根据权利要求1所述的低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于：
所述试剂1包括：
环糊精 8g/L；
聚乙二醇2000 15g/L；
十二烷基磺酸钠 3g/L；
Emulgen A9系列 0.3%；
胆固醇氧化酶 8.5KU/L；
胆固醇酯酶 5.5KU/L；
抗坏血酸氧化酶 7.5KU/L；
过氧化氢酶 4KU/L；
4-氨基安替比林 3g/L；
proclin系列防腐剂 2.5g/L；
复合稳定剂 1wt%；
牛血清白蛋白 22g/L；
其余为GOOD’S缓冲液MOPS，所述GOOD’S缓冲液MOPS 的pH值为7.0；
所述试剂2包括：
聚乙二醇辛基苯基醚 7.5g/L；
胆酸盐 5.5g/L；
复合稳定剂 1wt%；
牛血清白蛋白 22g/L；
过氧化物酶 25KU/L；
3-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐 3g/L；
叠氮钠 2.5g/L；
其余为GOOD’S缓冲液MOPS，所述GOOD’S缓冲液MOPS 的pH值为7.0。
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