KR20000004844A - Ldl-콜레스테롤의 측정 방법 - Google Patents
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Abstract
시료중 저밀도 리포단백질의 콜레스테롤의 양은 시료를 하나 이상의 시약 용액과 접촉시켜 구체적인 예 및 양성 계면활성제의 존재하에서 반응을 수행한 다음, 반응 생성물의 광학 측정을 수행하므로써 측정될 수 있다.
Description
본 발명은 혈청, 혈장 등과 같은 생체로 부터 유래된 시료에 존재하는 저밀도 리포단백질 (이후, "LDL" 로 약칭) 중 콜레스테롤의 측정 방법, 및 상기 방법을 수행하는데 사용되는 시약, 시약 조성물 및 키트에 관한 것이다.
혈청중 지질의 주요 성분은 콜레스테롤, 트리글리세리드, 인지질 등이다. 상기 혈청 지질은 아포단백질에 결합하여 혈액내에서 순환되는 리포단백질을 형성한다. 리포단백질은 밀도 차이에 의해서 고밀도 리포단백질 (HDL), 저밀도 리포단백질 (LDL), 최저밀도 리포단백질 (VLDL), 카이로미크론 (CM) 등으로 분류될 수 있다. 상기 리포단백질중, HDL 은 조직에 침적된 과량의 콜레스테롤을 간으로 운반하는 기능을 가지며, 항-동맥경화성 작용을 갖는다. 반면, LDL 은 간에서 조직으로의 콜레스테롤의 주요 운반체이다. LDL 의 증가는 동맥경화증의 발생과의 밀접한 연관성을 갖는 것으로 보인다.
그러므로, LDL 중 콜레스테롤 (이후, "LDL-콜레스테롤" 로 약칭) 은 동맥경화증 및 허혈성 심장질환 (관상 동맥경화성 질환) 에 대한 위험한 인자로 간주된다. 그러므로, LDL-콜레스테롤의 함량은 상기 질환의 진단, 치료 및 예방의 중요한 표식이다.
LDL-콜레스테롤을 측정하기 위한 방법으로써, 침전법, 초원심분리법, 전기영동법 및 프리데발트 (Friedwald) 법이 공지되어 있다. 상기 방법중, 침전법, 초원심분리법 및 전기영동법은 침전/초원심분리 처리, 초원심분리 처리 또는 전기영동처리에 의해서 LDL 이외의 불필요한 리포단백질로 부터 LDL 의 분리와 같은 예비처리 단계로 인해 복잡한 공정을 포함한다. 그러므로, 상기 방법들은 임상 시험 분야에서 널리 사용되는 자동분석기만을 이용하는 직접적인 측정이 불가능하다는 불리한 점이 있다.
반면, 프리데발트 식에 의해 공지된 프리데발트 방법에 따르면, 콜레스테롤 총수치, HDL-콜레스테롤 수치 및 트리글리세리드 수치가 계산을 위해서 사용되는데, 400 mg/dl 이상의 트리글리세리드를 함유하는 시료를 이용하는 경우에는 정확한 LDL-콜레스테롤 양의 측정이 불가능하다는 문제가 있다.
상기 언급된 문제들을 해결하기 위해서, 각종 방법이 최근에 개발되었다. 그중 한 방법은, 예를 들면, JP-A 7-280812 에 개시된 방법이다.
상기 방법은 응집제 및/또는 항체를 이용하여 LDL 을 응집시키고, 정량적 반응에 속하지 않는 또다른 반응 시스템으로 도입하므로써 LDL 이외의 리포단백질중에 함유된 콜레스테롤을 제거(소모)하고, 응집된 LDL 을 정량적 반응이 수행될 수 있을 정도로 계면활성제 및/또는 무기염을 이용하여 용해시키고, LDL-콜레스테롤로 정량적 반응을 수행하므로써 용액의 흡광도를 측정하는 것으로 이루어진다.
그러나, 상기 방법은 측정시 3-시약 시스템 또는 4-시약 시스템을 이용해야하므로, 이는 다수-시약 시스템을 이용하는 몇몇 자동분석기에만 이용될 수 있다. 임상 시험을 위해 통상적으로 사용되는 많은 자동분석기들은 1-시약 방법 또는 2-시약 방법에 이용될 수 있으므로, 상기 방법에 의한 측정을 수행하는데는 이용될 수 없다. 더우기, 상기 방법은 또한 다수의 시약이 사용되므로인해 측정값의 반복성이 저하되므로 불리하다.
번거로운 예비처리없이 LDL-콜레스테롤을 측정하는 방법으로써, JP-A 58-165800 에 개시된 방법이 있다. 그러나, 이 방법은 하기와 같은 이유로 인해 실용적인 측정방법이 될 수 없다 : 시약에 있어서, 예를 들어, 계면활성제 및 콜레스테롤 에스테라제 (이후, "CHE" 로 약칭) 의 사용 농도가 한정되기때문에, 시약의 제조에 문제점이 있고; 측정시의 pH , 측정시간의 간격 등과 같은 측정 조건들이 엄격하게 지정되어야하며; HDL 중 콜레스테롤이 어느 정도 반응하기때문에, LDL-콜레스테롤은 예를 들어, 속도 검정과 같은 운동학적 측정만으로는 측정될 수 없다.
도 1 은 시약 용액 1 을 사용하여 실시예 1 에서의 각종 리포단백질 분획 시료에 대해 수득된 반응 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 2 는 시약 용액 2 를 사용하여 실시예 1 에서의 각종 리포단백질 분획 시료에 대해 수득된 반응 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 3 은 시약 용액 3 을 사용하여 실시예 1 에서의 각종 리포단백질 분획 시료에 대해 수득된 반응 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 4 는 시약 용액 4 를 사용하여 실시예 1 에서의 각종 리포단백질 분획 시료에 대해 수득된 반응 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 5 는 시약 용액 5 를 사용하여 실시예 1 에서의 각종 리포단백질 분획 시료에 대해 수득된 반응 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 6 은 시약 용액 6 을 사용하여 실시예 1 에서의 각종 리포단백질 분획 시료에 대해 수득된 반응 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 7 은 시약 용액 7 을 사용하여 실시예 1 에서의 각종 리포단백질 분획 시료에 대해 수득된 반응 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 8 은 시약 용액 8 을 사용하여 실시예 1 에서의 각종 리포단백질 분획 시료에 대해 수득된 반응 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 9 는 시약 용액 9 를 사용하여 실시예 1 에서의 각종 리포단백질 분획 시료에 대해 수득된 반응 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 10 은 시약 용액 10 을 사용하여 실시예 1 에서의 각종 리포단백질 분획 시료에 대해 수득된 반응 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 11 은 시약 용액 11 을 사용하여 실시예 1 에서의 각종 리포단백질 분획 시료에 대해 수득된 반응 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 12 는 시약 용액 12 를 사용하여 실시예 1 에서의 각종 리포단백질 분획 시료에 대해 수득된 반응 곡선을 나타내는 그래프이다.
도 13 은 시약 용액 13 을 사용하여 실시예 1 에서의 각종 리포단백질 분획 시료에 대해 수득된 반응 곡선을 나타내는 그래프이다.
상기과 같은 상황에 있어서, 본 발명의 목적은 통상적인 방법에서 수행되어야만 하는 LDL 이외의 불필요한 리포단백질로 부터 LDL 을 분리하기 위한 번거로운 예비처리없이 자동분석기 등을 직접 이용하여 생체로 부터 유래된 시료중 LDL-콜레스테롤의 양을 측정할 수 있는 방법; 및 상기 방법에 사용되는 시약을 제공하는 것이다.
본 발명은, 하기로 구성된, 시료중 저밀도 리포단백질중 콜레스테롤의 양을 측정하는 방법을 제공한다 :
시료를 하나 이상의 시약 용액과 접촉시켜 다가음이온 (polyanion) 및 양성 (amphoteric) 계면활성제의 존재하에서 반응을 수행하고, 및
상기 수득된 반응 생성물을 광학 측정하여 콜레스테롤의 양을 측정한다.
본 발명은 또한 상기 언급된 방법에 사용되는 시약 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명의 시료중 저밀도 리포단백질중 콜레스테롤의 양을 측정하는 방법은 하기와 같이 이루어진다 :
시료를 하나 이상의 시약 용액과 접촉시켜 다가음이온 및 양성 계면활성제의 존재하에서 반응을 수행하고, 및
상기 수득된 반응 생성물을 광학 측정하여 콜레스테롤의 양을 측정한다.
상기 방법에 있어서, 광학 측정은 시료를 제 1 시약 용액과 접촉시켜 수득된 용액의 흡광도 (OD1) 를 측정하고, OD1측정후 OD1측정용 용액과 제 2 시약 용액을 접촉시켜 수득된 용액의 흡광도 (OD2) 를 측정하므로써 수행된다.
본 발명의 방법은 상기 방법에 사용된 하나 이상의 시약 용액을 참고로 하여 하기에서 설명된다.
본 발명에 따르면, 저밀도 리포단백질중 콜레스테롤의 양은 생체로 부터 유래된 시료를 ① CHE 및 콜레스테롤 옥시다제 (이후, "CO " 로 약칭) 와 반응시키거나, 또는 ② CHE, 콜레스테롤 탈수소효소 (이후, "CHD" 로 약칭) 및 NAD(P) (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (포스페이트)) 와 반응시키고, 생성된 과산화수소 또는 NAD(P)H (환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (포스페이트)) 의 양을 기준으로 하여 시료중의 콜레스테롤의 양을 측정하는 것으로 이루어지며, 이는 다가음이온 및 양성 계면활성제가 반응 시스템에 존재하도록 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 저밀도 리포단백질중 콜레스테롤의 양을 측정하기 위한 시약 조성물을 제공하는데, 상기 시약 조성물은, 생체로 부터 유래된 시료를 ① CHE 및 CO, 또는 ② CHE, CHD 및 NAD(P) 와 반응시키고, 생성된 과산화수소 또는 NAD(P)H 의 양을 기준으로 하여 시료중 콜레스테롤의 양을 측정하기 위한 시약중에 다가음이온 및 양성 계면활성제를 혼입시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 ① 다가음이온 및 양성 계면활성제, ② CHE, ③ CO, 퍼옥시다제 (이후, "POD" 로 약칭) 및 커플링제 (coupler) 및/또는 현색제 (developer), 및 ④ 수성 매질을 함유하는 제 1 시약 용기 및 수성 매질 및 선택적으로 현색제 또는 커플링제를 함유하는 제 2 시약 용기로 구성된 저밀도 리포단백질중 콜레스테롤의 양을 측정하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 ① 다가음이온 및 양성 계면활성제, ② CHE, ③ CO, ④ 카탈라제 (이후, "CAT" 로 약칭) 및 ⑤ 수성 매질을 함유하는 제 1 시약 용기 및 CAT 저해제 및 수성 매질을 함유하는 제 2 시약 용기로 구성되고, POD, 커플링제 및 현색제 각각이 제 1 시약 용기 및 제 2 시약 용기중 적어도 하나중에 함유되는 저밀도 리포단백질중 콜레스테롤의 양을 측정하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 ① 다가음이온, ② 양성 계면활성제, ③ CHE, ④ CHD, ⑤ NAD(P) 및 ⑥ 수성 매질을 함유하는 제 1 시약 용기 및 ① 수성 매질을 함유하는 제 2 시약 용기로 구성된 저밀도 리포단백질중 콜레스테롤의 양을 측정하기 위한 키트를 제공한다.
LDL 이외의 불필요한 리포단백질로 부터 LDL 을 분리하기 위한 예비처리없이 자동분석기에 의해 직접 LDL-콜레스테롤의 양을 측정할 수 있는 방법을 개발하기 위해서, 본 발명자들은 열심히 연구한 결과 생체로 부터 유래된 시료중 콜레스테롤의 양을 다가음이온 및 양성 계면활성제의 존재하에서 측정하는 경우, LDL 이외의 리포단백질중 콜레스테롤은 LDL-콜레스테롤의 반응만을 저해 (달리 말하면, 지연 또는 일시적으로 중단) 시켜 LDL-콜레스테롤이 반응하기 전에 상기 반응을 수행하므로써 제거(소모)될 수 있으므로, LDL 중의 콜레스테롤의 양은 LDL 이외의 불필요한 리포단백질을 분리시키지 않고 특이적으로 측정될 수 있다는 것을 발견하였다. 그리하여 본 발명이 달성되었다.
생체로 부터 유래된 시료중 콜레스테롤의 양을 측정하는 방법으로써, 원칙적으로, 시료중 콜레스테롤은 CHE 와 반응하여 유리 콜레스테롤 및 지방산으로 분해된 다음, ① CO 을 유리 콜레스테롤과 반응시켜 생성된 과산화수소를 측정하거나, 또는 ② CHD 및 NAD(P) 를 유리 콜레스테롤과 반응시켜 생성된 NAD(P)H 를 측정하는 방법이 예시될 수 있다. 보다 구체적으로, 효소 반응들을 이용하는 하기 방법들이 예시될 수 있다 : (1) 산화 발색법, 이는, 예를 들어, 생체로 부터 유래된 시료중 콜레스테롤 에스테르를 CHE 를 이용하여 유리 콜레스테롤과 지방산으로 분해시키고, 상기 유리 콜레스테롤을 처음부터 존재하는 유리 콜레스테롤과 함께 CO 를 이용하여 콜레스트-4-덴-3-온 및 과산화수소로 산화시키고, 산화성 발색 시약 (예를 들어, 커플링제 및 현색제의 조합, 또는 산화하여 그 자체로 발색가능한 발색 시약) 과 생성된 과산화수소의 산화 발색 반응을 수행하고, 생성되는 산화된 염료의 양을 비색정량적으로 측정하는 것으로 이루어지고, 및 (2) 자외선 측정 방법, 이는, 예를 들어, 생체로 부터 유래된 시료중 콜레스테롤을 CHE 를 이용하여 유리 콜레스테로 및 지방산으로 분해하고, 상기 유리 콜레스테롤을 처음부터 존재하는 유리 콜레스테롤과 함께 CHD 의 존재하에 NAD(P) 와 반응시키고, 340 nm 에서 생성된 NAD(P)H 의 양을 측정하는 것으로 이루어진다.
본 발명의 방법은 상기 방법들중 어느 하나에 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에 따르면, 상기 예시화된 방법중 어느 하나를 수행하는 중에 다가음이온 및 양성계면활성제를 반응 시스템중에 존재시키는 것으로 충분하다. 보다 구체적으로, 생체로 부터 유래된 시료를 우선 다가음이온과 양성 계면활성제와 접촉시켜 시료중의 LDL-콜레스테롤의 반응을 저해(즉, 지연 또는 일시적으로 중단)시킨다. 그러므로, LDL-콜레스테롤의 반응 보다 LDL 이외의 리포단백질중 콜레스테롤의 반응이 선행되므로써 상기 콜레스테롤이 제거 또는 소모된다. 이어서, LDL-콜레스테롤의 반응에 의해 생성된 상기 언급된 생성물의 양만을 측정한다.
본 발명의 방법에 따른 측정 방법의 구체적인 예들은 하기와 같다.
[방법 1]
다가음이온 및 양성 계면활성제의 존재하에서, CHE 및 CO 는 생체로 부터 유래된 시료에 작용하여 과산화수소를 생성시키고, POD 및 산화성 발색 시약 (예를 들어, 커플링제 및 현색제의 조합, 또는 산화하여 그 자체로 발색가능한 발색 시약) 은 생성된 과산화수소에 작용하여 산화된 염료를 생성한다. 2 개의 상이한 시점에서의 흡광도를 각각 측정하여, 시료중의 LDL-콜레스테롤의 양을 흡광도를 기준으로 하여 산정한다.
[방법 2]
다가음이온 및 양성 계면활성제의 존재하에서, CHE, CHD 및 NAD(P) 는 생체로 부터 유래된 시료중에 작용하여 NAD(P)H 를 생성하고, 이후 2 개의 상이한 시점에서의 흡광도를 각각 측정하고, 시료중의 LDL-콜레스테롤의 양을 흡광도를 기준으로 산정한다.
[방법 3]
다가음이온 및 양성 계면활성제의 존재하에서, CHE 및 CO 는 생체로 부터 유래된 시료에 작용하여 과산화수소를 생성하고, POD 및 커플링제 (또는 현색제) 의 조합, 또는 CAT 를 생성된 과산화수소에 작용시켜, 필요에 따라서, 흡광도를 측정한다. 이어서, 현색제 (또는 커플링제), 또는 CAT 저해제 및 산화성 발색 시약의 조합이 상기에 작용하여 산화된 염료를 생성하고, 이후 흡광도를 측정하여 시료중의 LDL-콜레스테롤의 양을 흡광도를 기준으로 산정한다.
[방법 4]
다가음이온 및 양성 계면활성제의 존재하에서, CHE, COD 및 NAD(P) 의 조합, 또는 CHE, CO, POD 및 커플링제 및/또는 현색제의 조합을 생체로 부터 유래된 시료에 작용시키고, 시료를 NDA(P)H (또는 과산화수소) 를 생성하는 반응 시스템에 혼입하고, 필요에 따라서, 흡광도를 측정한다. 이어서, CO, POD, 산화성 발색 시약 및 CHD 저해제의 조합, 또는 CHD, NAD(P) 및 CO 저해제의 조합은 상기에 작용하여 산화된 염료 (또는 NAD(P)H) 를 생성한다. 흡광도를 측정하여 시료중 LDL-콜레스테롤의 양을 흡광도를 기준으로 산정한다.
상기 방법 1 및 2 각각에 있어서, 2 개의 상이한 시점이라 구체적으로 하기와 같다 : LDL 이외의 리포단백질중 콜레스테롤 반응의 실질적인 완료 후 및 LDL-콜레스테롤의 반응 개시전의 시점; 및 LDL-콜레스테롤 반응의 실질적인 완료후 시점.
상기 방법 3 및 4 각각에 있어서, 생체로 부터 유래된 시료중 LDL-콜레스테롤의 양은 단지 한 시점, 예를 들어, LDL-콜레스테롤의 반응 완료후 시점에서만 흡광도를 측정하므로써 측정될 수 있는 있으나, 상기 방법 1 및 2 에서와 같이 2 개의 상이한 시점에서의 각각의 흡광도의 동일한 측정이 측정의 정확도를 더욱 높힌다는 점에서 바람직할 수 있다.
2 개의 상이한 시점은 측정 방법, 다가음이온 및 양성 계면활성제의 종류 및 사용 농도, 기타 시약 (예를 들어, 효소) 의 종류 및 사용 농도 등에 따라 다양하므로, 예를 들어, 각각의 리포단백질 분획에 대한 반응성 (예를 들어, 반응 곡선) 을 조사하므로써 적절하게 결정될 수 있다.
본 발명의 방법은 1-시약 방법, 2-시약 방법 또는 3 개 이상의 시약 용액을 사용하는 방법중 어느 하나일 수 있다. 그러나, 실용적인 목적을 위해서는, 상기 방법 3 및 4 각각은 2-시약 방법 또는 3 개 이상의 시양 용액을 이용하는 방법이 바람직하다.
3 개 이상의 시약 용액을 사용하는 방법에 있어서, 다가음이온 및 양성 계면활성제가 시약 용액에 혼입되어 생체로 부터 유래된 시료와 직접 혼합되는 것이 바람직하다. 상기 방법 1, 2 및 4 각각에 있어서, POD 및 커플링제 및/또는 현색제의 조합, 또는 NAD(P) 가 시약 용액에 혼합되어 LDL-콜레스테롤의 반응 개시전에 첨가되는 것이 바람직할 수 있다. 상기 방법 3 에 있어서, POD 및 커플링제의 조합, POD 및 현색제의 조합, 또는 CAT 는 시약 용액에 혼입되어 LDL-콜레스테롤의 반응 개시전에 첨가되는 것이 바람직할 수 있다.
2-시약 방법으로써 본 발명의 방법을 수행하는 구체적인 예는 하기와 같다.
예를 들어, 상기 방법 1 또는 2 를 실행하는 경우, 생체로 부터 유래된 시료를 ① 다가음이온 및 양성 계면활성제, ② CHE, ③ CO, POD 및 산화성 발색 시약의 조합, 또는 CHD 및 NAD(P) 의 조합, 및 ④ 수성 매질로 이루어진 제 1 시약 용액과 혼합한 다음, 흡광도 (OD1) 를 측정한다. 이어서, 상기 혼합물을 수성 매질로 이루어진 제 2 시약 용액과 혼합한 다음, 흡광도 (OD2) 를 측정한다. 상기 흡광도들을 기준으로 하여, 시료중 LDL-콜레스테롤의 양을 산정한다.
예를 들어, 방법 3 을 실행하는 경우, 생체로 부터 유래된 시료를 ① 다가음이온 및 양성 계면활성제, ② CHE, ③ CO, ④ POD 및 커플링제 (또는 현색제) (또는 ④ CAT), 및 ⑤ 수성 매질로 이루어진 제 1 시약 용액과 혼합한 다음, 흡광도 (OD1) 를 측정한다. 이어서, 상기 혼합물을 ① 현색제 (또는 커플링제) (또는 ① CAT 저해제) 및 ② 수성 매질로 이루어진 제 2 시약 용액과 혼합한 다음, 흡광도 (OD2) 를 측정한다. 상기 흡광도들을 기준으로, 시료중 LDL-콜레스테롤의 양을 산정한다. CAT 가 제 1 시약 용액에 혼입된 경우, POD, 커플링제 및 현색제 각각은 제 1 시약 용액 및 제 2 시약 용액중 적어도 하나에 혼입된다.
예를 들어, 상기 방법 4 를 실행하는 경우, 생체로 부터 유래된 시료를 ① 다가음이온 및 양성 계면활성제, ② CHE, ③ CHD 및 NAD(P) (또는 ③ CO, POD, 및 커플링제 및/또는 현색제) 및 ④ 수성 매질로 이루어진 제 1 시약 용액과 혼합한 다음, 흡광도 (OD1) 를 측정한다. 이어서, 상기 혼합물을 ① 수성 매질 및 ② CO, POD, 산화성 발색 시약 및 CHD 저해제 (또는 ② CHD, NAD(P) 및 CO 저해제) 로 이루어진 제 2 시약 용액과 혼합한 다음, 흡광도 (OD2) 를 측정한다. 상기 흡광도들을 기준으로, 시료중 LDL-콜레스테롤의 양을 산정한다.
상기 방법 각각에 있어서, OD1및 OD2각각의 측정하는 시점은 측정 방법, 다가음이온 및 양성 계면활성제의 종류 및 사용 농도, 기타 시약 (예를 들어, 효소) 의 종류 및 사용 농도 등에 따라서 다양하므로, 각각의 리포단백질 분획에 대한 반응성 (예를 들어, 반응 곡선) 을 조사하므로서 적절하게 결정될 수 있다.
본 발명의 방법이 상기 방법 1 또는 2 의 경우에서 1-시약 방법으로써 실행되는 경우, 실행의 보다 구체적인 예는 하기와 같다.
예를 들어, 생체로 부터 유래된 시료를 ① 다가음이온 및 양성 계면활성제, ② CHE, ③ CO, POD 및 산화성 발색 시약의 조합, 또는 CHD 및 NAD(P) 의 조합, 및 ④ 수성 매질로 이루어진 용액과 혼합한 다음, 흡광도 (OD1) 를 LDL 이외의 리포단백질중 콜레스테롤 반응의 실질적인 완료 후 및 LDL-콜레스테롤의 반응 개시전 시점에서 측정한다. 이어서, LDL-콜레스테롤 반응의 실질적인 완료후 시점에서 흡광도 (OD2) 를 측정한다. 상기 흡광도들을 기준으로 하여, 시료중 LDL-콜레스테롤의 양을 산정한다.
상기 방법의 각각에 있어서, 시료중 LDL-콜레스테롤의 양은 OD1및 OD2를 기준으로 하여 하기와 같이 산정된다 : 흡광도 (OD3) 는 OD2로 부터 OD1[또는 OD1로 부터 유래된 값 (예를 들어, 부피에 대한 보정인자로 OD1를 곱하므로써 수득된 값)] 을 빼므로써 계산되고, 시료중 LDL-콜레스테롤의 양은, 시료로써, 공지된 농도의 LDL-콜레스테롤을 함유하는 표준용액과 같은 표준 제제를 이용하는 것을 제외하고 상기 기재된 바와 같이 동일한 측정을 수행하므로서 이미 수득되어진, LDL-콜레스테롤 농도와 OD3사이의 관계를 나타내는 측정 곡선을 이용하여 수득된 OD3값을 기준으로 결정된다.
본 발명에 있어서, 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제 등은 콜레스테롤 반응을 촉진시키기 위해서 첨가될 수 있다. LDL 이외의 리포단백질에 결합할 수 있는 항체를 또한 첨가하므로써 LDL 이외의 리포단백질중 콜레스테롤의 반응을 촉진시킬 수 있다.
본 발명에 사용된 구성성분의 바람직한 성질 및 그의 사용 농도 등은 하기에서 설명된다.
본 발명에서 사용된 다가음이온으로써, LDL 이외의 리포단백질중 콜레스테롤의 반응이 양성 계면활성제와 함께 다가 음이온을 존재시키므로써 상기 반응을 저해시켜 LDL-콜레스테롤의 반응 전에 수행될 수 있는 한 어떠한 다가음이온도 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "저해되는" 은 "LDL 이외의 리포단백질중 콜레스테롤의 반응과 비교하여 LDL-콜레스테롤의 반응을 지연시키거나, 또는 LDL-콜레스테롤의 반응을 일시적으로 중단시키는" 이란 의미이다. 용어 "저해" 또한 이후 상기와 같은 의미로 사용된다.
다가음이온의 구체적인 예는 헤파린, 인텅스텐산, 덱스트란 술페이트, 황화시클로덱스트린, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 히알루론산, 황화올리고사카라이드, 황화폴리아크릴아미드, 카르복시메틸화 폴리아크릴아미드, 그의 염 등이다. 염으로는 알칼리금속염 (예를 들어, Na 염, K 염 등), 암모늄염 등이 포함된다.
상기 예시된 다가음이온중, 헤파린, 인텅스텐산, 덱스트란 술페이트, 및 그의 염이 바람직하다. 다가음이온의 사용 농도는 양성 계면활성제와 함께 다가음이온의 존재가 LDL-콜레스테롤의 반응을 저해하여 LDL 이외의 리포단백질중 콜레스테롤의 반응이 선행될 수 있는 임의의 농도일 수 있다. 생체로 부터 유래된 시료와 직접 혼합되는 시약 용액중 다가음이온의 농도는 대체적으로 0.0001 % ∼ 10 % (w/v), 바람직하게는 0.001 % ∼ 1 % (w/v) 이다. 상기 예시된 다가음이온은 단독으로 또는 적절히 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 양성 계면활성제로서, 다가음이온과 함께 양성 계면활성제가 존재함으로써, LDL-콜레스테롤의 반응이 저해되어, LDL 이외의 리포단백질 중 콜레스테롤의 반응이 선행되는 한, 임의의 양성 계면활성제가 사용될 수 있다. 양성 계면활성제에는, 예를 들어, 베타인 유도체, 예컨대 알킬 베타인 유도체 (예 : 라우릴 베타인, 스테아릴 베타인, 라우릴디메틸암모늄 베타인, 코코넛 베타인, 코코넛 오일 지방산 아미도프로필 베타인, 라우르산 아미도프로필 베타인, 등), 이미다졸리늄 베타인 유도체 (예 : 2-알킬-N-카르복시메틸-N-히드록시에틸 이미다졸리늄 베타인 예컨대, 2-라우릴-N-카르복시메틸-N-히드록시에틸이미다졸리늄 베타인, 2-운데실-N-카르복시메틸-N-히드록시에틸이미다졸리늄 베타인, 등; 2-알킬-N-카르복시에틸-N-히드록시에틸이미다졸리늄 베타인, 등), 술포베타인 유도체 (예 : N-옥틸-N,N-디메틸-3-암모니오-l-프로판술폰산, N-데실-N,N-디메틸-3-암모니오-l-프로판술폰산, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-l-프로판술폰산, N-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-l-프로판술폰산, N-헥사데실-N,N-디메틸-3-암모니오-l-프로판술폰산, 등), 아미노카르복실산 유도체, 예컨대, 알킬글리신, 알킬비스-(아미노에틸)글리신, 디옥틸폴리아미노에틸 글리신, N-알킬폴리아미노-에틸 글리신, β-알라닌 유도체 등 ; 이미다졸린 유도체, 예컨대, 비스(2-운데실-N-히드록시에틸이미다졸린) 클로로아세트산 착물, 알킬이미다졸린 유도체 등 ; 및 아민 옥시드 유도체 예컨대, 라우릴디메틸아민 옥시드 등이 포함된다.
상기 예시된 양성 계면활성제들 중에서, 라우릴 베타인, 코코넛 오일 지방산 아미도프로필 베타인, 라우르산 아미도프로필 베타인, 2-알킬-N-카르복시메틸-N-히드록시에틸이미다졸리늄 베타인 및 2-알킬-N-카르복시메틸-N-히드록시에틸이미다졸리늄 베타인이 바람직하다.
양성 계면활성제의 사용 농도는 다가음이온과 함께 양성 계면활성제가 LDL-콜레스테롤의 반응을 저해하여, LDL 이외의 리포단백질 중 콜레스테롤의 반응이 선행되는 임의의 농도일 수 있다. 생체로부터 유래된 시료와 직접 혼합되는 시약 용액 중 양성 계면활성제의 농도는 대체적으로 0.0001% 내지 10% (w/v), 바람직하게는 0.001% 내지 1% (w/v) 이다. 상기 예시된 양성 계면활성제는 단독으로 또는 적절히 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명에 사용되는 CO 로서, 당 분야에서 통상적으로 사용되는 것, 예컨대 노카르디아 (Nocardia), 슈도모나스 (Pseudomonas) 속 등에 속하는 미생물에서 유래된 것들, 소 췌장과 같은 동물 기관에서 유래된 것들을 예로 들 수 있다. CO 의 사용량에 대해서는, 예를 들어, 2-시약 방법에서의 제 1 시약 용액 중 CO 의 농도는 대체적으로 0.03 내지 330 u/ml, 바람직하게는 0.07 내지 130 u/ml, 더욱 바람직하게는 0.13 내지 65 u/ml 이다. LDL-콜레스테롤 측정용 최종 시약 용액 중 CO 의 농도는 대체적으로 0.02 내지 250 u/ml, 바람직하게는 0.05 내지 100 u/ml, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 50 u/ml 이다.
1-시약 방법에서, CO 의 사용 농도는 최종 반응 용액 중 상기 농도 범위 중에서 적절하게 선택된다 (이후, 동일하게 적용됨).
본 발명에서 사용되는 CHE 로서, 당 분야에 통상적으로 사용되는 것들, 예컨대 칸디다 (Candida), 슈도모나스 (Pseudomonas) 속 등에 속하는 미생물로부터 유래된 것들, 및 소 췌장과 같은 동물 기관에서 유래된 것들을 예로 들 수 있다. CHE 의 사용량에 대해서는, 예를 들어 2-시약 방법에서 제 1 시약 용액 중 CHE 의 농도는 대체적으로 0.03 내지 330 u/ml, 바람직하게는 0.07 내지 130 u/ml, 더욱 바람직하게는 0.13 내지 65 u/ml 이다. LDL-콜레스테롤 측정용 최종 반응 용액 중 CHE 의 농도는 대체적으로 0.02 내지 250 u/ml, 바람직하게는 0.05 내지 100 u/ml, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 50 u/ml 이다.
본 발명에서 사용되는 POD 로서, 당 분야에서 통상적으로 사용되는 것들, 예컨대 식물 (예 : 양고추냉이, 래디쉬 등)에서 유래된 것들, 미생물 (예 : 곰팡이, 효모 등)에서 유래된 것들, 및 동물의 백혈구, 갑상선 등에서 유래된 것들을 예로 들 수 있다. POD 의 사용량에 대해서는 예를 들어, 2-시약 방법에서 제 1 시약 용액 중 POD 의 농도는 대체적으로 0.1 내지 1,000 u/ml, 바람직하게는 0.25 내지 400 u/ml, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 200 u/ml 이다. LDL-콜레스테롤 측정용 최종 반응 용액 중 POD 의 농도는 대체적으로 0.1 내지 250 u/ml, 바람직하게는 0.25 내지 100 u/ml, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 50 u/ml 이다.
본 발명에서 사용되는 산화성 발색 시약으로서, POD 의 존재 하에 과산화수소와 함께 반응하여, 색을 형성시키는 한, 어떠한 산화성 발색 시약도 사용될 수 있다. 4-아미노안티피리딘 (이후, "4-AA" 로 약칭) 과 같은 커플링제 및 그 커플링제와 산화 축합 시에 염료를 생성할 수 있는 현색제의 조합, 예를 들어, 4-AA 와 페놀계 화합물, 나프톨 화합물 또는 아닐린 화합물의 조합, 3-메틸-2-벤조티아졸리논 히드라존 및 아닐린 화합물의 조합 등 ; 및, 산화 시에 그 자체로 색을 생성할 수 있는 발색제, 예컨대 2,2'-아지노비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산), 트리페닐메탄 로이코 염료, 디페닐아민 유도체, 벤지딘 유도체, 트리알릴이미다졸 유도체, 류코메틸렌 블루 유도체, o-페닐렌디아민 유도체 등을 예로 들 수 있다.
현색제로서, 페놀계 화합물의 구체적인 예는 페놀, p-클로로페놀, 2,4-디클로로페놀 등이다. 나프톨 화합물의 구체적인 예는 1-나프톨, 1-나프톨-2-술폰산, 1-나프톨-2-카르복실산 등이다. 아닐린 화합물의 구체적인 예는 N,N-디에틸아닐린, N-에틸-N-(β-히드록시에틸)-m-톨루이딘, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (DAOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시-4-플루오로아닐린 (FDAOS), N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (HDAOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-m-톨루이딘 (TOOS), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐-에틸렌디민 (EMSE) 등이다.
커플링제 및 현색제의 조합을 사용할 경우, 커플링제의 사용량은 그와 조합되는 커플링제의 종류, 현색제의 종류 등에 따라 변화된다. 예를 들어, 2-시약 방법에서 제 1 시약 용액 중 커플링제의 농도는 대체적으로 0.01 내지 400 mM, 바람직하게는 0.1 내지 40 mM, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 10 mM 이다. LDL-콜레스테롤 측정용 최종 반응 용액 중 커플링제의 농도는 대체적으로 0.01 내지 100 mM, 바람직하게는 0.1 내지 10 mM 이다. 커플링제로서 4-AA를 사용할 경우, 그것의 사용량은 다음과 같다 ; 예를 들어, 2-시약 방법에서 제 1 시약 용액 중 4-AA 의 농도는 대체적으로 0.01 내지 200 mM, 바람직하게는 0.1 내지 40 mM, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 10 mM 이고, LDL-콜레스테롤 측정용 최종 반응 용액 중 4-AA 의 농도는 대체적으로 0.01 내지 50 mM, 바람직하게는 0.1 내지 5 mM 이다.
현색제의 사용량은 그와 조합되는 현색제의 종류, 커플링제의 종류 등에 따라 변화될 수 있기 때문에 명확하게 결정될 수 없다. 예를 들어, 2-시약 방법에서 제 1 시약 용액 중 현색제의 농도는 대체적으로 0.01 내지 200 mM, 바람직하게는 0.1 내지 40 mM, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 10 mM 이다. LDL-콜레스테롤 측정용 최종 반응 용액 중 현색제의 농도는 대체적으로 0.01 내지 50 mM, 바람직하게는 0.1 내지 5 mM 이다.
트리페닐메탄 류코 염료의 구체적인 예는 로이코-말라카이트 그린, 비스(p-디에틸아미노페닐)-2-술포페닐메탄, 비스(p-디에틸아미노페닐)-3,4-디술포프로폭시페닐메탄-디소듐 염 등이다. 디페닐아민 유도체의 구체적인 예는 비스[4-디(2-부톡옥시에틸)아미노-2-메틸페닐]아민, N,N-비스(4-디에틸아미노-2-메틸페닐)-N'-p-톨루엔술포닐 우레아 등이다. 류코 메틸렌 블루 유도체의 구체적인 예는 10-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진-소듐 염, 10 -[3(메톡시카르보닐아미노메틸)페닐메틸아미노카르보닐]-3,7-비스(디메틸아미노)페노티아진 등이다. 벤지딘 유도체의 구체적인 예는 벤지딘, o-톨리딘, o-디아니시딘, 3,3'-디아미노벤지딘, 3,3',5,5'-테트라아미노벤지딘 등이다. 트리알릴이미다졸 유도체의 구체적인 예는 2-(4-카르복시페닐)-3-N-메틸카르바모일-4,5-비스(4-디에틸아미노페닐)이미다졸, 2-(3-메톡시-4-디에틸아미노페닐)-3-N-메틸카르바모일-4,5-비스(2-메틸-4-디에틸아미노페닐)이미다졸 등이다.
상기 예시된 발색제의 사용량은 당 분야에서 통상적으로 사용되는 농도 범위 중에서 선택된다.
본 발명에서 사용되는 CAT 로서, 당 분야에서 통상적으로 사용되는 것들, 예컨대 동물 기관 (예 : 소 췌장 등)에서 유래된 것들, 식물의 엽록체에서 유래된 것들 및 마이크로코커스 (Micrococcus), 로도슈도모나스 (Rhodopseudomonas) 속 등에 속하는 미생물에서 유래된 것들을 예로 들 수 있다. CAT 의 사용량에 대해서는, 예를 들어, 2-시약 방법에서 제 1 시약 용액 중 CAT 의 농도는 대체적으로 10 내지 50,000 u/ml, 바람직하게는 100 내지 5,000 u/ml, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 50 u/ml 이다.
본 발명에서 사용되는 CHD 로서, 당 분야에서 통상적으로 사용되는 것들, 예컨대, 노카르디아 (Nocardia) 속의 세균에서 유래된 것들을 예로 들 수 있다. CHD 의 사용량에 대해서는, 예를 들어, 2-시약 방법에서 제 1 시약 용액 중 CHD 의 농도는 대체적으로 0.1 내지 150 u/ml, 바람직하게는 0.3 내지 100 u/ml, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 60 u/ml 이다. LDL-콜레스테롤 측정용 최종 반응 용액 중 CHD 의 농도는 대체적으로 0.1 내지 100 u/ml, 바람직하게는 1 내지 50 u/ml 이다.
본 발명에서 사용되는 NAD(P) 로서, 당 분야에서 통상적으로 사용되는 것들, 예컨대 효모에서 유래된 것들을 예로 들 수 있다. NAD(P)의 사용량에 대해서는 예를 들어, 2-시약 방법에서 제 1 시약 용액 중 그것의 농도는 대체적으로 0.2 내지 70 mM, 바람직하게는 0.5 내지 50 mM, 더욱 바람직하게는 1 내지 20 mM 이다. LDL-콜레스테롤 측정용 최종 반응 용액 중 NAD(P)의 농도는 대체적으로 0.2 내지 50 mM, 바람직하게는 1 내지 10 mM 이다.
본 발명에서 사용되는 CAT 저해제로서, 당 분야에서 통상적으로 사용되는 것들, 예컨대 NaN3, 3-아미노-1,2,4-트리아졸 등을 예로 들 수 있다. CAT 저해제의 사용량은 CAT 저해제의 종류에 따라 변화할 수 있기 때문에 명확하게 결정될 수 없다. 예를 들어, 2-시약 방법에서 제 2 시약 용액 중 CAT 저해제의 농도는 대체적으로 0.01 내지 10% (w/v), 바람직하게는 0.02 내지 5% (w/v), 더욱 바람직하게는 0.03 내지 3% (w/v) 이다.
본 발명에서 사용되는 CO 저해제로서, 당 분야에서 통상적으로 사용되는 것들, 예컨대 Ag+이온, Zn2+이온, 글루타티온 등을 예로 들 수 있다. CO 저해제의 사용량은 CO 저해제의 종류에 따라 변화할 수 있기 때문에, 명확하게 결정될 수 없다. 예를 들면, 2-시약 방법에서 제 2 시약 용액 중 CO 저해제의 농도는 대체적으로 0.00002 내지 40% (w/v), 바람직하게는 0.0002 내지 4% (w/v), 더욱 바람직하게는 0.002 내지 0.4% (w/v) 이다.
본 발명에서 사용되는 CHD 저해제로서, 당 분야에서 통상적으로 사용되는 것들, 예컨대, Ag+이온, Zn2+이온 등을 예로 들 수 있다. CHD 저해제의 사용량은 CHD 저해제의 종류에 따라 변화할 수 있기 때문에 명확하게 결정될 수 없다. 예를 들어, 2-시약 방법에서 제 2 시약 용액 중 그것의 농도는 대체적으로 0.00001 내지 70% (w/v), 바람직하게는 0.0001 내지 7% (w/v), 더욱 바람직하게는 0.001 내지 0.7% (w/v) 이다.
본 발명에서 사용되는 비이온성 계면활성제 및 음이온성 계면활성제로서, 그것들이 콜레스테롤 반응을 촉진할 수 있는 한, 각기 모두 어떠한 것들도 사용될 수 있다. 비이온성 계면활성제에는, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 고급 알콜 에테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬아민, 글리세롤 지방산 에스테르 등이 포함된다. 음이온성 계면활성제에는 예를 들어, 콜산 및 그것의 유도체가 포함된다. 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르의 구체적인 예는 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 세틸 에테르, 폴리옥시에틸렌 스테아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르 등이다. 폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르의 구체적인 예는 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐페닐 에테르 등이다. 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르의 구체적인 예는 폴리에틸렌 글리콜 모노라우레이트, 폴리에틸렌 글리콜 모노스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜 디스테아레이트, 폴리에틸렌 글리콜 모노올레이트 등이다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르의 구체적인 예는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올레이트 등이다. 소르비탄 지방산 에스테르의 구체적인 예는 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 소르비탄 모노스테아레이트, 소르비탄 디스테아레이트, 소르비탄 트리스테아레이트, 소르비탄 모노올레이트, 소르비탄 트리올레이트, 소르비탄 세스퀘올레이트 등이다. 폴리옥시에틸렌 소르비톨 지방산 에스테르의 구체적인 예는 폴리옥시에틸렌 소르비트 테트라올레이트 등이다. 폴리옥시에틸렌 알킬아민의 구체적인 예는 폴리옥시에틸렌 라우릴아민, 폴리옥시에틸렌 스테아릴아민 등이다. 글리세롤 지방산 에스테르의 구체적인 예는 스테아르산 모노글리세리드, 올레산 모노글리세리드 등이다.
음이온성 계면활성제의 구체적인 예는 콜산, 데옥시콜산, 폴리옥시에틸렌 알킬페놀 에테르 술페이트, 도데실벤젠술포네이트, 라우로일사르코신 등이다.
상기 예시된 계면활성제의 사용 농도는 다음과 같다. 비이온성 계면활성제를 1-시약 방법에서 단독으로 사용할 경우, 시약 용액 중 그것의 농도는 대체적으로 0.0001% 내지 10% (w/v), 바람직하게는 0.001% 내지 1% (w/v) 이다. 비이온성 계면활성제를 2-시약 방법에서 단독으로 사용할 경우, 그것의 농도가 제 2 시약 용액에 대한 제 1 시약 용액의 체적비 등에 따라 변화하나, 제 1 시약 용액 중 그것의 농도는 대체적으로 0.0001% 내지 5% (w/v), 바람직하게는 0.001% 내지 0.5% (w/v) 이고, 제 2 시약 용액 중 그것의 농도는 대체적으로 0.01 내지 20% (w/v), 바람직하게는 0.05 내지 5% (w/v)이다.
음이온성 계면활성제를 1-시약 방법에서 단독으로 사용할 경우, 시약 용액 중 그것의 농도는 대체적으로 0.0001% 내지 10% (w/v), 바람직하게는 0.001% 내지 1% (w/v) 이다. 음이온성 계면활성제를 2-시약 방법에서 단독으로 사용할 경우, 그것의 농도가 제 2 시약 용액에 대한 제 1 시약 용액의 체적비 등에 따라 변화하나, 제 1 시약 용액 중 그것의 농도는 대체적으로 0.0001% 내지 5% (w/v), 바람직하게는 0.001% 내지 0.5% (w/v) 이고, 제 2 시약 용액 중 그것의 농도는 대체적으로 0.01 내지 20% (w/v), 바람직하게는 0.05 내지 5% (w/v) 이다.
비이온성 계면활성제 및 음이온성 계면활성제를 1-시약 방법에서 함께 사용할 경우, 시약 용액 중 그것들의 농도는 대체적으로 0.0001% 내지 20% (w/v), 바람직하게는 0.001% 내지 2% (w/v) 이다. 비이온성 계면활성제 및 음이온성 계면활성제를 2-시약 방법에서 함께 사용할 경우, 그것의 농도가 제 2 시약 용액에 대한 제 1 시약 용액의 체적비 등에 따라 변화하나, 제 1 시약 용액 중 그것의 농도는 대체적으로 0.0001% 내지 10% (w/v), 바람직하게는 0.001% 내지 1% (w/v) 이고, 제 2 시약 용액 중 그것의 농도는 대체적으로 0.01 내지 40% (w/v), 바람직하게는 0.05 내지 10% (w/v) 이다.
상기 예시된 계면활성제는 단독으로 또는 그것들의 혼합물로서 사용될 수 있다.
LDL 이외의 리포단백질에 결합할 수 있는 항체로써, 그것이 LDL 이외의 리포단백질 중 콜레스테롤의 반응을 촉진할 수 있는 한, 어떠한 항체도 사용될 수 있다. 항-HDl 항체, 항-아포리포단백질 A 항체, 항-아포리포단백질 C 항체, 항-아포리포단백질 E 항체, 항-α-리포단백질 항체, 항-VLDL 항체, 항-프레β-리포단백질 항체 등을 예로 들 수 있다. 이 항체들은 폴리클론성 항체 및 모노클론성 항체 중 하나일 수 있고, 단독으로 또는 함께 사용될 수 있다.
LDL 이외의 리포단백질과 결합능을 갖는 항체는 또한 상기 예시된 항체의 효소적 또는 화학적 분해로써 수득되는 단편들 (예 : Fab, Fab', F(ab')2등), 상기 예시된 항체를 효소로 라벨링하여 수득된 효소-수식 항체 등을 포함한다.
본 발명에서, LDL 이외의 리포단백질 중 콜레스테롤의 반응을 촉진하는 능력이 향상된, 또는 그 능력이 부여된 수식 항체를 사용하여 상기 예시된 항체에 적당한 화합물을 결합시켜 수득하는 것이 바람직하다.
화합물은 천연 화합물 및 화학적 합성 화합물 중 하나일 수 있다. 그것에는 예를 들어, 당, 지방산, 각종 글리코시드 (예 : 알칼로이드 글리코시드, 스테로이드 글리코시드, 테르페노이드 글리코시드 등), 수용성 합성 중합체 등이 포함된다. 이 화합물들은 모두 종래 방법으로 화합물의 아미노기, 이미노기, 카르복실기, 알데히드기 또는 2,3-에폭시프로필기를 항체의 아미노기, 카르복실기 또는 술프히드릴기에 공유 결합시킴으로써 쉽게 항체에 결합될 수 있다. 화합물이 수식용 활성기를 가지고 있지 않을 경우, 화합물을 활성화한 후, 수식을 수행하는 방법, 또는 가교제를 통한 수식을 수행하는 방법에 의해 그 화합물을 항체에 쉽게 결합시킬 수 있다.
화합물의 구체적인 예는 덱스트란, 풀루란, 피콜, 덱스트린, 시클로덱스트린, 폴리(글루탐산), 폴리(아스파르트산), 펙트산, 프로투버산, 알긴산, 카르복시메틸덱스트란, 카르복시메틸 셀룰로오스, 폴리리신, 알부민, 라미나란, 리케난, 렉틴, 덱스트란 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 헤파린, 글루코스, 갈락토스, 크실로스, 프룩토스, 락토스, 말토스, 팔라티노스, 트레할로스, 만노스, 푸코스, 글루쿠론산, 글로코사민, 갈락토사민. 이노시톨, 시알산, 무람산, 글리시르헤틴산, 아르부틴, 다이드진, 폴리(비닐 알콜), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(비닐피롤리돈) 등이다.
상기 예시된 화합물들 중, 항체의 아미노기, 카르복실기 또는 술프히드릴기에 대한 활성기 (예 ; 아미노기, 카르복실기, 이미노기, 알데히드기, 술프히드리리기 등) 를 갖는 화합물을 그 자체로 항체와의 결합 반응을 수행할 수 있다. 활성기가 없는 화합물은 활성기 도입을 위한 하기 방법 중 임의의 방법에 따라 활성화된 후, 사용될 수 있다. 활성기는 탄소수 1 내지 6 의 알킬렌기와 같은 적합한 분자 길이를 갖는 스페이서를 통해 도입될 수 있다.
상기 예시된 화합물로의 활성기의 도입 방법은 예를 들어, 다음의 통상적 도입 방법이다 : 시아누르산 클로라이드의 사용에 의한 활성기 도입 방법 [예 : J. Solid phase Biochem., Vol. 4, 2128 (1976)], 메타페리오드산 (metaperiodic acid) 의 사용에 의한 알데히드기 도입 방법 [예 : Proc. Nati. Acad. Sci. USA., Vol. 73, 2128 (1976)], 시아노겐 브로마이드의 사용에 의한 이미노기 도입 방법 [예 : Nature, Vol. 214, 1302 (1967)], 에피클로로히드린 사용에 의한 2,3-에폭시프로필기 도입 방법 [예 : J. Chromatog. Vol. 51, 479 (1970)], 카르복실산 무수물 사용에 의한 카르복실기 도입 방법 (예 : JP-A 5-268950), 모노브로모카르복실산 사용에 의한 카르복실기 도입 방법 [예 : Arc. Biochem. Biophys., Vol. 147, 788 (1971)] 등 (이 참조 내용은 여기에서 참고로 병입됨).
활성기를 갖는 화합물을 항체에 공유 결합시키는 방법으로서, 모든 종래의 결합 방법을 예로 들 수 있다. 예를 들어, 반응에 참여하는 상호 반응성인 기가 아미노기 및 카르복실기인 경우, 카르보디이미드 방법 [예 : J. Biol. Chem., Vol. 245, 3059 (1970)], 활성화된 에스테르 방법 [예 : Cancer Biochem., Vol. 7, 175 (1984)], 산 무수물 방법 [예 : J. Biol. Chem., Vol. 237, 1825 (1962)], 아지드 방법 [예 : Eur. J. Biochem., Vol. 25, 129 (1972)], 산 클로라이드 방법 [예 : Angew. Chem., Vol. 67, 661 (1955)], 이소시아네이트 방법 [예 : Nature, Vol. 210, 367 (1966)], 우드워드(Woodward) 시약 방법 [예 : Biochim. Biophys. Acta, Vol. 178, 626 (1969)], 우기 반응 (Ugi reaction) [예 : Angew. Chem., Vol. 74, 9 (1962)] 등을 예로 들 수 있다. 상호 반응성인 기가 아미노기인 경우, 글루타르알데히드 방법 [예 : Experientia, Vol. 28, 958 (1973)], 알킬화 방법 [예 : Biochim., Biophys. Acta, Vol. 198, 276 (1970)] 등을 들 수 있고, 그 참조 내용들은 여기에서 참고로 병입된다. 상호 반응성인 기가 히드록실기 및 아미노기인 경우, 알킬화 방법 [예 : Biochim., Biophys. Acta, Vol. 198, 276 (1970)] 등을 예로 들 수 있고, 그 참조 내용은 여기에서 참고로 병입된다. 상호 반응성인 기가 아미노기 및 알데히드기인 경우, 페리오데이트 산화 방법 [예 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 73, 2128 (1978)] 등을 예로 들 수 있고, 그 참조 내용은 여기에서 참고로 병입된다. 상호 반응성인 기가 아미노기 및 이미노기인 경우, 시아노겐 브로마이드 방법 [예 : Nature, Vol. 214, 1302 (1967)] 등을 예로 들 수 있고, 그 참조 내용은 여기에서 참고로 병입된다.
상기 항체의 사용 농도는 LDL 이외의 리포단백질 중 콜레스테롤의 반응이 촉진될 수 있는 임의의 농도일 수 있다. 생체로부터 유래된 시료와 직접 혼합되는 시약 중 항체의 농도는 대체적으로 0.001 내지 10 mgAb/ml, 바람직하게는 0.01 내지 1 mgAb/ml 이다.
본 발명에서 사용되는 수성 매질에는, 물, 완충액 등이 포함된다. 완충액으로서, pH 가 5 내지 11 인 범위에서 완충 작용을 하고, 콜레스테롤 측정용 반응을 저해하지 않는 한, 어떠한 완충액도 사용할 수 있다. 당 분야에서 주로 사용되는 완충액, 예컨대 트리스(히드록시메틸)아미노메탄, 굿스(Good's) 완충액, 인산염, 붕산염 등을 예로 들 수 있다. 완충액의 사용 농도는 대체적으로 1 mM 내지 2 M, 바람직하게는 10 mM 내지 1 M 이다. 완충액의 pH 는 대체적으로 5 내지 11, 바람직하게는 6 내지 8, 더욱 바람직하게는 약 7 이다.
본 발명의 LDL-콜레스테롤의 양을 측정하기 위한, 시약, 시약 조성물 및 키트는 생체 예컨대, 혈청, 혈장 등에서 유래된 시료 중 LDL-콜레스테롤의 양을 측정하는데 사용된다. 각 시약, 시약 조성물 및 키트는 다가음이온 및 양성 계면활성제 외에, 당 분야에서 주로 사용되는 농도 범위에서 생체로부터 유래된 시료 중 콜레스테롤의 양을 측정하는 방법에 사용된 상기 시약, 예컨대 CO, CHE, CHD, POD, NAD(P), 산화성 발색제, CAT, CAT 저해제, CO 저해제, CHD 저해제, 수성 매질 및 선택적으로는 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 항체 등을 함유하도록 제조하는 것이 좋다. 구성 요소의 바람직한 성질 및 사용 농도는 상기 정의한 대로이다. 필요하다면, 상기 키트는 LDL-콜레스테롤 표준 제제 등을 동반할 수 있다. 표준 제제로서, 예를 들어 인간 또는 동물 혈청으로 제조된 표준 혈청 및 표준 용액이 함유된 LDL 분획을 표준 제제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 LDL-콜레스테롤의 양을 측정하기 위한 방법, 시약, 시약 조성물 및 키트의 경우, LDL-콜레스테롤의 반응은 다가음이온 및 양성 계면활성제의 존재에 의해 저해되어, LDL 이외의 리포단백질 중 콜레스테롤의 반응이 선행된다. 이어서, LDL-콜레스테롤의 반응이 진행되도록 한 후, LDL-콜레스테롤 반응에 의해 생성되는 NAD(P)H 또는 과산화수소만을 특이적으로 측정한다. 그러므로, 방법, 시약, 시약 조성물 및 키트로써, 종래 방법에 의해 수행하기 어려웠던 종래의 자동분석기를 이용하여 종결점 분석으로써 LDL-콜레스테롤을 측정할 수 있게 되었다.
본 발명의 바람직한 구현예는 예를 들어 다음과 같다 :
생체, 예컨대 혈청, 혈장 등으로부터 유래된 시료를 1) 다가음이온 및 양성 계면활성제, 2) CHE, 3) CO, 현색제, 커플링제 및 POD 의 조합, 또는 CHD 및 NAD(P) 의 조합, 및 4) 완충액, 및 선택적으로는 비이온성 계면활성제 및/또는 음이온성 계면활성제, 항체 등을 함유하는 제 1 시약 용액과 혼합한다. 반응을 2 내지 40 ℃에서 1 내지 30 분간 수행한 후, 흡광도 (OD1)을 측정한다. 이어서, 반응 용액을 완충액 및 선택적으로는 비이온성 계면활성제 및/또는 음이온성 계면활성제를 함유하는 제 2 시약 용액과 혼합하고, 반응을 2 내지 40 ℃에서 1 내지 60 분간 수행한 후, 흡광도 (OD2)을 측정한다. OD1에서 나온 값 (예 : 체적에 대한 보정 인자로 OD1을 곱한 값)을 OD2에서 뺌으로써, 흡광도 (OD3)를 계산하고, 시료로서, 공지된 농도의 LDL-콜레스테롤을 함유하는 표준 용액과 같은 표준 제제를 사용하는 것을 제외하고, 상기와 동일한 측정을 수행하여 미리 수득한 OD3와 LDL-콜레스테롤 농도 간의 관계를 보여주는 측정 곡선을 이용함으로써, 상기 수득된 OD3을 기준으로 시료 중 LDL-콜레스테롤의 양을 산정한다.
또한, 생체, 예컨대 혈청, 혈장 등으로부터 유래된 시료를 1) 다가음이온 및 양성 계면활성제, 2) CHE, 3) CO, 현색제 (또는 커플링제) 및 POD, 및 4) 완충액, 및 선택적으로는 비이온성 계면활성제 및/또는 음이온성 계면활성제, 항체 등을 함유하는 제 1 시약 용액과 혼합한다. 반응을 2 내지 40 ℃에서 1 내지 30 분간 수행한 후, 흡광도 (OD1) 을 측정한다. 이어서, 반응 용액을 커플링제 (또는 현색제), 완충액 및 선택적으로는 비이온성 계면활성제 및/또는 음이온성 계면활성제를 함유하는 제 2 시약 용액과 혼합하고, 반응을 2 내지 40 ℃에서 1 내지 60 분간 수행한 후, 흡광도 (OD2) 을 측정한다. OD1에서 나온 값 (예 : 체적에 대한 보정 인자로 OD1을 곱한 값)을 OD2에서 뺌으로써, 흡광도 (OD3)를 계산하고, 시료로서, 공지된 농도의 LDL-콜레스테롤을 함유하는 표준 용액과 같은 표준 제제를 사용하는 것을 제외하고, 상기와 동일한 측정을 수행하여 미리 수득한 OD3와 LDL-콜레스테롤 농도 간의 관계를 보여주는 측정 곡선을 이용함으로써, 상기 수득된 OD3을 기준으로 시료 중 LDL-콜레스테롤의 양을 산정한다.
더욱이 또한, 생체, 예컨대 혈청, 혈장 등으로부터 유래된 시료를 1) 다가음이온 및 양성 계면활성제, 2) CHE, 3) CO, 현색제 (또는 커플링제), 4) CAT, 및 5) 완충액, 및 선택적으로는 비이온성 계면활성제 및/또는 음이온성 계면활성제, 항체 등을 함유하는 제 1 시약 용액과 혼합한다. 반응을 2 내지 40 ℃에서 1 내지 30 분간 수행한 후, 흡광도 (OD1) 을 측정한다. 이어서, 반응 용액을 커플링제 (또는 현색제), POD, CAT 저해제, 완충액 및 선택적으로는 비이온성 계면활성제 및/또는 음이온성 계면활성제를 함유하는 제 2 시약 용액과 혼합하고, 반응을 2 내지 40 ℃에서 1 내지 60 분간 수행한 후, 흡광도 (OD2) 을 측정한다. OD1에서 나온 값 (예 : 체적에 대한 보정 인자로 OD1을 곱한 값)을 OD2에서 뺌으로써, 흡광도 (OD3)를 계산하고, 시료로서, 공지된 농도의 LDL-콜레스테롤을 함유하는 표준 용액과 같은 표준 제제를 사용하는 것을 제외하고, 상기와 동일한 측정을 수행하여 미리 수득한 OD3와 LDL-콜레스테롤 농도 간의 관계를 보여주는 측정 곡선을 이용함으로써, 상기 수득된 OD3을 기준으로 시료 중 LDL-콜레스테롤의 양을 산정한다.
1-시약 방법의 경우, 생체, 예컨대 혈청, 혈장 등으로부터 유래된 시료를 1) 다가음이온 및 양성 계면활성제, 2) CHE, 3) CO, POD 및 산화성 발색제의 조합, 또는 CHD 및 NAD(P) 의 조합, 및 4) 완충액 및 선택적으로는 비이온성 계면활성제 및/또는 음이온성 계면활성제, 항체 등을 함유하는 제 1 시약 용액과 혼합한다. 반응을 2 내지 40 ℃에서 1 내지 30 분간 수행한 후, 흡광도 (OD1') 을 측정한다. 이어서, 반응 용액을 2 내지 40 ℃에서 1 내지 60 분간 계속한 후, 흡광도 (OD2')를 측정한다. OD2'에서 OD1'을 뺌으로써, 흡광도 (OD3')을 계산하고, 시료로서, 공지된 농도의 LDL-콜레스테롤을 함유하는 표준 용액과 같은 표준 제제를 사용하는 것을 제외하고, 상기와 동일한 측정을 수행하여 미리 제조한 OD3'와 LDL-콜레스테롤 농도 간의 관계를 보여주는 측정 곡선을 이용함으로써, 상기 수득된 OD3' 을 기준으로 시료 중 LDL-콜레스테롤의 양을 산정한다.
상기 구현에서, OD1(또는 OD1') 및 OD2(또는 OD2') 각각을 측정하는 시점에 있어서, 가장 적합한 시점은 각 리포단백질 분획에 대한 반응성(예컨대, 반응 곡선)을 조사함으로서 상기 범위중에서 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명은 실시예 및 참고예로 하기에 더욱 상세히 예시하고 있으나, 이는 한정이 아니라 예시이다.
실시예 1
초원심분리에 의해 분획된 다양한 리포단백질을 갖는 본 발명의 시약 조성물의 반응 곡선을 자동 분석기 히타치 7170(히타치 사)를 사용하여 측정한다.
[시료]
시료로서, 통상적인 초원심분리 방법으로 혈청으로부터 분획함으로서 제조된 HDL 분획(콜레스테롤 : 84 mg/dl), LDL 분획(콜레스테롤 : 95 mg/dl) 및 VLDL 분획(콜레스테롤 : 33 gm/dl)을 사용한다.
[시약]
(시약 용액 1 내지 13)
시약 용액으로서, 1 U/ml의 CO(일련 번호 COO-321, 토요보 사), 1 U/ml의 CHE(일련 번호 T-18, 아사히 가세이 고오교 가부시끼가이샤), 0.5 mM 의 N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(HDAOS), 1 mM 의 4-AA, 1.5 U/ml 의 POD(일련 번호 PEO-302, 토요보 사), 0.04 % (w/v)의 예정된 다가음이온 및 0.008 %(w/v) 의 예정된 양성 계면활성제를 함유하는 25 mM 의 2-히드록시-N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판-술폰산(TAPSO)-NaOH 완충 용액(pH 7.0)을 사용한다.
표 1 에 각 시약 용액에 사용된 다가음이온 및 양성 계면활성제의 구체적인 이름이 있다.
시약 용액 | 양성 계면활성제 | 다가음이온 |
시약 용액 1 | 없음 | 없음 |
시약 용액 2 | LEBON 50(상품명, 산요 케미컬 인더스트리 사)(알킬폴리아미노-에틸글리신 히드로클로라이드) | 헤파린 |
시약 용액 3 | CLINK PA-12(상품명, 요시무라 오일 케미칼 사)(N-라우릴아미노-프로피오네이트) | 헤파린 |
시약 용액 4 | AMOGEN K(상품명, 다이-이치 고오교 세이야꾸 사)(N,N,N-트리알킬-N-카르복시메틸) | 헤파린 |
시약 용액 5 | AMPHITOL C40H(상품명, 카오 코포레이션)(라우릴 베타인) | 헤파린 |
시약 용액 6 | ENAGICOL C40H(라이온 코포레이션)(2-알킬-N-카르복시알킬-N-히드록시에틸 이미다졸리늄 베타인) | 헤파린 |
시약 용액 7 | LEBON 15(상품명, 산요 케미칼 인더스트리 사)(알킬폴리아미노-에틸글리신 히드로클로라이드) | 인텅스텐산 |
시약 용액 8 | SALABON 50(상품명, 다께모또 오일 앤드 패츠 사)(모노옥틸아미노에틸글리신 히드로클로라이드 및 디옥틸아미노에틸글리신 히드로클로라이드의 혼합물) | 인텅스텐산 |
시약 용액 9 | AMOGEN K | 인텅스텐산 |
시약 용액 10 | NISSAN ANON LG(상품명, 니폰 오일 앤드 패츠 사)[알킬디(아미노에틸)글리신] | 인텅스텐산 |
시약 용액 11 | AMPHITOL 24B | 인텅스텐산 |
시약 용액 12 | ENAGICOL C40H | 인텅스텐산 |
시약 용액 13 | LEBON LAG40(상품명, 산요 케미칼 인더스트리 사)(알킬-디아미노-에틸 글리신 히드로클로라이드) | 인텅스텐산 |
[측정 조건]
측정 인자를 하기와 같이 설정하여 LDL-콜레스테롤을 측정한다 :
측정 방법 : 1 포인트 앤드 [34] - [0]
시료의 부피 : 2.5 μl
시약 용액의 부피 : 300 μl
측정 파장 : 700/600 nm
측정 온도 : 37 ℃
[결과]
도 1 내지 13 은 시약 용액 1 내지 13을 각각 사용함으로서 수득된 측정 결과를 나타낸다.
도 1 내지 13에서, -□-은 LDL 분획 시료로부터 수득된 결과를 나타내고, -○-은 HDL 분획 시료로부터 수득된 결과를 나타내며, -△-는 VLDL 분획 시료로부터 수득된 결과를 나타내고, -●-는 시료로서 생리 식염수를 사용하여 수득된 결과를 나타낸다.
도 1에 나타난 결과로부터 명백하듯이, 다가음이온과 양성 계면활성제를 모두 함유하지 않는 시약 용액(시약 용액 1)과 각 시료를 혼합한 직후, 시약 용액과 LDL, HDL 및 VLDL 각각과의 반응이 시작되고, 2 내지 5 분 후 정체기에 실질적으로 도달했다.
반면, 도 2 내지 13에서 볼 수 있듯이, 리포단백질 중의 콜레스테롤이 다가음이온 및 양성 계면활성제의 존재 하에(시약 용액 2 내지 13)측정될 때, LDL 과의 반응은 저해, 즉, HDL 및 VLDL 과의 반응이 각각 실질적으로 완결된 후에도 LDL 과의 반응은 여전히 진행되거나(시약 용액 2 및 3 의 경우), 또는 HDL 및 VLDL 과의 반응이 각각 실질적으로 완결된 후에 LDL 과의 반응이 시작된다(시약 용액 4 내지 13 의 경우).
이러한 사실로부터, 다가음이온 및 양성 계면활성제의 존재는 LDL 이외의 리포단백질 중의 콜레스테롤의 반응의 진행을 지연 또는 일시적으로 중단시킨 후에, LDL-콜레 스테롤의 반응을 진행, 즉, 이러한 존재로 LDL-콜레스테롤의 특이적 측정을 가능케한다는 것을 알 수 있다.
실시예 2
혈청 중의 LDL-콜레스테롤의 양을 자동분석기 히타치 7170(히타치 사)를 사용하여 본 발명의 측정 방법으로 측정한다.
[시료]
10 개의 신선한 혈청.
[시약]
(시약 용액 14)
R-1 : 5 U/ml 의 CO(CHO "Amano VW", 아마노 파마슈티칼 사), 5 U/ml 의 CHE(일련 번호 T-18, 아사히 가세이 고오교 가부시끼가이샤), 1 mM 의 HDAOS, 0.04 % (w/v)의 LEBON LAG 40, 0.03 %(w/v)의 헤파린, 0.02 % 의 Triton X-100, 1 mM 의 4-AA 및 10 U/ml 의 POD(일련 번호 PEO-302, 토요보 사)를 함유하는 25 mM TAPSO-NaOH 완충액(pH 7.0).
R-2 : 0.5 %(w/v)의 Emalgen 709 (폴리옥시에틸렌 고급 알콜 에테르, 상품명, 카오 코포레이션)을 함유하는 25 mM TAPSO-NaOH 완충액(pH 7.0).
[측정 조건]
측정 인자를 하기와 같이 설정하여 측정을 수행하였다 :
측정 방법 : 2 포인트 앤드 [16] - [34]
시료의 부피 : 3 μl
R-1 의 부피 : 270 μl
R-2 의 부피 : 90 μl
측정 파장 : 700/600 nm
측정 온도 : 37 ℃
[결과]
수득된 결과를 표 2 에 나타내었다.
참고예 1
실시예 2에서 사용된 것과 동일한 혈청 각각 중 LDL-콜레스테롤 값을, 통상적인 방법인 프리데발트 식에 따라 계산한다.
측정 과정은, 문헌 [CLINICAL CHEMISTRY. Vol. 18, No. 6, p.499-502(1972)] 에 따라 수행하였다.
[결과]
측정 결과를 또한 표 2 에 나타내었다.
시료 번호 | 실시예 2(시약 용액 14)(mg/dl) | 프리데발트 계산 값(mg/dl) |
1 | 127.5 | 125.5 |
2 | 96.9 | 97.2 |
3 | 169.3 | 171.1 |
4 | 131.8 | 129.9 |
5 | 104.0 | 100.4 |
6 | 138.9 | 140.3 |
7 | 134.5 | 125.8 |
8 | 141.5 | 140.3 |
9 | 134.5 | 132.4 |
10 | 141.6 | 135.3 |
평균값 | 132.1 | 129.8 |
비교예 1 과의 상관계수 | 0.99 | - |
회귀선의 기울기 | 0.96 | - |
회귀선의 y 절편 | 8.05 | - |
표 2 에 나타난 결과로부터 명백하듯이, 본 발명의 다가음이온 및 양성 계면활성제를 함유하는 시약(시약 용액 14)을 사용함으로서 수득된 콜레스테롤 값은 통상적인 방법인 프리데발트 식에 따라 수득된 콜레스테롤 값과 상당한 상관관계이고, 즉, LDL-콜레스테롤은 상기 시약을 사용하여 특이적으로 측정될 수 있다.
실시예 3
각각 BQ 법(베타 정량법)으로 측정된 공지된 LDL-콜레스테롤 값을 갖는 대조 혈청[PBI(Pacific Biometrics, INC.)] 중의 LDL-콜레스테롤의 양을 자동분석기 히타치 7170(히타치 사)를 사용하여 본 발명의 측정 방법으로 측정한다.
[시료]
5 개의 대조 혈청.
[시약]
(시약 용액 15)
R-1 : 5 U/ml 의 CO(CHO "Amano VW", 아마노 파마슈티칼 사), 5 U/ml 의 CHE(일련 번호 T-18, 아사히 가세이 고오교 가부시끼가이샤), 1 mM 의 HDAOS, 0.04 % 의 LEBON LAG 40, 0.03 %(w/v) 의 헤파린, 0.02 % 의 Emalgen 705 (폴리옥시에틸렌 고급 알콜 에테르, 상품명, 카오 코포레이션) 및 1,000 U/ml 의 CAT(베링거 만하임 사)를 함유하는 25 mM TAPSO-NaOH 완충액(pH 7.0).
R-2 : 1 mM 의 4-AA, 20 U/ml 의 POD (일련 번호 PEO-302, 토요보 사), 0.5 %(w/v) 의 Emalgen 709 (폴리옥시에틸렌 고급 알콜 에테르, 상품명, 카오 코포레이션) 및 0.1 % (w/v) 의 NaN3를 함유하는 25 mM TAPSO-NaOH 완충액(pH 7.0).
(시약 용액 16)
R-1 : 5 U/ml 의 CO(CHO "Amano VW", 아마노 파마슈티칼 사), 5 U/ml 의 CHE(일련 번호 T-18, 아사히 가세이 고오교 가부시끼가이샤), 1 mM 의 HDAOS, 0.04 % 의 LEBON LAG 40, 0.03 %(w/v) 의 헤파린, 0.02 % 의 Emalgen 705 (폴리옥시에틸렌 고급 알콜 에테르, 상품명, 카오 코포레이션) 및 2 U/ml 의 POD (일련 번호 PEO-302, 토요보 사)를 함유하는 25 mM TAPSO-NaOH 완충액(pH 7.0).
R-2 : 1 mM 의 4-AA 및 0.5 %(w/v) 의 Emalgen 709 (폴리옥시에틸렌 고급 알콜 에테르, 상품명, 카오 코포레이션)를 함유하는 25 mM TAPSO-NaOH 완충액(pH 7.0).
[측정 조건]
실시예 2 와 동일.
[결과]
수득된 결과를 표 3 에 나타내었다.
시료 번호 | 시약 용액 15(mg/dl) | 시약 용액 16(mg/dl) | 공칭값(mg/dl) |
1 | 58.3 | 55.4 | 52 |
2 | 98.9 | 93.9 | 98 |
3 | 129.8 | 125.5 | 130 |
4 | 183.3 | 180.3 | 191 |
5 | 220.6 | 215.7 | 218 |
평균값 | 138.3 | 134.2 | 138 |
표 3 에 나타난 결과로부터 명백하듯이, 본 발명의 다가음이온 및 양성 계면활성제를 함유하는 시약(시약 용액 15 및 16) 각각을 사용함으로서 수득된 LDL-콜레스테롤 값은 BQ 법(베타 정량법)으로 측정된 값인 대조 혈청의 공칭값과 실질적으로 동일하다.
실시예 4
각각 BQ 법(베타 정량법)으로 측정된 공지된 LDL-콜레스테롤 값을 갖는 대조 혈청[PBI(Pacific Biometrics, INC.)] 중의 LDL-콜레스테롤의 양을 자동분석기 히타치 7170(히타치 사)를 사용하여 본 발명의 측정 방법으로 측정한다.
[시료]
실시예 3 과 동일.
[시약]
(시약 용액 17)
R-1 : 5 U/ml 의 CO(CHO "Amano VW", 아마노 파마슈티칼 사), 5 U/ml 의 CHE(일련 번호 T-18, 아사히 가세이 고오교 가부시끼가이샤), 1 mM 의 HDAOS, 0.04 % 의 LEBON LAG 40, 0.03 %(w/v) 의 헤파린, 0.02 % 의 Triton X-100(HLB : 13.5) 및 1,000 U/ml 의 CAT(베링거 만하임 사)를 함유하는 25 mM 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES)-NaOH 완충액(pH 7.0).
R-2 : 1 mM 의 4-AA, 20 U/ml 의 POD (일련 번호 PEO-302, 토요보 사), 0.5 %(w/v) 의 Emalgen 709 (폴리옥시에틸렌 고급 알콜 에테르, 상품명, 카오 코포레이션) 및 0.1 % (w/v) 의 NaN3를 함유하는 25 mM MES-NaOH 완충액(pH 7.0).
(시약 용액 18)
R-1 : 5 U/ml 의 CO(CHO "Amano VW", 아마노 파마슈티칼 사), 5 U/ml 의 CHE(일련 번호 T-18, 아사히 가세이 고오교 가부시끼가이샤), 1 mM 의 HDAOS, 0.04 % 의 LEBON LAG 40, 0.03 %(w/v) 의 헤파린, 0.02 % 의 Emalgen 705 (폴리옥시에틸렌 고급 알콜 에테르, 상품명, 카오 코포레이션) 및 1,000 U/ml 의 CAT(베링거 만하임 사)를 함유하는 25 mM TAPSO-NaOH 완충액(pH 7.0).
R-2 : 1 mM 의 4-AA, 20 U/ml 의 POD (일련 번호 PEO-302, 토요보 사), 0.5 %(w/v) 의 Emalgen 709 (폴리옥시에틸렌 고급 알콜 에테르, 상품명, 카오 코포레이션) 및 0.1 % (w/v) 의 NaN3를 함유하는 25 mM TAPSO-NaOH 완충액(pH 7.0).
(시약 용액 19)
R-1 : 5 U/ml 의 CO(CHO "Amano VW", 아마노 파마슈티칼 사), 5 U/ml 의 CHE(일련 번호 T-18, 아사히 가세이 고오교 가부시끼가이샤), 1 mM 의 HDAOS, 0.04 %(w/v) 의 LEBON LAG 40, 0.03 %(w/v) 의 헤파린, 0.02 % 의 Triton X-100(HLB : 13.5) 및 1,000 U/ml 의 CAT(베링거 만하임 사)를 함유하는 25 mM 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시메틸)-메탄(비스-트리스)-NaOH 완충액(pH 7.0).
R-2 : 1 mM 의 4-AA, 20 U/ml 의 POD (일련 번호 PEO-302, 토요보 사), 0.5 % 의 Triton X-100 및 0.1 % (w/v) 의 NaN3를 함유하는 25 mM 비스-트리스-NaOH 완충액(pH 7.0).
[측정 조건]
실시예 2 와 동일.
[결과]
수득된 결과가 표 4 에 나타나있다.
시료 번호 | 시약 용액 17(mg/dl) | 시약 용액 18(mg/dl) | 시약 용액 19(mg/dl) | 공칭값(mg/dl) |
1 | 58.7 | 54.3 | 53.0 | 52 |
2 | 102.7 | 98.8 | 101.1 | 98 |
3 | 133.5 | 133.0 | 130.0 | 130 |
4 | 190.2 | 193.6 | 181.2 | 191 |
5 | 214.6 | 224.9 | 211.7 | 218 |
평균값 | 139.9 | 140.9 | 135.4 | 138 |
표 4 에 나타난 결과로부터 명백하듯이, 본 발명의 다가음이온 및 양성 계면활성제를 함유하는 각 시약(시약 용액 17 내지 19)을 사용함으로서 수득된 LDL-콜레스테롤 값은, BQ 법(베타 정량법)으로 측정된 값인 대조 혈청의 공칭값과 실질적으로 동일하다.
참고예 2
수식 항체를 통상적인 방법으로 제조한다.
(1) 덱스트란-수식 항체의 제조
15 ml 의 양 항-HDL 항체(10 mg 단백질 Ab/ml)를 300 ml 의 디알데히드 덱스트란과 혼합하고, 50 mM 의 인산염 완중액(pH 6.0) 중에서 30 ℃에서 반응을 수행한다. 이어서, 200 mg 의 보란 피리딘을 가하고, 반응을 5 시간 동안 수행한다. 셀로판 튜브에 반응 혼합물을 채우고, 탈염하고, 한외여과로 농축한다. 따라서, 덱스트란-수식 항체(10 mg 단백질 Ab/ml × 12.6 ml)을 수득한다.
(2) 헤파린-수식 항체의 제조
과요오드산염 산화된 헤파린 100 mg 에 50 mg 의 6-아미노카프로산을 가하고, 생성된 혼합물을 투석한다. 투석된 혼합물에 5 ml 의 양 항-HDL 항체(10 mg 단백질 Ab/ml) 및 300 mg 의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드를 가하고, 5 ℃에서 밤새도록 반응을 수행한다. 셀로판 튜브에 반응 혼합물을 채우고, 탈염한 후, 한외여과로 농축한다. 이어서, 헤파린-수식 항체(10 mg 단백질 Ab/ml × 3.6 ml)을 수득한다.
(3) 알긴산-수식 항체의 제조
20 ml 의 20 mM 인산염 완충액(pH 7.0)중 50 mg 의 알긴산을 용해시키고, 여기에 5 ml 의 양 항-HDL 항체(10 mg 단백질 Ab/ml) 및 500 mg 의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드를 가하고, 5 ℃에서 밤새도록 반응을 수행한다. 셀로판 튜브에 반응 혼합물을 채우고, 탈염한 후, 한외여과로 농축한다. 이어서, 알긴산-수식 항체(10 mg 단백질 Ab/ml × 3.4 ml)을 수득한다.
(4) 글루쿠론산-수식 항체의 제조
0.1 M 의 인산염 완충액(pH 7.0) 중에 10 ml 의 양 항-HDL 항체(10 mg 단백질 Ab/ml) 및 400 mg 의 글루쿠론산을 용해시키고, 여기에 250 mg 의 시아노겐 보로히드리드를 가한 후, 37 ℃에서 5 시간 동안 반응을 수행한다. 셀로판 튜브에 반응 혼합물을 채우고, 탈염한 후, 한외여과로 농축한다. 따라서, 글루쿠론산-수식 항체(10 mg 단백질 Ab/ml × 7.6 ml)을 수득한다.
(5) 폴리(글루탐산)-수식 항체의 제조
4 ml 의 20 mM 인산염 완충액(pH 6.5) 중에 20 ml 의 폴리(글루탐산)을 용해시키고, 여기에 1 ml 의 양 항-HDL 항체(10 mg 단백질 Ab/ml) 및 40 mg 의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드를 가한 후, 5 ℃에서 밤새도록 반응을 수행한다. 셀로판 튜브에 반응 혼합물을 채우고, 탈염한 후, 한외여과로 농축한다. 따라서, 폴리(글루탐산)-수식 항체(10 mg 단백질 Ab/ml × 0.72 ml)을 수득한다.
(6) 글리시레틴산-수식 항체의 제조
2 ml 의 50 mM 인산염 완충액(pH 6.5) 중에 100 mg 의 글리시레틴산을 용해시키고, 100 mg 의 과요오드산염 나트륨을 이 용액에 가한다. 5 ℃에서 24 시간 동안 반응을 수행하고, 세파덱스(Sephadex) G-25 칼럼을 사용하여 탈염한다. 탈염 용액을 10 ml 의 양 항-HDL 항체(10 mg 단백질 Ab/ml)과 혼합하고, 30 ℃에서 48 시간 동안 반응을 수행한다. 셀로판 튜브에 반응 혼합물을 채우고, 탈염한 후, 한외여과로 농축한다. 따라서, 글리시레틴산-수식 항체(10 mg 단백질 Ab/ml × 7.3 ml)을 수득한다.
실시예 5
LDL-콜레스테롤 값을 자동분석기 히타치 7170(히타치 사)를 사용하여 본 발명의 측정 방법으로 측정하고, 측정된 값을 참고 방법인 BQ 법으로 측정된 LDL-콜레스테롤 값과 비교한다.
[시료]
시료로서, 각각이 BQ 법(베타 정량법)으로 측정된 공지된 LDL-콜레스테롤 값을 갖는, 15 개의 사람 혈청(트리글리세리드 : 400 mg/dl 미만) 및 8 개의 사람 혈청(트리글리세리드 : 400 mg/dl 초과) [PBI(Pacific Biometrics, INC.)]을 사용한다.
표 5 및 표 6 에 나타난 혈청 트리글리세리드의 양은 사람 혈청의 공칭값이다.
[시약]
(시약 용액 20)
R-1 : 5 U/ml 의 CO(CHO "Amano VW", 아마노 파마슈티칼 사), 5 U/ml 의 CHE(일련 번호 T-18, 아사히 가세이 고오교 가부시끼가이샤), 1 mM 의 HDAOS, 0.04 % 의 LEBON LAG 40, 0.03 %(w/v) 의 헤파린, 0.02 % 의 Triton X-100(HLB : 13.5) 및 1,000 U/ml 의 CAT(베링거 만하임 사)를 함유하는 25 mM TAPSO-NaOH 완충액(pH 7.0).
R-2 : 1 mM 의 4-AA, 20 U/ml 의 POD (일련 번호 PEO-302, 토요보 사), 0.5 %(w/v) 의 Triton X-100 및 0.1 % (w/v) 의 NaN3를 함유하는 25 mM TAPSO-NaOH 완충액(pH 7.0).
(시약 용액 21)
R-1 : 5 U/ml 의 CO(CHO "Amano VW", 아마노 파마슈티칼 사), 5 U/ml 의 CHE(일련 번호 T-18, 아사히 가세이 고오교 가부시끼가이샤), 1 mM 의 HDAOS, 0.04 %(w/v) 의 LEBON LAG 40, 0.03 %(w/v) 의 헤파린, 0.02 % 의 Triton X-100(HLB : 13.5), 1,000 U/ml 의 CAT(베링거 만하임 사), 및 참고예 1,(4)에서 수득된 양 글루쿠론산-수식 HDL 항체를 함유하는 25 mM TAPSO-NaOH 완충액(pH 7.0).
R-2 : 시약 용액 20 과 동일.
[측정 조건]
실시예 2 와 동일.
[결과]
표 5 에 400 mg/dl 미만의 값의 트리글리세리드를 갖는 혈청으로부터 수득된 결과를 나타내고, 표 6 에 400 mg/dl 초과의 값의 트리글리세리드를 갖는 혈청으로부터 수득된 결과를 나타낸다.
시료 번호 | 시약 용액 20(mg/dl) | 시약 용액 21(mg/dl) | LDL-콜레스테롤의 공칭값(mg/dl) | 트리글리세리드의 공칭값(mg/dl) |
1 | 77 | 75 | 79 | 55 |
2 | 80 | 79 | 82 | 81 |
3 | 88 | 87 | 92 | 61 |
4 | 99 | 98 | 106 | 84 |
5 | 120 | 121 | 115 | 220 |
6 | 120 | 121 | 117 | 175 |
7 | 116 | 115 | 118 | 109 |
8 | 126 | 125 | 120 | 150 |
9 | 125 | 127 | 132 | 146 |
10 | 133 | 133 | 137 | 155 |
11 | 135 | 135 | 141 | 201 |
12 | 144 | 144 | 142 | 255 |
13 | 141 | 142 | 146 | 246 |
14 | 154 | 153 | 152 | 203 |
15 | 158 | 158 | 167 | 180 |
평균값 | 121 | 121 | 123 | - |
공칭값과의 상관계수 | 0.983 | 0.984 | - | - |
시료 번호 | 시약 용액 20(mg/dl) | 시약 용액 21(mg/dl) | LDL-콜레스테롤의 공칭값(mg/dl) | 트리글리세리드의 공칭값(mg/dl) |
1 | 58 | 55 | 54 | 409 |
2 | 102 | 88 | 60 | 754 |
3 | 125 | 117 | 104 | 490 |
4 | 130 | 120 | 108 | 720 |
5 | 112 | 111 | 109 | 404 |
6 | 109 | 107 | 110 | 431 |
7 | 134 | 127 | 129 | 445 |
8 | 146 | 138 | 135 | 501 |
평균값 | 115 | 108 | 101 | - |
공칭값과의 상관계수 | 0.874 | 0.936 | - | - |
표 5 에 나타난 결과로부터, 400 mg/dl 미만인 트리글리세리드를 갖는 혈청을 시료로 사용할 때, 시약 용액 20을 사용하여 측정된 LDL-콜레스테롤 값과 시약 용액 21을 사용하여 측정된 LDL-콜레스테롤 값 모두가 BQ 법(베타 정량법)으로 측정된 공칭값과 실질적으로 동일하다는 것을 알 수 있다. 표 6에서 나타난 결과로부터, 400 mg/dl 초과인 트리글리세리드를 갖는 혈청을 시료로 사용할 때, 시약 용액 21을 사용하여 측정된 LDL-콜레스테롤 값, 즉, 다가음이온 및 양성 계면활성제 뿐만 아니라 LDL 이외의 리포단백질에 결합할 수 있는 항체의 존재하에 측정된 LDL-콜레스테롤 값이 공칭값과 가깝고, 즉, 시약 용액 21 은 LDL-콜레스테롤을 더욱 특이적으로 측정할 수 있다는 것을 알 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명은 특히 높은 정밀도를 갖는 생체로부터 유래한 시료 중 LDL-콜레스테롤의 측정을 가능케하는 방법, 및 상기 방법에서 사용된 시약 및 시약 조성물을 제공한다. 본 발명의 적용으로 인해 통상적인 방법으로 불가능하였던 일반적으로 사용되는 자동분석기를 사용하여 LDL-콜레스테롤의 측정이 가능하다.
Claims (33)
- 시료를 하나 이상의 시약 용액과 접촉시켜 다가음이온 및 양성 계면활성제의 존재하에서 반응을 수행하고, 및 상기 수득된 반응 생성물을 광학 측정하여 콜레스테롤의 양을 결정하는 것으로 이루어진 시료중 저밀도 리포단백질중 콜레스테롤의 양을 측정하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 광학 측정이 시료를 제 1 시약 용액과 접촉시키므로써 수득된 용액의 흡광도 (OD1) 를 측정하고, OD1측정후 OD1측정용 용액과 제 2 시약 용액을 접촉시켜 수득된 용액의 흡광도 (OD2) 를 측정하는 것으로 수행되는 것을 특징으로 하는 측정방법.
- 제 2 항에 있어서, 제 1 시약 용액이 (a) 다가음이온 및 양성 계면활성제, (b) 콜레스테롤 에스테라제, (c-i) 콜레스테롤 옥시다제, 퍼옥시다제 및 산화성 발색 시약 또는 (c-ii) 콜레스테롤 탈수소효소 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (포스페이트), 및 (d) 수성 매질로 이루어지고, 및 제 2 시약 용액이 수성 매질로 이루어지는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
- 제 2 항에 있어서, 제 1 시약 용액이 (a) 다가음이온 및 양성 계면활성제, (b) 콜레스테롤 에스테라제, (c) 콜레스테롤 옥시다제, (d) 퍼옥시다제, 및 (e) 수성 매질로 이루어지고, 및 제 2 시약 용액이 수성매질로 이루어지며, 커플링제 및 현색제중 하나가 제 1 시약 용액에 함유되고, 다른 하나가 제 2 시약 용액에 함유되는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
- 제 2 항에 있어서, 제 1 시약 용액이 (a) 다가음이온 및 양성 계면활성제, (b) 콜레스테롤 에스테라제, (c) 콜레스테롤 옥시다제, (d) 카탈라제, 및 (e) 수성 매질로 이루어지고, 및 제 2 시약 용액이 (f) 카탈라제 저해제 및 (g) 수성 매질로 이루어지며, 퍼옥시다제, 커플링제 및 현색제 각각이 제 1 시약 용액 및 제 2 시약 용액중 적어도 하나에 함유되는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
- 제 2 항에 있어서, 제 1 시약 용액이 (a) 다가음이온 및 양성 계면활성제, (b) 콜레스테롤 에스테라제, (c) 콜레스테롤 탈수소효소 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (포스페이트), 및 (d) 수성 매질로 이루어지고, 및 제 2 시약 용액이 (e) 수성 매질 및 (f) 콜레스테롤 옥시다제, 퍼옥시다제, 산화성 발색 시약 및 콜레스테롤 탈수소효소 저해제로 이루어는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
- 제 2 항에 있어서, 제 1 시약 용액이 (a) 다가음이온 및 양성 계면활성제, (b) 콜레스테롤 에스테라제, (c) 콜레스테롤 옥시다제, 퍼옥시다제 및 하나 이상의 커플링제 및 현색제, 및 (d) 수성 매질로 이루어지고, 및 제 2 시약 용액이 (e) 수성 매질 및 (f) 콜레스테롤 탈수소효소, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (포스페이트) 및 콜레스테롤 옥시다제 저해제로 이루어는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
- 제 2 항에 있어서, 흡광도 OD1의 측정을 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질중 콜레스테롤 반응의 실질적인 완료 후 및 저밀도 리포단백질의 콜레스테롤의 반응 개시 전 시점에서 수행하고, 흡광도 OD2의 측정을 저밀도 리포단백질의 콜레스테롤 반응의 실질적인 완료 후에 수행하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
- 제 1 항에 있어서, 시약 용액이 (a) 다가음이온 및 양성 계면활성제, (b) 콜레스테롤 에스테라제, (c-i) 콜레스테롤 옥시다제, 퍼옥시다제 및 산화성 발색 시약, 또는 (c-ii) 콜레스테롤 탈수소효소 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (포스페이트), 및 (d) 수성 매질로 이루어지고, 광학 측정을, 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질중 콜레스테롤 반응의 실질적인 완료후지만 저밀도 리포단백질중 콜레스테롤의 상기 시약 용액과의 반응 개시전 시점에서 흡광도 OD1를 측정하고, 흡광도 OD2를 저밀도 리포단백질중 콜레스테롤의 상기 시약 용액과의 반응의 실질적인 완료후에 측정하는 것으로 수행하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
- (a) 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 또는 콜레스테롤 탈수소효소, (b) 다가음이온, 및 (c) 양성 계면활성제로 이루어진 저밀도 리포단백질중 콜레스테롤 양의 측정용 시약.
- 하기로 구성된 저밀도 리포단백질중 콜레스테롤의 양을 측정하기 위한 키트:(A) (a) 다가음이온, (b) 양성 계면활성제, (c) 콜레스테롤 에스테라제, (d-i) 콜레스테롤 옥시다제, 퍼옥시다제 및 산화성 발색 시약 또는 (d-ii) 콜레스테롤 탈수소효소 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (포스페이트), 및 (e) 수성 매질을 함유하는 제 1 시약 용기, 및(B) 수성 매질을 함유하는 제 2 시약 용기.
- 하기로 구성된 저밀도 리포단백질중 콜레스테롤의 양을 측정하기 위한 키트:(A) (a) 다가음이온, (b) 양성 계면활성제, (c) 콜레스테롤 에스테라제, (d) 콜레스테롤 옥시다제, (e) 퍼옥시다제, 및 (f) 수성 매질을 함유하는 제 1 시약 용기, 및(B) 수성 매질을 함유하는 제 2 시약 용기,상기중 커플링제 및 현색제중 하나가 제 1 시약 용기에 추가로 혼입되고, 다른 하나가 제 2 시약 용기에 혼입된다.
- 하기로 구성된 저밀도 리포단백질중 콜레스테롤의 양을 측정하기 위한 키트:(A) (a) 다가음이온, (b) 양성 계면활성제, (c) 콜레스테롤 에스테라제, (d) 콜레스테롤 옥시다제, (e) 카탈라제, 및 (f) 수성 매질을 함유하는 제 1 시약 용기, 및(B) (g) 카탈라제 저해제 및 (h) 수성 매질을 함유하는 제 2 시약 용기,상기중 퍼옥시다제, 커플링제 및 현색제 각각이 제 1 시약 용기 및 제 2 시약 용기중 하나 이상에 혼입된다.
- 하기로 구성된 저밀도 리포단백질중 콜레스테롤의 양을 측정하기 위한 키트:(A) (a) 다가음이온, (b) 양성 계면활성제, (c) 콜레스테롤 에스테라제, (d) 콜레스테롤 탈수소효소, (e) 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (포스페이트), 및 (f) 수성 매질을 함유하는 제 1 시약 용기, 및(B) (g) 수성 매질 및 (h) 콜레스테롤 옥시다제, (i) 퍼옥시다제, (j) 산화성 발색 시약, 및 (k) 콜레스테롤 탈수소효소 저해제를 함유하는 제 2 시약 용기.
- 하기로 구성된 저밀도 리포단백질중 콜레스테롤의 양을 측정하기 위한 키트:(A) (a) 다가음이온, (b) 양성 계면활성제, (c) 콜레스테롤 에스테라제, (d) 콜레스테롤 옥시다제, (e) 퍼옥시다제, (f) 커플링제 및 현색제중 하나 이상, 및 (g) 수성 매질을 함유하는 제 1 시약 용기, 및(B) (h) 수성 매질 및 (i) 콜레스테롤 탈수소효소, (j) 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (포스페이트) 및 (k) 콜레스테롤 옥시다제 저해제를 함유하는 제 2 시약 용기.
- (a) 다가음이온, (b) 양성 계면활성제, (c) 콜레스테롤 에스테라제, (d-i) 콜레스테롤 옥시다제, 퍼옥시다제 및 산화성 발색 시약 또는 (d-ii) 콜레스테롤 탈수소효소 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (포스페이트), 및 (e) 수성 매질로 이루어진 저밀도 리포단백질중 콜레스테롤의 양을 측정하기 위한 시약 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 시료를 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질에 결합하는 항체의 존재하에서 하나 이상의 시약 용액과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
- 제 1 항에 있어서, 시료를 비이온성 계면활성제 및/또는 음이온성 계면활성제의 존재하에서 하나 이상의 시약 용액과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
- 제 1 항에 있어서, 양성 계면활성제가 알킬 베타인 유도체, 이미다졸리늄 베타인 유도체, 술포베타인 유도체, 아미노카르복실산 유도체, 이미다졸린 유도체 및 아민 옥시드 유도체로 구성된 군으로 부터 선택된 하나 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 측정 방법.
- 제 1 항에 있어서, 양성 계면활성제가 라우릴 베타인, 라우르산 아미도프로필 베타인, 코코넛 오일 지방산 아미도프로필 베타인, 2-알킬-N-카로복시메틸-N-히드록시에틸 이미다졸리늄 베타인 및 2-알킬-N-카르복시에틸-N-히드록시에틸 이미다졸리늄 베타인으로 구성된 군으로 부터 선택된 하나 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 측정 방법.
- 제 1 항에 있어서, 다가음이온이 헤파린, 인텅스텐산, 덱스트란 술페이트, 황화시클로덱스트린, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 히알루론산, 황화올리고사카라이드, 황화폴리아크릴아미드, 카르복시메틸화 폴리아크릴아미드 및 그의 염으로 구성된 군으로 부터 선택된 하나 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 측정 방법.
- 제 10 항에 있어서, 시약이 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질에 결합하는 항체를 더 혼입하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
- 제 10 항에 있어서, 시약이 비이온성 계면활성제 및/또는 음이온성 계면활성제를 더 혼입하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
- 제 10 항에 있어서, 양성 계면활성제가 알킬 베타인 유도체, 이미다졸리늄 베타인 유도체, 술포베타인 유도체, 아미노카르복실산 유도체, 이미다졸린 유도체 및 아민 옥시드 유도체로 구성된 군으로 부터 선택된 하나 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 시약.
- 제 10 항에 있어서, 양성 계면활성제가 라우릴 베타인, 라우르산 아미도프로필 베타인, 코코넛 오일 지방산 아미도프로필 베타인, 2-알킬-N-카로복시메틸-N-히드록시에틸 이미다졸리늄 베타인 및 2-알킬-N-카르복시에틸-N-히드록시에틸 이미다졸리늄 베타인으로 구성된 군으로 부터 선택된 하나 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 시약.
- 제 10 항에 있어서, 다가음이온이 헤파린, 인텅스텐산, 덱스트란 술페이트, 황화시클로덱스트린, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 히알루론산, 황화올리고사카라이드, 황화폴리아크릴아미드, 카르복시메틸화 폴리아크릴아미드 및 그의 염으로 구성된 군으로 부터 선택된 하나 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 시약.
- 제 13 항에 있어서, 제 1 시약 용기가 저밀도 리포단백질 이외의 리포단백질에 결합하는 항체를 더 혼입하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 13 항에 있어서, 제 1 시약 용기 및 제 2 시약 용기중 하나 이상이 비이온성 계면활성제 및/또는 음이온성 계면활성제를 더 혼입하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 13 항에 있어서, 양성 계면활성제가 알킬 베타인 유도체, 이미다졸리늄 베타인 유도체, 술포베타인 유도체, 아미노카르복실산 유도체, 이미다졸린 유도체 및 아민 옥시드 유도체로 구성된 군으로 부터 선택된 하나 이상의 화합물인 것을 특징으로 키트.
- 제 13 항에 있어서, 양성 계면활성제가 라우릴 베타인, 라우르산 아미도프로필 베타인, 코코넛 오일 지방산 아미도프로필 베타인, 2-알킬-N-카로복시메틸-N-히드록시에틸 이미다졸리늄 베타인 및 2-알킬-N-카르복시에틸-N-히드록시에틸 이미다졸리늄 베타인으로 구성된 군으로 부터 선택된 하나 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 키트.
- 제 13 항에 있어서, 다가음이온이 헤파린, 인텅스텐산, 덱스트란 술페이트, 황화시클로덱스트린, 헤파린 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 히알루론산, 황화올리고사카라이드, 황화폴리아크릴아미드, 카르복시메틸화 폴리아크릴아미드 및 그의 염으로 구성된 군으로 부터 선택된 하나 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 시약.
- 시료를, 다가음이온 및 양성 계면활성제의 존재하에서, (a) 콜레스테롤 에스테라제, 콜레스테롤 옥시다제, 퍼옥시다제 및 산화성 발색 시약 또는 (b) 콜레스테롤 에스테라제, 콜레스테롤 탈수소효소 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (포스페이트) 와 접촉시켜 반응을 유발하므로써, 염료 또는 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (포스페이트) 가 생성되고, 상기 염료 또는 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (포스페이트) 의 양을 측정하고, 상기 측정된 양을 기준으로 하여 콜레스테롤의 양을 결정하므로써, 시료중 저밀도 리포단백질의 콜레스테롤의 양이 특이적으로 측정되는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 저밀도 리포단백질중 콜레스테롤의 양을 측정하는 방법.
- 제 32 항에 있어서, 염료 또는 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (포스페이트) 의 양을 반응 용액의 흡광도를 측정하므로써 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
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