JP4842838B2 - レムナント様リポタンパク質中のコレステロールの測定方法 - Google Patents
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Description
斯かる活性比率を有するコレステロールエステラーゼとしては、例えばLP(旭化成ファーマ社製、活性比率460〜800)、LPBP(旭化成ファーマ社製、活性比率5600〜6900)、CEN(旭化成ファーマ社製、活性比率13.0〜16.0)、CE(天野エンザイム社製、活性比率13.0〜16.0)、COE311(東洋紡社製、活性比率28.0〜35.0)又はこれらと同等の活性比率を有する酵素が挙げられる。
また、コレステロールエステラーゼの使用量としては、被検試料中のレムナント様リポタンパク質の含有量或いは物理的性状に依存するが、通常0.1〜200単位/mLを使用すればよく、好適には1〜100単位/mLの範囲で使用することができる。通常、健常人においては、1〜5単位/mL程度で良好な測定結果を得ることができる。
尚、高脂血症患者の中でも特に従来から簡便な測定方法が望まれていたIII型家族性高脂血症患者では、50単位/mL以上を使用することが望ましい。また、健常妊婦では、一般に血中コレステロール値の上昇が認められるが、本発明のコレステロールエステラーゼを用いれば20単位/mLで良好な測定値を得ることができる。
緩衝液としては、例えばトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤及びグッドの緩衝液等が上げられる。グッドの緩衝剤としては、N−(2−アセタミド)−2−アミノエタンスルホン酸(ACES)、N−(2−アセタミド)イミノ二酢酸(ADA)、N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)−2−アミノエタンスルホン酸(BES)、3−[N,N−ビス(2−ヒドキシルエチル)アミノ]−2−ヒドキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、2−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−2−エタンスルホン酸(HEPES)、3−(N−モノホリノ)プロパンスルホン酸(MOPSO)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−ヒドロキシプロパン−3−スルホン酸)(POPS)などが挙げられる。
また、緩衝液のpHは4〜10、好ましくは5〜9である。緩衝液の使用濃度は、5〜500mMが好ましく、10〜200mMがより好ましく、20〜100mMが特に好ましい。
フェノール類としては、例えばフェノール、4−クロロフェノール、m−クレゾール、3−ヒドロキシ−2,4,6−トリヨード安息香酸(HTIB)等が挙げられる。
反応は、10〜50℃、好ましくは30〜40℃、通常37℃で、1〜30分間、好ましくは2〜10分間行なえばよい。
また、例えばレムナント様リポタンパク質以外のリポタンパク質が被検試料中に多く存在している場合など、これらリポタンパク質の影響を低減したい際、前述抗アポB−100抗体及び抗アポA−I抗体による前処理を行なう場合には、当該抗体を含有する第1試薬、上記の酵素溶液を含有する第2試薬からなる試薬として構成するのが好ましい。この場合、被検試料に第1試薬を添加し、25〜40℃で、1〜10分反応させた後、第2試薬を添加し25〜40℃で、2〜20分間作用させるのが望ましい。
斯かる塩類としては、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化リチウム、硫酸リチウム、硫酸アンモニウム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウムなどが挙げられ、0〜100mMで使用される。リポタンパク質凝集剤としてはリンタングステン酸塩、デキストラン硫酸塩、ヘパリンなどのポリアニオンが、マグネシウム、カルシウム、コバルト等の2価の金属塩が挙げられる。また、他の酵素としてはアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。
実施例1
(1)試料の調製
血清成分をLDL画分及びHDL画分に分画し、各リポタンパク質の測定を行なった。該タンパク質の分画方法を下記に示す。
抗アポB−100抗体結合アフィニテイカラム、抗アポA−I抗体結合アフィニテイカラムを各々作製し、血清を添加して結合画分を回収し、それぞれLDL、HDLとした。
また、VLDLの分画は超遠心分離法(Havel R.J.et al.J Clin Invest 1955;34:1345.、120,000rpm,1.5hr,4℃)で分離した(Total−VLDL)後、免疫吸着法(抗アポB−100抗体結合アフィニティーカラム)に結合した画分を、Bound−VLDL、素通り画分をUnbound−VLDL(レムナント様リポタンパク質画分)とした。実施例2及び3の測定に際しては、いずれもコレステロール濃度として40mg/dLに調製したものを使用した。
下記に示されるレムナント様リポタンパク質中のコレステロール測定試薬を作製した。
抗体前処理を行なう場合は、210μLの試薬1を分光光度計のセルに入れ、血清20μLを添加して攪拌した後、37℃にて加温した。次いで、5分後(reaction point 17)に予め37℃に加温しておいた試薬2を70μL添加し、その後5分(reaction point 33)まで測定した。測定波長は、主波長572nm及び副波長748nmにて測定した。
評価の基準はreaction point 17−33までの吸光度変化率で評価した。
(1)コレステロールエステラーゼのLDL及びHDLに対する反応特異性
LDL及びHDLを0.1%の界面活性剤(エマルゲン、花王社製)にて処理を行なったものと、未処理溶液を被検試料として、コレステロールの測定を行なった。但し、コレステロールエステラーゼとして、LP酵素(旭化成ファーマ社製、活性比率512)又はCE酵素(天野エンザイム社製、活性比率14.3)を用いた。LDLを図1に、HDLを図2に示す。測定方法は、実施例1に従った。いずれもコレステロール総反応量(界面活性剤処理)に比べLP酵素を使用した場合、著しく反応性が低減されていた。また、CE酵素を用いた場合は、LP酵素に比べ高い吸収を示した。
(2)Unbound−VLDL(レムナント様リポタンパク質画分)、bound−VLDLの反応特異性
本発明測定方法におけるVLDL画分の反応特異性をLP酵素を用いて検討した。尚、測定方法は、実施例1に従った。図3は、抗アポB−100抗体(JI−H)及び抗アポA−I抗体(H−12)未添加、図4は、抗体添加における反応性を示す。抗体は、JI−H及びH−12共に終濃度100μg/mLとなるように第1液に対して抗体を添加した。図3、図4共にunbound−VLDL及びbound−VLDL共にほぼ同様の反応曲線を示し、レムナント様リポタンパク質中のコレステロールが選択的に測定されることが確認された。さらに、抗体の添加した場合は、bound−VLDL反応性はさらに約1/3まで低下し、酵素反応が抑制された。
従って、抗体添加によりレムナント様リポタンパク質がより精度良く測定されることが判明した。
(1)VLDL画分中のレムナント様リポタンパク質中のコレステロールを従来のレムナント様タンパク質測定キット(RLP−C II、日本抗体研究所社製)と、各種コレステロールエステラーゼ(LP:活性比率512(旭化成ファーマ社製)、LPBP:活性比率6296(旭化成ファーマ社製)、CEBPM:活性比率11.2(東洋紡社製)、CEN:活性比率14.3(旭化成ファーマ社製)、COE311:活性比率31.8(東洋紡社製))を使用して実施例3と同様の条件で測定し、その相関を求めた。結果を表1に示す。
その結果、CEBPMを除く4酵素を使用した場合には、既存の市販キットとの測定値の間に相関が認められた。
健常人14例、III型高脂血症2例を含む高脂血症者20例、冠動脈疾患患者65例、以上99例を対象としてRLP−C II法とDirect RLP−C法で同時に測定し、その相関を比較検討した。その結果、回帰曲線y=0.987x+0.326、相関係数r=0.962と良好な相関が得られた(図5)。
Claims (4)
- リポタンパク質を含有する被検試料に、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを作用させ、生成する過酸化水素又は還元型補酵素を測定することによりリポタンパク質中のコレステロールを測定する方法において、リポタンパク質リパーゼとコレステロールエステラーゼの活性比率(リポタンパク質リパーゼ活性/コレステロールエステラーゼ活性)が28〜800であるコレステロールエステラーゼを用いることを特徴とするレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方法。
- 被検試料を抗アポB−100抗体、抗アポA−I抗体にて前処理するものである請求項1記載の方法。
- リポタンパク質リパーゼとコレステロールエステラーゼの活性比率(リポタンパク質リパーゼ活性/コレステロールエステラーゼ活性)が28〜800であるコレステロールエステラーゼと、コレステロールオキシダーゼ又はコレステロールデヒドロゲナーゼを含有するレムナント様リポタンパク質中のコレステロール測定試薬。
- 抗アポB−100抗体、抗アポA−I抗体を含む第1試薬と、請求項3記載の測定試薬を含む第2試薬からなるレムナント様リポタンパク質中のコレステロール測定試薬。
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