JPH03245058A - 変性リポタンパクの測定法及びこれに用いるキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は変性リポタンパクの測定法、更に詳細には特に
心筋梗塞等の心疾患や、糖尿病、脳卒中等の脳血管障害
等の各種動脈硬化性疾患の発症因子としての脂質代謝異
常の臨床検査や診断に有用な変性リポタンパクの測定法
及びこれに用いるキットに関する。

〔従来の技術〕

脂質代謝異常とは、リポタンパクの合成、分泌、異化の
過程でこれらのいずれかが異常をきたす状態と定義でき
、これは先天性リポタンパク代謝異常と後天性リポタン
パク代謝異常とに分類される。

また、上記脂質代謝異常は、種々の疾患、例えば心筋梗
塞等の心疾患、脳卒中等の脳血管障害等の各種動脈硬化
性疾患等の発症の重大な危険因子（リスクファクター）
とされており、これら疾患の進展、予後等に重大な影響
を及ぼすことが知られており、該脂質代謝異常の検出は
、各種の臨床検査・診断に極めて重要な成果をもたらす
。

従来、上記脂質代謝異常の検出法としては、血液中の総
コレステロール値をパラメーターとするものが最も一般
的に定着している。この方法は、血液中の総コレステロ
ール値を常法、例えば酵素法により測定し、該値が臨床
的及び経験的に設定された域値（正常域）を逸脱する場
合を脂質代謝異常として検出するものである。また近年
、血液中のリポタンパク、即ち脂質とアポタンパクとの
結合物を比重により分画し、このうち特に高比重のリポ
タンパク　（高密度リポタンパク、ＨＤＬ）のコレステ
ロール値を測定し、このＨＤＬ−コレステロール値その
もの又は該値に対する総コレステロール値から該値を引
いた値、所謂動脈硬化指数を、脂質代謝異常の検出パラ
メーター、とする方法も行われている。

しかしながら、現在までに蓄積された多くの免疫学的調
査の結果及び臨床的知見によれば、これら従来の脂質代
謝異常の検出方法は、実際の脂質代謝異常を必ずしも的
確に反映するものではなく、殊に臨床上その意義は低い
ことがしばしば指摘されている。即ち、上記従来法はい
ずれも総コレステロール値又はこれとＨＤＬ−コレステ
ロール値を測定するものであって、これらの測定値はい
ずれも脂質代謝異常とは必ずしも関連しない。特に総コ
レステロール値の高値は虚血性心疾患のリスクファクタ
ーの一つとしての意義は有する〔例えばＭｅｄ、　Ｃｌ
１ｎ、　Ｎｏｒｔｈ　Ａｍ、、　５８．３６３−３７９
（１９７４）参照〕が、疾患と直接結付くものではなく
、その検出方法による脂質代謝正常群における疾患の発
生や高度脂質代謝異常群における恒常的な健全性等は、
いずれも何ら希なものではない。またＨＤＬ−コレステ
ロール値及びこれを基準とする動脈硬化指数をパラメー
ターとする場合も、上記と同様に実際の脂質代謝異常を
必ずしも的確に反映しない〔動脈硬化、１４（４）、　
９３１−９３６（１９８６）等参照〕。

更に、最近の知見によると実際の脂質代謝異常には、超
低比重リポタンパク（ＶＬＤＬ）等のリポタンパクが生
体内で何らかの作用を受けることにより生成すると考え
られる変性リポタンパクが、重大な影響を及ぼすという
報告が種々なされている〔例えばＨｕｉ、　Ｄ、　Ｙ、
、　Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙ、　Ｔ、　Ｌ、、　＆Ｍａｈ
ｌｅｙ、　Ｒ，Ｗ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、
、　２５９．８６０８６９（１９８４）　：　Ｇｏｎｅ
ｎ　Ｂ　ａｔ　ａｌ、、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ、　３０゜
８７５（１９８１）等参照〕。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、この変性リポタンパクを検出できれば、脂質代
謝異常を正確に検出でき、これは該脂質代謝異常をもた
らす各種疾患の的確な診断手段として、殊に疾患の発見
、進展状態、治療効果の把握等の臨床分野において非常
に有効であると考えられる。

本発明者は、総血漿リポタンパクから、アポタンパクＡ
−Ｉを構成成分とするリポタンパク　（アポＡ−■含有
リポタンパク）及びアポタンパクＢ−ｉｏｏを構成成分
とするリポタンパク　（アポＢ１００含有リポタンパク
）を除したものが、上記変性リポタンパクに相当するこ
とを認めると共に、予め調製された抗アポタンパクΔ〜
Ｉモノクローナル抗体及び抗アポタンパクＢ−１００モ
ノクローナル抗体を含むアフィニティゲル混合物と被検
血液とを接触させる時には上記アポタンパクＡ−■含有
リポタンパク及びアポタンパクＢ１００含有リポタンパ
クが兄事に系外に除去され、系の脂質測定によって所望
の変性リポタンパク量を容易且つ確実に測定、検出でき
ることを見出し、先に特許出願した（特願昭６３−２４
４９８７号、特願平１−２３１８９３号）が、さらに新
たな変性リポタンパクの測定方法の開発が望まれている
。

〔課題を解決するための手段〕

かかる実情において本発明者は、更に研究を重ねた結果
、検体よりアポタンパクＡ−１含有リポタンパク及びア
ポタンパクＢ−１００含有りポタンパク、又はアポタン
パクＢ−１００含有リポタンパクを除去した後、残渣に
抗了ボタンバクＢポリクローナル抗体を反応させ、これ
に結合するリポタンパク量を測定したところ、このリポ
タンパク量が検体中の変性リポタンパク量をよく反映し
ていることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は検体から抗了ボタンバクＢ１００モ
ノクローナル抗体に結合するリポタンパク又は抗アポタ
ンパクＢ−１００モノクローナル抗体及び抗アポタンパ
クΔ−Ｉモノクローナル抗体に結合するリポタンパクを
除去した残渣より、抗アポタンパクＢポリクローナル抗
体に結合するリポタンパクを検出することを特徴とする
、検体中の変性リポタンパクの測定法、並びにこれに用
いる変性リポタンパク測定用キットを提供するものであ
る。

本発明測定法において、検体としては血液、特に空腹時
の血清又は血漿が好ましく、これらは被検者より採血後
、常法に従い調製できる。

本発明において、検体から抗アポタンパクＢ−１００モ
ノクローナル抗体に結合するリポタンパク、又は抗アポ
タンパクＢ−１００モノクローナル抗体及び抗アポタン
パクＡ、−１モノクローナル抗体に結合するリポタンパ
クを除去するには、例えば抗アポタンパクＢ−１００モ
ノクローナル抗体を結合させたアフィニティゲル、ある
いは抗アポタンパクＢ−１００モノクローナル抗体及び
抗アポタンパクＡ−■モノクローナル抗体を結合させた
アフィニティゲル混合物に、検体を加えて反応させた後
、遠心分離等によりゲルを除去すればよい。

ここで用いるアフィニティゲルは、通常の方法で調製で
きる。すなわち、例えば上記のアフィニティゲルの調製
は、抗アポタンパクＡ−１モノクローナル抗体及び抗ア
ポタンパクＢ−１００モノクローナル抗体のそれぞれを
ブロモシアン等で活性化させたアフィニティゲルにカッ
プリングさせ、その後両者を混合し、適当な緩衝液にて
平衡化する。ここで用いられる抗体としては、抗ヒトア
ポＡ−Ｉモノクローナル抗体及び抗体ヒトアポＢ−１０
０モノクローナル抗体（いずれも株式会社日本抗体研究
所製造）を代表例として例示できるが、特にこれらに限
定されるものではない。また用いられるアフィニティゲ
ルの代表例としては、例えば予めブロモシアン等で活性
化されたセファロース４Ｂ（ファルマシア社製）等を例
示でき、カップリング反応は上記ゲルとタンパクとのカ
ップリング反応に慣用される常法に従い、通常ｐＨ８〜
１０の範囲でゲル１−当たり約ｌ〜１０μモルの抗体を
用いて、室温（約２０〜２５℃）下に２時間以内で実施
できる。

このようにして調製されたアフィニテイゲルは、そのま
ま又は振盪及び遠心分離が可能なチューブに予め調製し
ておくことが好ましく、また予め適当な緩衝液、例えば
０．　ＯＩＭ　）　Ｕス塩酸緩衝液（ｐＨ７、４）　＋
　０．１５Ｍ　　Ｎａｃｌ等の緩衝液で上記ゲルを平衡
化しておくのが好ましい。更に上記緩衝液には、例えば
アジ化ナトリウム等の通常の保存剤を含ませることがで
きる。

また、上記アフィニティゲル混合物における抗アポタン
パクＡ−１モノクローナル抗体及び抗アポタンパクＢ−
１００モノクローナル抗体の配合割合は、特に限定され
るものではなく、適宜決定できるが、通常前者に対して
後者を等重量以上、好ましくは約１〜２倍重量の範囲か
ら選択するのが望ましい。また得られるアフィニティゲ
ル混合物のｐＨは一般には約７〜７．５の範囲に調整さ
れるのが好適である。

検体から抗アポタンパクＢ−１００モノクローナル抗体
に結合するリポタンパク又は抗アポタンパクＢ−１００
モノクローナル抗体及び抗アポタンパクＡ−Ｉモノクロ
ーナル抗体に結合するリポタンパクを除去するための好
ましい一実施態様によれば、まず前記のアフィニティゲ
ル（混合物）を振盪及び遠心可能な適当な容器乃至テス
トチューブに入れ、適−当な緩衝液で平衡化させた後、
該容器内に所定量の被検血清を加え、室温で静置又は振
盪して反応させた後、比較的低速度（約８００〜１００
０　ｒｐｍ＞で遠心分離して沈渣を除去し、上清を取得
することにより実施される。この方法における被検血清
の使用量は、通常前記アフィニティゲル（混合物）重量
の約１／８重量程度、好ましくは１／４〜１／１６重量
程度とするのがよい。

かくして得られた残渣（上記実施態様における上清）よ
り、抗アポタンパクＢポリクローナル抗体に結合するリ
ポタンパクを検出するには、抗アポタンパクＢポリクロ
ーナル抗体を用いた通常の免疫学的手段を採用できるが
、例えば抗アポタンパクＢポリクローナル抗体を固定化
した不溶性担体に上記残渣を接触させ、次いでこれに標
識抗アポタンパクＢポリクローナル抗体を反応させ、該
担体中の反応生成物の標識量を測定することにより行う
のが好ましい。

本発明測定法に使用される抗アポタンパクＢポリクロー
ナル抗体としては、マウス、ラット、モルモット、ウサ
ギ、ヒツジ、ヤギ、馬、牛等の動物にアポタンパクＢを
感作させて得られる抗血層、これより分離されたイムノ
グロブリン（例えばＩｇＧ　、　ＩｇＭ等）　この加工
品であるＦ（ａｂ’）ｚ、Ｐ（ａｂ′）　、Ｆ（ａｂ）
などが挙げられる。

不溶性担体としては、例えばガラス、ポリスチレン、ポ
リエチレン、シリカ、フェノール樹脂、アクリル樹脂、
セルロース、ウレタン樹脂、ポリビニルアルコール、塩
化ビニル樹脂、ポリ塩化ビニリデン、ポリプロピレン、
ポリテレフタレート、ポリカーボネート、ナイロン、フ
ッ素系プラスチック、ポリエステル等の球状又は多角形
粒子；あるいはセルロース、綿、ガラス繊維、ナイロン
繊維、ビニロン繊維、アクリル繊維、ポリエチレン繊維
、ポリエステル繊維等の繊維性のものが挙げられる。こ
れらのうち、球状又は多角形粒子が好ましく、その粒径
は、免疫反応終了後のＢ／Ｆ分離の容易性を考慮すると
一般に３ｍｍ〜５ｍｍが好ましい。

これらの不溶性担体に抗アポタンパクＢポリクローナル
抗体を固定化するには、不溶性担体のもつ吸着性を利用
して自体公知の方法によって抗アポタンパクＢポリクロ
ーナル抗体を担体の表面に結合させる。例えば、担体が
ポリスチレンボールの場合には抗体を入れた緩衝液に一
晩かるくＳ盪しながら吸着させることによって固相化す
る。また担体がガラスピーズの場合には、その表面に塩
基性アミノ酸類を吸着させ、これにグルタルアルデヒド
、マレイミド等の架橋剤を結合させ、さらにこの架橋剤
に抗アポタンパクＢポリクローナル抗体を結合させるこ
とによって固定化する。

標識抗アポタンパクＢポリクローナル抗体は、抗アポタ
ンパクＢポリクローナル抗体を通常の標識剤を用いて標
識することにより調製される。標識剤としては、例えば
ヨウ素アイソトープ（例えば＋２５１．　＋３１１）　
、＋４［：　、　　）リチウム等の放射性アイソトープ
；ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ジア
ホラーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、ベニシリナーゼ等の酵素；又はフルオレッセ
インイソシアネート、フルオレッセインイソチオシアネ
ート、ローダミン等の蛍光物質が挙げられるが、このう
ち酵素が好ましい。これらの標識剤で上記抗アポタンパ
クＢポリクローナル抗体を標識するには自体公知の方法
が採用される。

また反応生成物中の標識量の測定には、標識剤が酵素の
場合、該酵素の基質及び発色剤を利用し、標識量を吸光
度変化として測定するのが好ましい。

かかる基質及び発色剤としては、標識剤の酵素に対応し
て、次のものが例示される。すなわち、ペルオキシダー
ゼの場合、基質として過酸化水素が発色剤として０−ジ
アニシジン、ｏ　−トＩＪジン、４−クロル−１−ナフ
トル、２，２′−アジノー３エチルベンゾチアゾリンス
ルホネー）　［ＡＢＴＳ）、３−アミノ−９−エチルカ
ルバゾール、２．７フルオレンジアミン、３−メチル−
２−ペンゾチアゾリノンハイドロゾン［ＭＢＴＩＩ］　
、チラミン等が挙げられ；アルカリフォスファターゼの
場合、基質としてｐ−二トロフェノールリン酸が、発色
剤として４−アミノアンチピリン等が挙げられる。

前記の残渣より、抗アポタンパクＢポリクローナル抗体
に結合するリポタンパクを検出するための一実施態様を
示せば、次の通りである。すなわち、まず、前記の残渣
に、適当な緩衝液に浸漬した抗アポタンパクＢポリクロ
ーナル抗体（例えば、抗アポタンパクＢ　ＩｇＧ）結合
ポリスチレンボールを添加し、約３７℃で１〜３時間イ
ンキュベート後、該ポリスチレンボールを適当な緩衝液
で洗浄する。次に酵素標識抗了ボタンバクＢポリクロナ
ル抗体（例えばベルオキシダーセ標識抗アポタンパクＢ
　Ｆ（ａｂ’））を含有する緩衝液を添加し、約３７℃
で０．５〜２時間インキュベートし、再び該ポリスチレ
ンボールを適当な緩衝液で洗浄する。

次に発色剤（例えば＾ＢＴＳ）を添加してブレインキュ
ベートし、さらに基質（例えば過酸化水素液）を添加し
てインキュベートした後、反応を停止させ、吸光度を測
定する。得られた吸光度と対照の吸光度との差から、検
体中の変性リポタンパク量が、測定できる。

本発明の測定法を実施するにあたっては、予め抗アポタ
ンパクＢ−１００モノクローナル抗体と抗アポタンパク
Ｂポリクローナル抗体の組み合せ、あるいは抗アポタン
パクＢ−１００モノクローナル抗体、抗アポタンパクＡ
−■モノクローナル抗体及び抗アポタンパクＢポリクロ
ーナル抗体の組み合せをキットとして供給するのが好ま
しい。また、抗アポタンパクＢ−１００モノクローナル
抗体及び抗アポタンパクＡ−１モノクローナル抗体はア
フィニティゲルとして供給し、抗アポタンパクＢポリク
ローナル゛抗体は不溶性担体に固定化したものと、標識
したものとして供給するのがより好ましい。なお、本発
明キットには、更に必要に応じてサッカロースやウシ血
清タンパク等の安定化剤及び／又は保存剤を添加配合で
きる。この保存剤はキットの使用に際し実験値に悪影響
を与えないものから遺択され、例えば代表的には希釈し
たアジ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ　ａｚｉｄｅ）等を
使用できる。また本発明キットには水溶性もしくは水と
混和し得るグリセリン、アルコール類、グリコール類、
グリコールエーテル類等を含有させることもできる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、変性リポタンパクを簡便に測定でき、
これを脂質代謝異常のパラメーターとして該異常を容易
且つ有効に検出できる。殊に、血液中の変性リポタンパ
ク量は脂質代謝異常及びその程度を的確に反映するもで
あり、本発明による脂質代謝異常の検出によれば、前記
した各種疾患の発見、進展、治療効果の把握等、特に従
来の検出法では把握できなかった心筋梗塞等の心疾患や
肥満等の病態の把握を十分且つ有効に行い得る。

〔実施例〕

次に参考例及び実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
する。

参考例１　抗アポタンパクＢポリクローナル抗体の調製 精製ＬＤＬ　（シグマ社製〉　２■／−とフロイントの
完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　Ｃｏｍｐｌｅｔ
ｅａｄｊｕｖａｎｔ）　（半井化学社塾〉を等量混合し
、ウサギ四肢、及び背中の皮肉数十ケ所に注射して免疫
した。２ケ月〜３ケ月の間に５〜６回同様に投与した。

最終投与２週間後に全血液を採取し、その血清を用いた
。

参考例２　抗ヒトアポタンパクＢポリクローナル抗体固
定化ポリスチレンボールの調製 参考例１で得られた血清を飽和硫酸アンモニウムで塩析
分画し、沈澱を少量のＰＢＳ緩衝液に溶解して、同緩衝
液に対して４℃で２４〜４８時間、外液を数回交換しな
がら透析を行った。透析後４℃、３０００ｒｐｍ、１０
分間遠心分離を行った上清をプレフィルタ−を通し、０
．０１７５Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ｐＨ６，３）で平衡化し
たＤＥＡＥセルロースに付加した。

溶出してくる画分を吸光度２８０ｎｍで測定し、タンパ
ク画分を集めこれに０．１ＭＰＢＳを１／９量加えて４
℃で保存した。

参考例３　ペルオキシダーゼ標識ヒトアポタンパクＢポ
リクローナル抗体の調製 ａ、ポリクローナル抗体の前処理 参考例１で得られた精製抗体を０．ＩＭ　ＮａＣｊ！を
含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，５）に対
して透析をした。この溶液にブタ胃・ペプシンをＩｇＧ
量の４％添加溶解し、３７℃で約１８時間反応させ、次
いで０．ＬＭ　ＮａＯＨでｐ）１７．０に調整して、０
．１ＭＮａＣ１を含む０．１ＭＩＪン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７．０）で平衡化したＴ　Ｓ　Ｋ　ｇｅｌ　Ｇ
３００［ＩＷ（２１，５ｍｍ　Ｘ６０ｃｍ）のカラムに
付した。Ｆ（ａｂ’）のピークを回収後、これを限外濾
過により約５■／−にまで濃縮し、５　ｍＭ　　Ｅ　Ｄ
　Ｔ　Ａを含む０，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で
透析を行った。透析後、０．１Ｍ　　２−メルカプトエ
チルアミン、及び５ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリ
ンｆＩＩ緩衝液（ｐＨ６，０）を１０分の１容添加し、
３７℃、９０分反応させた。ついでこれを５０ｍＭ　　
ＥＤＴＡ、及びＯ，ＩＭ　ＮａＣｆを含む０．１Ｍリン
酸ｔ１衝液で平衡化したＴ　Ｓ　Ｋ　ｇｅｔ　Ｇ３００
０ＳＩＩＩに付与し、Ｆ（ａｂ’）画分を回収した。回
収したＦ（ａｂ’）画分を限外濾過で濃縮して、２．５
ｍＭＥＤＴＡを含む０、１Ｍ　！Ｉン酸緩衝液で透析し
ベルオキシダーセ標識に供した。

ｂ、　ペルオキシダーゼの処理 Ｎ−サクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）
シクロヘキサン−１−カルボキシレート２．５■をＮ、
Ｎ−ジメチルホルムアミドの１５０μｌに溶解した溶液
を、０．１ＭＵン酸緩衝液（ｐＨ７，０＞１．５−に１
０ｍｇの西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を溶
解した液に入れ３０℃６０分間反応させた。ついで反応
液に存在する沈澱を遠心分離によって除去し、０．１Ｍ
ＩＪン酸緩黴液で平衡化したＴ　Ｓ　Ｋ　ｇｅｌ　Ｇ３
０００ＳＷに付与し、７Ｌ／イミド・ＨＲＰ画分を回収
後１．これを濃縮し−Ｃ２，５ｍＭＥ　Ｄ　ＴＡを含む
０．１ＭＵン酸緩衝液で透析した。

ｃ、ＨＲＰ標識 ａで得られたＦ（ａｂ′）４ｍｇとマレイミドＨＲＰ３
．６ｍｇを混合し、２．５ｍＭＥＤＴΔを含む０．１Ｍ
リン酸緩衝液を加えて２．　Ｏｍｆとし、３０℃で１時
間反応させた後、５０ｎＭＮ−エチルマレイミドを２０
１ＪＡ加えた。次いで０．　ＩＭ　Ｎａ１Ｊを含む０．
１Ｍリン酸緩衝液で平衡化したＴ　Ｓ　Ｋ　ｇｅｌ　Ｇ
３０００ＳＷＸＬ（７，８ｍｍ×３０　ｃｍ）に付与し
、Ｆ　ＲＰ−Ｆ（ａｈ’）の画分を回収した。これを回
収したＦ　ＲＰ−Ｆ（ａｂ）画分をＰＢＳ　（−）で透
析後、２　ｍｇ　／　ｍｌのチメロサールを１００分の
１添加し、分注して〜２０℃で保存した。

実施例１ （１）　　患者又は健常人より空腹時ＥＤＴＡ採血し、
遠心分離（２５００〜３０００ｒｐｍ）　して血漿を得
た。

得られた各血漿について、トリグリセライド量を酵素法
（ＴＧ−５５５、協和メディクス社製）により測定した
。またコレステロール量を酵素法（Ｍｅｒｅｋｏ　Ｔｅ
５ｔ　ＣＨＯ１関東化学社製、２−／１０μｌ血漿、３
７℃、１０分間インキュベート）により測定（３６５ｎ
ｍでの吸光度測定）した。

（２）上記血漿２０μｌを試験管に加え、抗ヒトアポＡ
−１モノクローナル抗体及び抗ヒトアポＢ１００モノク
ローナル抗体（ともに、株式会社日本抗体研究所製）を
それぞれ結合させたアフィニティゲル（ゲルｌ−当り各
抗体をタンパク量として１０ｍｇずつカップリング反応
させたブロムシアン活性化セファロース−４Ｂ）を含有
する反応液（各ゲルを等量の０．ＯＩＭ　ＰＢＳ　（ｐ
ｔ（７，４）に混和して調製したもの、各抗体のそれぞ
れ８０μｌを含む）６００μｌを分注し、振盪を３０分
間行い、その後１５分間静置して上清２００μｌを分取
した。

（３）上記（２）の操作をアフィニティゲルとして、抗
ヒトアポＢ−１００モノクローナル抗体のみを結合させ
たアフィニティゲル（調製手段は、抗体として抗ヒトア
ポＢ−１００モノクローナル抗体のみを使用する以外は
前記（２）と同様）を用いる以外は、上記（２）と同様
にして上ａ３００μｌを得た。

（４）上記上清３００μｌに抗アポＢ　ｆｇＧ固定化ポ
リスチレンボール〔牛血清アルブミン０．１％、塩化ナ
トリウム０．１Ｍを含むリン酸緩衝液（０，０１Ｍ、ｐ
Ｈ７，０〉に浸漬したもの〕を１個加え、３７℃で２時
間インキュベートした。アスピレータで反応液を除き、
ポリスチレンボールをリン酸緩衝液２ｒＬｆ、で２回洗
浄した。次いでペルオキシダーゼ標識抗アポＢ　　Ｆ（
ａｂ’）のリン酸緩衝液（０，１Ｍ、　ｐＨ６，５）３
００μｌ加え、３７℃で１時間インキュベートした。再
度アスピレータで反応液を除き、ポリスチレンボールを
リン酸緩衝液２−で２回洗浄した。

２．２′−アジノー３−エチルベンゾチアゾリンスルホ
ネート［ＡＢＴＳ］　０．１３■を含む緩衝液（０，０
１Ｍクエン酸三ナトリウム及び０．０１Ｍリン酸緩衝液
）にポリスチレンボールを加え、３７℃で２分間ブレイ
ンキュベートした。さらに０．０２％過酸化水素水２０
０μｌを加え、３７℃で６分間インキュベートした。次
に０．０５％アジ化ナトリウム液２００ｐｌを加えて反
応を停止させ、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定し
た。

（５）上記の試験を健常人５名及び脂質代謝異常患者５
名の血液を用いて行った結果を第１表に示す。

以下余白 第１表より、本発明の結果は、コレステロール値に比べ
てトリグリセライド値と高い相関を有しており、このこ
とより、外因性脂質代謝異常の一つの指標であるカイロ
ミクロンレムナンド及び内因性脂質代謝異常の一つの指
標である異常ＶＬＤＬ（β−）を反映する変性リポタン
パクの検出が行い得ることがｆｉｆｉｌＢできた。

また、上記（２）の上清を用いた場合と（３）の上清を
用いた場合の相関関係を第１図に示す。その結果、（２
）の上清を用いた場合と（３）の上清を用いた場合には
極めて高い相関性が認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１において（２）の上清を用いて変性リ
ポタンパクを測定した場合（縦軸）と（３）の上清を用
いて変性リポタンパクを測定した場合〈横軸）との相関
図である。 第１ 画分中のアぼＢ　（ＥＩＡ） 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、検体から抗アポタンパクＢ−１００モノクローナル
   抗体に結合するリポタンパク又は抗アポタンパクＢ−１
   ００モノクローナル抗体及び抗アポタンパクＡ−Ｉモノ
   クローナル抗体に結合するリポタンパクを除去した残渣
   より、抗アポタンパクＢポリクローナル抗体に結合する
   リポタンパクを検出することを特徴とする検体中の変性
   リポタンパクの測定法。 ２、抗アポタンパクＢポリクローナル抗体に結合するリ
   ポタンパクの検出が、抗アポタンパクＢポリクローナル
   抗体を固定化した不溶性担体に請求項１記載の残渣を接
   触させ、次いでこれに標識抗アポタンパクＢポリクロー
   ナル抗体を反応させ、該担体中の反応生成物の標識量を
   測定するものである請求項１記載の測定法。 ３、抗アポタンパクＢ−１００モノクローナル抗体及び
   抗アポタンパクＢポリクローナル抗体を含有する変性リ
   ポタンパク測定用キット。 ４、抗アポタンパクＢ−１００モノクローナル抗体、抗
   アポタンパクＡ−Ｉモノクローナル抗体及び抗アポタン
   パクＢポリクローナル抗体を含有する変性リポタンパク
   測定用キット。