JP6240065B2 - 低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のトリグリセリドの消去方法 - Google Patents

低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のトリグリセリドの消去方法 Download PDF

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Description

本発明は、試料中の低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のトリグリセリドの消去方法に関する。
血清・血漿中の脂質の主な成分は、コレステロール、トリグリセリド、リン脂質等であり、これら血中脂質はアポ蛋白と結合し、リポ蛋白として血液中を循環する。これらリポ蛋白は密度の差により、カイロミクロン（以下、ＣＭと称する）、超低密度リポ蛋白（以下、ＶＬＤＬと称する）、中間密度リポ蛋白（以下、ＩＤＬと称する）、低密度リポ蛋白（以下、ＬＤＬと称する）、高密度リポ蛋白（以下、ＨＤＬと称する）等に分類される。これらリポ蛋白のうち、ＨＤＬは組織に沈着した過剰なコレステロールを肝臓へ運搬する作用があり、抗動脈硬化作用がある。また、ＬＤＬは肝臓から各組織へのコレステロールの主たる運搬体であり、ＬＤＬの増加は動脈硬化発生と密接な関係があると考えられている。このことから、ＬＤＬ中のコレステロール（以下、ＬＤＬ−Ｃと称する）は、動脈硬化症、虚血性心疾患（冠動脈疾患）等の危険因子と考えられ、ＬＤＬ−Ｃの含有量を知ることは、これら疾患の診断・治療および予防において重要な指標とされている。その一方で、血液中のＬＤＬ−Ｃが正常範囲であっても虚血性心疾患等を発症する例も数多く認められ、最近ではＬＤＬ粒子の質の変化やコレステロール以外の構成成分にも注目するようになってきた。
トリグリセリドを多く含むＬＤＬ（以下、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬと称する）は、コレステロールの含有量が高い正常なＬＤＬとは性状が異なるリポタンパク質で、肝疾患患者血液中に多く見られ、肝疾患の進行に伴い血液中濃度は増加し、肝疾患の末期では血液中に存在するリポタンパク質の大部分を占めるとの報告がある。また、ＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬはマクロファージを泡沫化するが、このＴＧ−ｒｉｃｈ ＬＤＬによるマクロファージ泡沫化率と酸化ＬＤＬの一種であるマロンジアルデヒド修飾ＬＤＬの血清中濃度とが正比例すること、健常者血液中には過酸化トリグリセリドがほとんど検出されないのに対し、肝疾患患者血液中には過酸化トリグリセリドの著しい増加が見られること、などの報告により、ＬＤＬ中のトリグリセリドは酸化ＬＤＬとの関連も深いと考えられている。つまり、ＬＤＬ中のトリグリセリド量は、肝疾患や、酸化ＬＤＬが関与する種々の動脈硬化症、冠動脈疾患等に関わる重要な指標であると考えられる。
ＬＤＬ中のトリグリセリド（以下、ＬＤＬ−ＴＧと称する）の定量方法としては、分画分離とトリグリセリド定量の２つの段階操作を組み合わせて求める方法がある。分画分離操作は、超遠心法、電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を利用した方法等があり、定量法としては、たとえば臨床検査の場で用いられている自動分析装置を用いてトリグリセリド測定用試薬により定量を行う方法等がある。この両者を組み合わせて、ＬＤＬ−ＴＧの定量を行うことができるが、これらはＬＤＬとＬＤＬ以外のリポ蛋白とを完全に分離する前処理工程と、測定を行う工程の二段階で行われるため、操作が煩雑で時間がかかる。また分離方法によっては、分離した試料そのものの回収が困難であったり、定量的に回収することが困難であったり、定量的に回収することができる方法でも、作業に熟練が必要であったり、特別な機器が必要であったりする。これらは費用も高額となり、簡便性や経済性において普及しにくい方法である。
これらの問題点を解消する方法で、分画操作を行うことなく自動分析装置等で測定可能な方法としては、第１工程でＬＤＬ以外の全てのリポ蛋白中のトリグリセリドを除去した後、第２工程で残ったＬＤＬ中のトリグリセリドを測定する方法（特許文献１）や、第１工程で（遊離型グリセロールおよび）ＨＤＬ中のトリグリセリドを除去した後、第２工程でＬＤＬ中のトリグリセリドのみを測定する方法（特許文献２）が知られている。
しかし、これらの方法は、ＶＬＤＬ中のトリグリセリドやＣＭ中のトリグリセリドが高い検体においては第１工程で除去しきれず第２工程に反応が持ち越され正の影響を受けることがある。あるいは、これらの方法は、第２工程で反応が抑制されているはずのＶＬＤＬ中トリグリセリドが抑制しきれずに反応が一部促進されることで正の影響を受けることがある。実際、これらの方法と基準法である超遠心法とを多数の検体で比較すると、正の相関性があることは判るが、大きく乖離する検体が見られたり、ばらつきが大きいなど、検体に対する特異性、精密性において大きな問題があることが判る。
特開２００６−１８０７０７号公報 再公表２０００−０４３５３７号公報
このことから、本発明が解決しようとする課題は、遠心分離、電気泳動等の煩雑な前処理操作なしに試料を直接、自動分析装置等を用いて、簡便性、特異性、精密性に優れたＬＤＬ−ＴＧの分別定量測定する方法を提供することを可能にするために、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のトリグリセリドを選択的に消去する方法を提供することにある。
本願発明者は、ある種の界面活性剤とリポプロテインリパーゼを組み合わせて試料に作用させることにより、試料中のＬＤＬ以外のリポ蛋白であるＣＭ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＨＤＬ中のトリグリセライドとが多少の反応を起こして解体し、これらのリポ蛋白中のトリグリセリドが分解されることを見出した。本発明者は、さらに選択性、特異性を向上することでＬＤＬ以外のリポ蛋白中のトリグリセリドを極限まで分解し、後に続く工程で残存するＬＤＬと反応する界面活性剤を添加することでＬＤＬを解体し、ＬＤＬ中のトリグリセリドをリポプロテインリパーゼの作用により分解、生成した過酸化水素を定量することにより、ＬＤＬ中のトリグリセリドを定量し得ると考えた。そこでさらに検討を進め、コレステロールエステラーゼを加えることで、極めて選択的、特異的に試料中のＣＭ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＨＤＬを解体し、これらＬＤＬ以外のリポ蛋白分画中のトリグリセライドが分解できることを見出した。これに、反応の結果生じるトリグリセリドの分解産物である過酸化水素が後に続く工程で検出されてしまうのを抑えるために、過酸化水素を消去する反応系を組み込むことにより、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のトリグリセリドを選択的に消去することに成功し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤又はＬＤＬの保護作用を有する界面活性剤の存在下で、試料に、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、グリセロールキナーゼおよびグリセロール３リン酸オキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することを含む、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のトリグリセリドの消去方法であって、前記界面活性剤は、ＨＬＢ値が１３以上１５以下であるポリオキシアルキレン誘導体である、方法を提供する。
本発明の方法によれば、ＬＤＬ以外のリポ蛋白中のトリグリセリドを、遠心操作等煩雑な処理を行うことなく、簡便に消去することができる。
超遠心法によるＬＤＬ中のトリグリセリドの定量値と、下記比較例２の方法によるＬＤＬ中のトリグリセリドの定量値との相関関係を示す図である。 超遠心法によるＬＤＬ中のトリグリセリドの定量値と、下記実施例５の方法によるＬＤＬ中のトリグリセリドの定量値との相関関係を示す図である。 超遠心法によるＬＤＬ中のトリグリセリドの定量値と、下記実施例６の方法によるＬＤＬ中のトリグリセリドの定量値との相関関係を示す図である。 超遠心法によるＬＤＬ中のトリグリセリドの定量値と、下記実施例７の方法によるＬＤＬ中のトリグリセリドの定量値との相関関係を示す図である。 超遠心法によるＬＤＬ中のトリグリセリドの定量値と、下記比較例３の方法によるＬＤＬ中のトリグリセリドの定量値との相関関係を示す図である。 超遠心法によるＬＤＬ中のトリグリセリドの定量値と、下記実施例８の方法によるＬＤＬ中のトリグリセリドの定量値との相関関係を示す図である。 超遠心法によるＬＤＬ中のトリグリセリドの定量値と、下記実施例９の方法によるＬＤＬ中のトリグリセリドの定量値との相関関係を示す図である。 超遠心法によるＬＤＬ中のトリグリセリドの定量値と、下記実施例１０の方法によるＬＤＬ中のトリグリセリドの定量値との相関関係を示す図である。
本発明の方法は、下記の方法により試料中のＬＤＬ以外のリポ蛋白中のトリグリセリドを消去する。ＬＤＬ以外のリポ蛋白にはＣＭ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬおよびＨＤＬがある。ＣＭ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬおよびＨＤＬ中のトリグリセリドが消去されるので、後に続く工程でリポ蛋白を分解し、トリグリセリドを定量すれば、そのトリグリセリドは、主として試料中のＬＤＬ中のトリグリセリドである。
本発明の方法に供される試料としては、ＣＭ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬ等のリポ蛋白を含むかもしれない試料であればいずれのものでもよく、例えば、血液、血清、血漿等の体液やその希釈物を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明における上記「トリグリセリドを消去」とは、トリグリセリドを分解し、かつ、その分解産物が後に続く工程で検出されないようにすることを意味する。ＬＤＬ以外のリポ蛋白、すなわち、ＣＭ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬおよびＨＤＬ等に含まれるトリグリセリドを選択的に消去する方法としては、以下の方法により行う。
すなわち、ＬＤＬ以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤、もしくはＬＤＬの保護作用を有する界面活性剤の存在下において、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、グリセロールキナーゼおよびグリセロール３リン酸オキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去する。
過酸化水素を消去する方法としては、カタラーゼを作用させて水と酸素に分解する方法、およびペルオキシダーゼを用いてフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物と過酸化水素を反応させて無色キノンに転化する方法を挙げることができるが、いずれの方法を用いてもよく、さらにこれらの方法に限定されるものではない。これらの過酸化水素の消去方法自体はこの分野において周知である。
反応液中のリポプロテインリパーゼ濃度は０．０１〜２０００ＫＵ／Ｌ程度が好ましく、０．０５〜１０００ＫＵ／Ｌ程度がさらに好ましい。グリセロールキナーゼの濃度は０．０２〜 ８０．０ＫＵ／Ｌ程度が好ましく、０．０５〜４０．０ＫＵ／Ｌ程度がさらに好ましい。グリセロール３リン酸オキシダーゼの濃度は０．２〜２０．０ＫＵ／Ｌ程度が好ましく、０．５〜１０．０ＫＵ／Ｌ程度がさらに好ましい。さらに、過酸化水素を水と酸素に分解する場合のカタラーゼの濃度は４０〜５０００ＫＵ／Ｌ程度が好ましく、５０〜２０００ＫＵ／Ｌ程度がさらに好ましい。
また、反応液中の過酸化水素を無色キノンへ転化する場合のペルオキシダーゼの濃度は１〜４０ＫＵ／Ｌが好ましく、２〜３０ＫＵ／Ｌがさらに好ましい。この際に添加するフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物の濃度としては０．２〜３ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
本発明の方法で用いられるコレステロールエステラーゼの好ましい例として、分子量が５０ｋＤａ以下のコレステロールエステラーゼ、もしくは分子量が５０ｋＤａ以上のコレステロールエステラーゼであっても分子量が５０ｋＤａ以下のサブユニットをもつコレステロールエステラーゼを挙げることができる。また、コレステロールエステラーゼの起源はなんら限定されるものではなく、いずれの動物由来、微生物由来であってもよく、特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来のコレステロールエステラーゼを好適に用いることができる。
本発明の方法で用いられる上記コレステロールエステラーゼ濃度は、１０〜８０００Ｕ／Ｌ程度が好ましく、５０〜４０００Ｕ／Ｌ程度がさらに好ましい。
本発明の方法で用いられる、ＬＤＬ以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤、もしくはＬＤＬの保護作用を有する界面活性剤の好ましい例として、ＨＬＢ値が１３以上１５以下であるポリオキシアルキレン誘導体を挙げることができる。誘導体の例としては、高級アルコール縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミド縮合物、高級アルキルアミン縮合物、高級アルキルメルカプタン縮合物、アルキルフェノール縮合物を挙げることができる。
ＨＬＢ値が１３以上１５以下のポリオキシアルキレン誘導体の好ましい具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンベンジルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
また、本発明の方法で用いられる界面活性剤として、陽イオン界面活性剤を用いることもできる。ここで用いられる陽イオン界面活性剤の例としては、第４級アンモニウム塩を親水基として有するものを挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、これらの界面活性剤は、１種類のものを単独で用いることもできるし、２種類以上のものを組み合わせて用いることもできる。
用いられる上記界面活性剤の濃度は、０．０１〜２０ｇ／Ｌ程度が好ましく、０．１〜１０ｇ／Ｌ程度がさらに好ましい。
本発明の方法は、ｐＨ５〜９の緩衝液中で行うことが好ましく、緩衝液としてはトリス、トリエタノールアミン、グットの緩衝液等のアミンを含む緩衝液が好ましい。特にグット緩衝液であるＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳおよびＰＯＰＳＯが好ましく、緩衝液の濃度は５〜５０００ｍＭ程度が好ましく、１０〜１０００ｍＭ程度がさらに好ましい。
本発明の方法では、ＬＤＬとの反応を抑えて他のリポ蛋白の消去をさらに高めるために、もしくは反応液中の酵素類の活性作用を補強、安定化させるために、反応液中に２価の金属イオンを含ませてもよい。２価の金属イオンとしては銅イオン、鉄イオン、カルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを使用することができるが、特にマグネシウムイオンが好ましい。２価の金属イオンの濃度は１〜５００ｍＭ程度が好ましく、５〜２００ｍＭ程度がさらに好ましい。
反応温度は、たとえば１５〜５５℃で、２５〜４５℃程度が適当であり、３７℃が最も好ましい。また、反応時間は１〜３０分間程度でよく、更に好ましくは２〜１５分間程度である。
本発明の方法では、反応の結果生じる残骸物がＬＤＬとの反応に干渉することを防止するために、アルブミンを加えても良い。アルブミンの存在下で行うことにより、反応の結果生じる残骸物がアルブミンに吸着され、後に続く工程でこれらの残骸が反応に干渉することを防止できる。アルブミンは、アルブミンであればなんら限定されるものではなく、血清アルブミン等の市販のアルブミンを好適に用いることができる。また、アルブミンの起源もなんら限定されるものではなく、ヒト、ウシ、ブタ、ウマ等いずれの動物であってもよく、特に、広く用いられているウシ血清アルブミンを好適に用いることができる。反応溶液中の前記アルブミンの濃度は０．０１〜３０.０ ｇ／Ｌが好ましく、０．３〜２０．０ｇ／Ｌがさらに好ましい。
本発明の方法において、界面活性剤、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、グリセロールキナーゼおよびグリセロール３リン酸オキシダーゼからなるＬＤＬ以外のリポ蛋白に作用しこれらのリポ蛋白を分解する酵素、ならびにカタラーゼ等の過酸化水素を消去するための酵素は同時に添加してもよいし、また別々に添加してもよい。好適には、これらの試薬の総てを含む試薬を調製しておき、試料と混合するとよい。
上記した本発明の方法により、ＬＤＬ以外のリポ蛋白中のトリグリセリドが選択的に消去されるので、後に続く工程でリポ蛋白を分解し、トリグリセリドを定量することにより、ＬＤＬ中のトリグリセリドを定量することができる。
これは、例えば、少なくともＬＤＬに作用する界面活性剤を加え、本発明の方法を実施した後の反応系に残っているリポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼおよびグリセロール３リン酸オキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量することにより行なうことができる。また、これらの定量に必要な酵素類は、本発明の方法において加え反応系に残っている以外に更に追加で添加してもよい。また、これらの反応に関与する酵素類は、本発明の方法においても、後に続く工程においても１種類に限定されるものではなく、２種類以上の酵素を組み合わせて用いることもできる。
この後に続く工程において、少なくともＬＤＬに作用する界面活性剤は、ＬＤＬのみに選択的に作用する界面活性剤でもよいし、全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤であってもよい。
全てのリポ蛋白に作用する界面活性剤の好ましい例として、ＨＬＢ値が１１以上、好ましくは１２以上のポリオキシアルキレン誘導体を挙げることができる。誘導体の例としては高級アルコール縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪酸アミド縮合物、高級アルキルアミン縮合物、高級アルキルメルカプタン縮合物、アルキルフェノール縮合物を挙げることができる。
ＨＬＢ値が１１以上のポリオキシアルキレン誘導体の好ましい具体例として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ＨＬＢ値１３未満のポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
また、ＬＤＬのみに選択的に作用する界面活性剤の例としては、陰イオン界面活性剤や、カルボキシベタイン系の両性界面活性剤等を挙げることができる。ここで用いられる陰イオン界面活性剤としては、芳香環に炭素数４〜１８の直鎖状または分枝状アルキル基が結合したものを有するもの、芳香環はベンゼン、ナフタレン、ジフェニール等、炭素と水素のみからなるもの、さらに上記芳香環にスルホン酸塩のような親水基が結合したものを挙げられるが、これらに限定されるものではない。
後に続く工程で用いられる界面活性剤の濃度は、０．１〜１００ｇ／Ｌ程度が好ましく、さらに好ましくは１〜５０ｇ／Ｌ程度である。また、界面活性剤は、１種類のものを単独で用いることもできるし、２種類以上のものを組み合わせて用いることもできる。
後に続く工程におけるその他の好ましい反応条件は、第１工程における好ましい反応条件と同様である。
生じた過酸化水素の定量は、常法により行うことができ、例えば、過酸化水素存在下でペルオキシダーゼの作用により４−アミノアンチピリンとフェノール系又はアニリン系水素供与体化合物とを酸化縮合させ、生じた色素を定量すればよい。フェノール系又はアニリン系水素供与体化合物としては、例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）等が挙げられる。
以下、本発明の実施例に基づき具体的に説明する。もっとも本発明は、下記実施例に限定されるものではない。
比較例１
以下の組成からなるＬＤＬ−ＴＧ定量試薬を調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤*1 ２．０ｇ／Ｌ
ウシ血清アルブミン ３．０ｇ／Ｌ
トリンダー試薬（ＴＯＯＳ） ０．５ｇ／Ｌ
塩化マグネシウム ４．０ｇ／Ｌ
グリセロールキナーゼ ３．０ＫＵ／Ｌ
グリセロール３リン酸オキシダーゼ ７．５ＫＵ／Ｌ
リポプロテインリパーゼ １００ＫＵ／Ｌ
カタラーゼ １０００ＫＵ／Ｌ
*1: ポリオキシアルキレン誘導体(ＨＬＢ値１３．２）
第二試薬（試薬ａ）
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤*2 ６．０ ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
リポプロテインリパーゼ ５．０ＫＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ５．０ＫＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．０５％
*2: ポリオキシエチレンアルキルエーテル(ＨＬＢ値１３．３）
実施例１
以下の組成からなるＬＤＬ−ＴＧ定量試薬を調製した。
第一試薬（試薬Ｂ）
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤*3 ２．０ｇ／Ｌ
ウシ血清アルブミン ３．０ｇ／Ｌ
トリンダー試薬（ＴＯＯＳ） ０．５ｇ／Ｌ
塩化マグネシウム ４．０ｇ／Ｌ
グリセロールキナーゼ ２．０ＫＵ／Ｌ
グリセロール３リン酸オキシダーゼ ７．５ＫＵ／Ｌ
リポプロテインリパーゼ １００ＫＵ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ#1 ０．６ＫＵ／Ｌ
カタラーゼ １０００ＫＵ／Ｌ
*3: ポリオキシアルキレン誘導体(ＨＬＢ値１３．２)
#1: 約３０ｋＤａ(Ｐｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来)
第二試薬（試薬ａ）
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤*4 ６．０ ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
リポプロテインリパーゼ ５．０ＫＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ５．０ＫＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．０５％
*4: ポリオキシエチレンアルキルエーテル(ＨＬＢ値１３．３）
実施例２
以下の組成からなるＬＤＬ−ＴＧ定量試薬を調製した。
第一試薬（試薬Ｃ）
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤*5 ２．０ｇ／Ｌ
ウシ血清アルブミン ３．０ｇ／Ｌ
トリンダー試薬（ＴＯＯＳ） ０．５ｇ／Ｌ
塩化マグネシウム ４．０ｇ／Ｌ
グリセロールキナーゼ １．０ＫＵ／Ｌ
グリセロール３リン酸オキシダーゼ ４．０ＫＵ／Ｌ
リポプロテインリパーゼ ０．３ＫＵ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ#2 ０．７ＫＵ／Ｌ
カタラーゼ １０００ＫＵ／Ｌ
*5: ポリオキシアルキレン誘導体(ＨＬＢ値１３．２)
#2: 約３０ｋＤａ(Ｐｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来)
第二試薬（試薬ｂ）
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤*6 ６．０ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
リポプロテインリパーゼ ４００ＫＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ５．０ＫＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．０５％
*6: ポリオキシエチレンアルキルエーテル(ＨＬＢ値１２．４）
実施例３
評価に用いる試料としては、たとえば超遠心法を用いて、ＣＭ、ＶＬＤＬを一括して回収した分画（比重０．９６未満〜１．００６）、もしくはＣＭ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬを一括して回収した分画（比重０．９６未満〜１．０１９）、ＬＤＬ分画（比重１．０１９〜１．０６３）、ＨＤＬ分画（比重１．０６３〜１．２１０）、を分取し、試料とする。これら分画試料それぞれの総トリグリセリド量を測定し、上記実施例試薬を用いて定量したトリグリセリド量と比較した。なお、超遠心法は「新生化学実験法講座４ 脂質I 中性脂肪とリポタンパク質」、（株）東京化学同人出版に記載されている方法に従い実施した。
比較例１、実施例１および実施例２の試薬は以下のように操作した。検体を２μＬ採取し、第一試薬１９５μＬと混和、３７℃で５分間加温して反応を行い、反応５分後の反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。次いでこの反応液に第二試薬６５μＬを混和し、更に３７℃で５分間加温して反応を行い、反応５分後の反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。これら測定した吸光度のＥ２からＥ１を差し引くことで吸光度変化量（ΔＥ）を算出した。このとき、検体が各リポ蛋白分画試料であった場合の吸光度変化量から、検体が各リポ蛋白分画試料の代わりとして生理食塩水等であった場合の吸光度変化量を差し引くことで、本実施例の試薬を用いた各リポ蛋白分画試料における反応吸光度を算出することができる。またこのとき、比較例１または実施例１の第二試薬（試薬ａ）と実施例２（試薬ｂ）の第二試薬を入れ替えて使用してもなんら問題なく、検体を測定することができる。
この他、本実施例の試薬の代わりに、同等の呈色を示す総トリグリセリド測定試薬を用いて同様の操作を行った。それにより算出された反応吸光度は、各リポ蛋白分画試料の総トリグリセリド量であり、前述の本実施例の試薬を用いた各リポ蛋白分画試料における反応吸光度と比較することで、それぞれの試料における本実施例の試薬の反応率を算出することができる。ここで言う「総トリグリセリド量の反応吸光度と実施例の試薬を用いた反応吸光度と比較する」とは、たとえば、実施例の試薬を用いた反応吸光度を総トリグリセリド量の反応吸光度で除することを意味する。なお、同等の呈色を示す総トリグリセリド測定試薬とは、たとえば、ＴＧ−ＥＸ「生研」（酵素法）（トリグリセライドキット）などがある。
これにより、算出した反応率を表にまとめたものを、以下に示す。
Figure 0006240065
実施例１および実施例２では、ＬＤＬ分画で特異的に反応しており、ＣＭ分画、ＶＬＤＬ分画、ＩＤＬ分画、およびＨＤＬ分画とＬＤＬ分画との差別化が出来ていることが確認できる。比較例１では、ＣＭ分画、ＶＬＤＬ分画、ＩＤＬ分画におけるトリグリセリドの消去がなされていない、もしくは反応が抑制されていない。また比較例１では、ＨＤＬ分画においては消去がなされている、もしくは反応が抑制されているが、実施例１、実施例２ではより良好な特異性結果であることが確認できる。なお、これら分画の総トリグリセリド量は、ＣＭ・ＶＬＤＬ分画もしくはＣＭ・ＶＬＤＬ・ＩＤＬ分画においてはおおよそ４５０〜９５０ｍｇ／ｄＬであり、ＬＤＬ分画においてはおおよそ５０〜２２０ｍｇ／ｄＬであり、ＨＤＬ分画においてはおおよそ３５〜８０ｍｇ／ｄＬである。
つぎに、超遠心法および、本発明の試薬を用いて、新鮮ヒト血清を検体として各検体中のＬＤＬ−ＴＧを定量した。
実施例４
（１）超遠心法によるＬＤＬ−ＴＧの定量測定
超遠心法は、常法（「新生化学実験法講座４ 脂質I 中性脂肪とリポタンパク質」、（株）東京化学同人出版に記載されている方法）に従い、比重１．０１９〜１．０６３のＬＤＬ分画を遠心分離し、得られたＬＤＬ分画中のトリグリセリド量を、ＴＧ−ＥＸ「生研」（酵素法）（デンカ生研社製）を用いて測定した。
比較例２
ヒト血清を検体として、上記比較例１と同様の組成からなる、試薬Ａおよび試薬ａの組み合わせの試薬を用いて、以下のように操作した。
（２）本発明の試薬を用いたＬＤＬ−ＴＧの定量測定
検体を２μＬ採取し、第一試薬１９５μＬと混和、３７℃で５分間加温して反応を行い、反応５分後の反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。次いでこの反応液に第二試薬６５μＬを混和し、更に３７℃で５分間加温して反応を行い、反応５分後の反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。これら測定した吸光度のＥ２からＥ１を差し引くことで吸光度変化量（ΔＥ）を算出した。このとき、検体がヒト血清であった場合の吸光度変化量から、検体がヒト血清の代わりとして生理食塩水等であった場合の吸光度変化量を差し引くことで、本実施例の試薬を用いたヒト血清試料における反応吸光度を算出した。
（３）検量線の作成
超遠心法による測定により、ＬＤＬ−ＴＧ濃度が判明している新鮮ヒト血清数検体を標準品として検量線を作成し、（２）で算出した反応吸光度をｍｇ／ｄＬ測定値に換算した。
実施例５
ヒト血清−０１からヒト血清−１４を検体として、上記実施例１と同様の組成からなる、試薬Ｂおよび試薬ａの組み合わせの試薬を用いて、上述（２）（３）に記載したものと同様の操作を行った。
実施例６
ヒト血清−０１からヒト血清−１４を検体として、上記実施例２と同様の組成からなる、試薬Ｃおよび試薬ｂの組み合わせの試薬を用いて、上述（２）（３）に記載したものと同様の操作を行った。
実施例７
以下の組成からなるＬＤＬ−ＴＧ定量試薬を調製した。
第一試薬（試薬Ｄ）
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤*7 ２．５ｇ／Ｌ
ウシ血清アルブミン ３．０ｇ／Ｌ
トリンダー試薬（ＴＯＯＳ） ０．５ｇ／Ｌ
塩化マグネシウム ４．０ｇ／Ｌ
グリセロールキナーゼ １．０ＫＵ／Ｌ
グリセロール３リン酸オキシダーゼ ４．０ＫＵ／Ｌ
リポプロテインリパーゼ １００ＫＵ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ#3 ６．０ＫＵ／Ｌ
カタラーゼ １０００ＫＵ／Ｌ
*7: ポリオキシアルキレン誘導体(ＨＬＢ値１３．２)
#3: 分子量不明（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ由来．メーカー公称）
第二試薬（試薬ｃ）
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤*8 ６．０ ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
リポプロテインリパーゼ ４００ＫＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ５．０ＫＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．０５％
*8: ポリオキシエチレンアルキルエーテル(ＨＬＢ値１２．４)
ヒト血清−０１からヒト血清−１４を検体として、試薬Ｄおよび試薬ｃの組み合わせの試薬を用いて、上述（２）（３）に記載したものと同様の操作を行った。
ヒト血清−０１からヒト血清−１４のヒト血清１４検体について、上記（１）により算出した、実施例４の超遠心法ＬＤＬ−ＴＧ測定値（ｍｇ／ｄＬ）と、上記（２）（３）により算出した比較例２、実施例５、実施例６、および実施例７のＬＤＬ−ＴＧ測定値（ｍｇ／ｄＬ）および相関グラフを、以下表２、および図１、図２、図３、図４に示す。
Figure 0006240065
実施例４との相関性について、比較例２では相関係数の二乗が０．４８１であるのに対して、実施例５では相関係数の二乗は０．９７０、実施例６では０．９７７、実施例７では０．８５６である。
本発明の実施例によれば、正確な測定が可能であることが知られている実施例４の超遠心法との相関性が比較例２と比べて明らかに高いことがわかる。
比較例３
以下の組成からなるＬＤＬ−ＴＧ定量試薬を調製した。
第一試薬（試薬Ａ）
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤*9 ２．０ｇ／Ｌ
ウシ血清アルブミン ３．０ｇ／Ｌ
トリンダー試薬（ＴＯＯＳ） ０．５ｇ／Ｌ
塩化マグネシウム ４．０ｇ／Ｌ
グリセロールキナーゼ ３．０ＫＵ／Ｌ
グリセロール３リン酸オキシダーゼ ７．５ＫＵ／Ｌ
リポプロテインリパーゼ １００ＫＵ／Ｌ
カタラーゼ １０００ＫＵ／Ｌ
*9: ポリオキシアルキレン誘導体(ＨＬＢ値１３．２)
第二試薬（試薬ｄ）
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤*10 ６．０ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０．０ＫＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．０５％
*10: ポリオキシエチレンアルキルエーテル(ＨＬＢ値１３．３)
ヒト血清−１５からヒト血清−３０を検体として、試薬Ａおよび試薬ｄの組み合わせの試薬を用いて、上述（２）（３）に記載したものと同様の操作を行った。
実施例８
以下の組成からなるＬＤＬ−ＴＧ定量試薬を調製した。
第一試薬（試薬Ｆ）
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤*11 ２．０ｇ／Ｌ
ウシ血清アルブミン １０．０ｇ／Ｌ
トリンダー試薬（ＴＯＯＳ） ０．５ｇ／Ｌ
塩化マグネシウム １．５ｇ／Ｌ
グリセロールキナーゼ １．０ＫＵ／Ｌ
グリセロール３リン酸オキシダーゼ ４．０ＫＵ／Ｌ
リポプロテインリパーゼ １００ＫＵ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ#4 ０．７ＫＵ／Ｌ
カタラーゼ １０００ＫＵ／Ｌ
*11: ポリオキシアルキレン誘導体(ＨＬＢ値１３．２)
#4: 約３０ｋＤａ(Ｐｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来)
第二試薬（試薬ｄ）
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤*12 ６．０ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０．０ＫＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．０５％
*12: ポリオキシエチレンアルキルエーテル(ＨＬＢ値１３．３)
ヒト血清−１５からヒト血清−３０を検体として、試薬Ｆおよび試薬ｄの組み合わせの試薬を用いて、上述（２）（３）に記載したものと同様の操作を行った。
実施例９
以下の組成からなるＬＤＬ−ＴＧ定量試薬を調製した。
第一試薬（試薬Ｇ）
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤*13 １．５ｇ／Ｌ
ウシ血清アルブミン １０．０ｇ／Ｌ
トリンダー試薬（ＴＯＯＳ） ０．５ｇ／Ｌ
塩化マグネシウム １．５ｇ／Ｌ
グリセロールキナーゼ １．０ＫＵ／Ｌ
グリセロール３リン酸オキシダーゼ ４．０ＫＵ／Ｌ
リポプロテインリパーゼ １００ＫＵ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ#5 １．５ＫＵ／Ｌ
カタラーゼ １０００ＫＵ／Ｌ
*13: ポリオキシアルキレン誘導体(ＨＬＢ値１３．２)
#5: 約３００ｋＤａ(Ｐｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来．メーカー公称)（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて約６０ｋＤａ、約３０ｋＤａのバンドを確認）
第二試薬（試薬ｄ）
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤*14 ６．０ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０．０ＫＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．０５％
*14: ポリオキシエチレンアルキルエーテル(ＨＬＢ値１３．３)
ヒト血清−１５からヒト血清−３０を検体として、試薬Ｇおよび試薬ｄの組み合わせの試薬を用いて、上述（２）（３）に記載したものと同様の操作を行った。
実施例１０
以下の組成からなるＬＤＬ−ＴＧ定量試薬を調製した。
第一試薬（試薬Ｈ）
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤*15 １．５ｇ／Ｌ
ウシ血清アルブミン １０．０ｇ／Ｌ
トリンダー試薬（ＴＯＯＳ） ０．５ｇ／Ｌ
塩化マグネシウム １．５ｇ／Ｌ
グリセロールキナーゼ １．０ＫＵ／Ｌ
グリセロール３リン酸オキシダーゼ ４．０ＫＵ／Ｌ
リポプロテインリパーゼ １００ＫＵ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ#6 １．５ＫＵ／Ｌ
カタラーゼ １０００ＫＵ／Ｌ
*15: ポリオキシアルキレン誘導体(ＨＬＢ値１３．２)
#6: 分子量不明(Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ由来．メーカー公称)（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて約７０ｋＤａ、約３０ｋＤａのバンドを確認）
第二試薬（試薬ｄ）
ＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０） ５０ｍｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤*16 ６．０ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ １０．０ＫＵ／Ｌ
アジ化ナトリウム ０．０５％
*16: ポリオキシエチレンアルキルエーテル(ＨＬＢ値１３．３)
ヒト血清−１５からヒト血清−３０を検体として、試薬Ｈおよび試薬ｄの組み合わせの試薬を用いて、上述（２）（３）に記載したものと同様の操作を行った。
ヒト血清−１５からヒト血清−３０のヒト血清１６検体について、上記（１）により算出した、対照例の超遠心法ＬＤＬ−ＴＧ測定値（ｍｇ／ｄＬ）と、上記（２）（３）により算出した比較例３、実施例８、実施例９、実施例１０のＬＤＬ−ＴＧ測定値（ｍｇ／ｄＬ）および相関グラフを、以下表３、および図５、図６、図７、図８に示す。
Figure 0006240065
実施例４との相関性について、比較例３では相関係数の二乗が０．０３１であるのに対して、実施例８では相関係数の二乗は０．９３６、実施例９では０．８８３、実施例１０では０．８８７である。
本発明の実施例によれば、正確な測定が可能であることが知られている実施例４の超遠心法との相関性が比較例３と比べて明らかに高いことがわかる。

Claims (2)

  1. 低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白に作用する界面活性剤又はＬＤＬの保護作用を有する界面活性剤の存在下で、試料に、リポプロテインリパーゼ、コレステロールエステラーゼ、グリセロールキナーゼおよびグリセロール３リン酸オキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を消去することを含む、低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のトリグリセリドの消去方法であって、前記界面活性剤は、ＨＬＢ値が１３以上１５以下であるポリオキシアルキレン誘導体である、方法。
  2. 前記ポリオキシアルキレン誘導体は、ＨＬＢ値が１３以上１５以下のポリオキシアルキレン多環フェニルエーテルである請求項１記載の方法。
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