CN104583419A - 低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的甘油三酯的除去方法 - Google Patents

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Abstract

为了能够提供不用进行离心分离、电泳等繁杂的前处理操作，而是直接使用自动分析装置等对样品进行简便性、特异性、精密性优异的LDL-TG的分别定量测定的方法，本发明公开了选择性地除去低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的甘油三酯的方法。低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的甘油三酯的除去方法，该方法包括：在与低密度脂蛋白以外的脂蛋白发生作用的表面活性剂或具有LDL保护作用的表面活性剂的存在下，使脂蛋白脂肪酶、胆固醇酯酶、甘油激酶和甘油-3-磷酸氧化酶与样品发生作用，除去所产生的过氧化氢。

Description

低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的甘油三酯的除去方法
技术领域
本发明涉及样品中的低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的甘油三酯的除去方法。
背景技术
血清、血浆中的脂质的主要成分是胆固醇、甘油三酯、磷脂等，这些血中脂质与脱辅基蛋白结合，作为脂蛋白在血液中循环。根据这些脂蛋白的密度差，将它们分为乳糜微粒(以下称作CM)、超低密度脂蛋白(以下称作VLDL)、中密度脂蛋白(以下称作IDL)、低密度脂蛋白(以下称作LDL)、高密度脂蛋白(以下称作HDL)等。在这些脂蛋白中，HDL具有向肝脏搬运沉积在组织中的过剩的胆固醇的作用，具有抗动脉硬化作用。另外，LDL是胆固醇从肝脏到各组织的主要搬运体，认为LDL的增加与动脉硬化的发生密切相关。由此认为：LDL中的胆固醇(以下称作LDL-C)是动脉硬化、缺血性心脏疾病(冠状动脉疾病)等的危险因子，了解LDL-C的含量，这在上述疾病的诊断、治疗和预防中被当作重要的指标。另一方面，还确认到了许多即使血液中的LDL-C处于正常范围也发生缺血性心脏疾病等的病例，最近，人们开始关注LDL颗粒的质的变化或胆固醇以外的构成成分。
据报道，含有大量甘油三酯的LDL(以下称作富含TG的LDL)与胆固醇的含量高的正常LDL是性状不同的脂蛋白，其在肝病患者血液中多见，随着肝病的进行，其在血液中的浓度增加，在肝病末期占血液中所存在的脂蛋白的大部分。另外，富含TG的LDL将巨噬细胞泡沫化，根据由该富含TG的LDL引起的巨噬细胞泡沫化率与作为氧化LDL之一的丙二醛修饰LDL的血清中浓度成正比、以及在健康人血液中几乎检测不到过氧化甘油三酯而在肝病患者血液中发现过氧化甘油三酯显著增加等报道，认为LDL中的甘油三酯与氧化LDL密切相关。即，认为LDL中的甘油三酯量是与肝病、或氧化LDL参与的各种动脉硬化、冠状动脉疾病等有关的重要指标。
作为LDL中的甘油三酯(以下称作LDL-TG)的定量方法，有将分馏分离和甘油三酯定量这两个阶段的操作组合来进行计算的方法。分馏分离操作有采用超离心法、电泳法、高效液相色谱法(HPLC)的方法等，作为定量方法，例如有使用临床检查时使用的自动分析装置，通过甘油三酯测定用试剂进行定量的方法等。虽然将这两者组合可以进行LDL-TG的定量，但这些方法是按照完全分离LDL和LDL以外的脂蛋白的前处理步骤和进行测定的步骤这两个阶段来进行的，所以操作繁杂，耗费时间。另外，根据分离方法，已分离的样品本身难以回收、或者难以定量地回收、或者即使是可以定量地回收的方法也要求操作熟练、或者需要特别的仪器。这些方法的费用也高，在简便性或经济性方面难以普及。
在解决这些问题的方法中，作为不用进行分馏操作使用自动分析装置等即可以进行测定的方法，已知有下述方法：通过第1步骤除去LDL以外的所有脂蛋白中的甘油三酯后，通过第2步骤测定残留的LDL中的甘油三酯的方法(专利文献1)；或者通过第1步骤除去(游离型甘油和)HDL中的甘油三酯后，通过第2步骤只测定LDL中的甘油三酯的方法(专利文献2)。
但是，在VLDL中的甘油三酯或CM中的甘油三酯高的样本中，有时甘油三酯通过第1步骤没有除净而在第2步骤中留待继续完成反应，使这些方法受到正面影响(正の影響)。或者，在第2步骤中反应应该受到抑制的VLDL中甘油三酯有时没有完全被抑制而是部分促进反应，由此使这些方法受到正面影响(正の影響)。实际上，通过多个样本比较这些方法和作为基准法的超离心法时，虽然判断具有正相关性，但却发现了大幅背离的样本，或者判断为偏差大等在对于样本的特异性、精密性方面存在大的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2006-180707号公报；
专利文献2：日本再公表2000-043537号公报。
发明内容
发明所要解决的课题
由此可知：为了能够提供不用进行离心分离、电泳等繁杂的前处理操作，而是直接使用自动分析装置等对样品进行简便性、特异性、精密性优异的LDL-TG的分别定量测定的方法，本发明所要解决的课题在于提供选择性地除去低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的甘油三酯的方法。
用于解决课题的手段
本申请发明人发现：通过将某种表面活性剂和脂蛋白脂肪酶组合与样品发生作用，与样品中的LDL以外的脂蛋白即CM、VLDL、IDL、HDL中的甘油三酯发生一些反应而解体，这些脂蛋白中的甘油三酯被分解。本发明人认为：通过进一步提高选择性、特异性将LDL以外的脂蛋白中的甘油三酯分解至极限，并在后续步骤中添加与残留的LDL反应的表面活性剂使LDL解体，利用脂蛋白脂肪酶的作用分解LDL中的甘油三酯，再定量所生成的过氧化氢，从而能够定量LDL中的甘油三酯。于是，进一步进行研究发现了：通过加入胆固醇酯酶，极具选择性、特异性地将样品中的CM、VLDL、IDL、HDL解体，可以分解这些LDL以外的脂蛋白分馏中的甘油三酯。在其中加入除去过氧化氢的反应系统，以抑制在后续步骤中检测到反应的结果产生的甘油三酯的分解产物即过氧化氢，从而成功地选择性地除去了低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的甘油三酯，完成了本发明。
即，本发明提供低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的甘油三酯的除去方法，该方法包括：在与低密度脂蛋白以外的脂蛋白发生作用的表面活性剂或具有LDL保护作用的表面活性剂的存在下，使脂蛋白脂肪酶、胆固醇酯酶、甘油激酶和甘油-3-磷酸氧化酶与样品发生作用，除去所产生的过氧化氢。
发明效果
根据本发明的方法，不用进行离心操作等繁杂的处理，即可简便地除去LDL以外的脂蛋白中的甘油三酯。
附图说明
图1是显示通过超离心法得到的LDL中的甘油三酯的定量值与通过下述比较例2的方法得到的LDL中的甘油三酯的定量值的相关关系的图；
图2是显示通过超离心法得到的LDL中的甘油三酯的定量值与通过下述实施例5的方法得到的LDL中的甘油三酯的定量值的相关关系的图；
图3是显示通过超离心法得到的LDL中的甘油三酯的定量值与通过下述实施例6的方法得到的LDL中的甘油三酯的定量值的相关关系的图；
图4是显示通过超离心法得到的LDL中的甘油三酯的定量值与通过下述实施例7的方法得到的LDL中的甘油三酯的定量值的相关关系的图；
图5是显示通过超离心法得到的LDL中的甘油三酯的定量值与通过下述比较例3的方法得到的LDL中的甘油三酯的定量值的相关关系的图；
图6是显示通过超离心法得到的LDL中的甘油三酯的定量值与通过下述实施例8的方法得到的LDL中的甘油三酯的定量值的相关关系的图；
图7是显示通过超离心法得到的LDL中的甘油三酯的定量值与通过下述实施例9的方法得到的LDL中的甘油三酯的定量值的相关关系的图；
图8是显示通过超离心法得到的LDL中的甘油三酯的定量值与通过下述实施例10的方法得到的LDL中的甘油三酯的定量值的相关关系的图。
具体实施方式
本发明的方法是通过下述方法除去样品中的LDL以外的脂蛋白中的甘油三酯。LDL以外的脂蛋白有CM、VLDL、IDL和HDL。由于CM、VLDL、IDL和HDL中的甘油三酯被除去，所以通过后续步骤分解脂蛋白并定量甘油三酯时，该甘油三酯主要是样品中的LDL中的甘油三酯。
作为用于本发明的方法的样品，只要是可能含有CM、VLDL、IDL、LDL和HDL等脂蛋白的样品则均可使用，例如可以列举血液、血清、血浆等体液或其稀释物，但并不限于这些。
本发明中的上述“除去甘油三酯”是指，分解甘油三酯，并且在后续步骤中检测不到其分解产物。作为选择性地除去LDL以外的脂蛋白、即CM、VLDL、IDL和HDL等中所含的甘油三酯的方法，通过下述方法来进行。
即，在与LDL以外的脂蛋白发生作用的表面活性剂、或具有LDL保护作用的表面活性剂的存在下，使脂蛋白脂肪酶、胆固醇酯酶、甘油激酶和甘油-3-磷酸氧化酶发生作用，除去生成的过氧化氢。
作为除去过氧化氢的方法，可以列举：与过氧化氢酶发生作用以分解成水和氧的方法；以及使用过氧化物酶使酚系或苯胺系供氢体化合物与过氧化氢反应而转化成无色醌的方法，可以采用任一种方法，而且不限于这些方法。上述过氧化氢的除去方法本身在本领域众所周知。
反应液中的脂蛋白脂肪酶浓度优选0.01～2000KU/L左右，进一步优选0.05～1000KU/L左右。甘油激酶的浓度优选0.02～80.0KU/L左右，进一步优选0.05～40.0KU/L左右。甘油-3-磷酸氧化酶的浓度优选0.2～20.0KU/L左右，进一步优选0.5～10.0KU/L左右。而且，将过氧化氢分解成水和氧时的过氧化氢酶的浓度优选40～5000KU/L左右，进一步优选50～2000KU/L左右。
另外，将反应液中的过氧化氢转化成无色醌时的过氧化物酶的浓度优选1～40KU/L，进一步优选2～30KU/L。此时添加的酚系或苯胺系供氢体化合物的浓度优选0.2～3mmol/L。
作为本发明的方法中使用的胆固醇酯酶的优选例子，可以列举：分子量为50kDa以下的胆固醇酯酶、或者即使是分子量为50kDa以上的胆固醇酯酶但具有分子量为50kDa以下的亚单元的胆固醇酯酶。另外，对胆固醇酯酶的来源没有任何限定，可以来自任一种动物、来自微生物，特别是可以优选使用来自假单胞菌属的胆固醇酯酶。
本发明的方法中使用的上述胆固醇酯酶浓度优选10～8000U/L左右，进一步优选50～4000U/L左右。
作为本发明的方法中使用的、与LDL以外的脂蛋白发生作用的表面活性剂、或具有LDL保护作用的表面活性剂的优选例子，可以列举HLB值为13以上且15以下的聚氧化亚烷基衍生物。作为衍生物的例子，可以列举高级醇缩合物、高级脂肪酸缩合物、高级脂肪酸酰胺缩合物、高级烷基胺缩合物、高级烷基硫醇缩合物、烷基酚缩合物。
作为HLB值为13以上且15以下的聚氧化亚烷基衍生物的优选的具体例子，可以列举聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯鲸蜡醚、聚氧乙烯油醚、聚氧乙烯高级醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯苄基苯基醚、聚氧化亚烷基多环苯基醚等，但并不限于这些。
另外，作为本发明的方法中使用的表面活性剂，还可以使用阳离子表面活性剂。作为这里使用的阳离子表面活性剂的例子，可以列举具有季铵盐作为亲水基的表面活性剂，但并不限于此。另外，这些表面活性剂既可以单独使用一种，也可以将两种以上组合使用。
使用的上述表面活性剂的浓度优选0.01～20g/L左右，进一步优选0.1～10g/L左右。
本发明的方法优选在pH5～9的缓冲液中进行，作为缓冲液，优选Tris、三乙醇胺、Good’s缓冲液等含有胺的缓冲液。特别优选作为Good’s缓冲液的Bis-Tris、PIPES、MOPSO、BES、HEPES和POPSO，缓冲液的浓度优选5～5000mM左右，进一步优选10～1000mM左右。
在本发明的方法中，为了抑制与LDL的反应以进一步提高其他脂蛋白的除去、或者为了加强、稳定反应液中的酶类的活性作用，反应液中可以含有二价金属离子。作为二价金属离子，可以使用铜离子、铁离子、钙离子和镁离子，但特别优选镁离子。二价金属离子的浓度优选1～500mM左右，进一步优选5～200mM左右。
反应温度例如15～55℃、25～45℃左右是适合的，最优选37℃。另外，反应时间可以是1～30分钟左右，进一步优选为2～15分钟左右。
在本发明的方法中，为了防止反应的结果产生的残余物干涉与LDL的反应，可以加入白蛋白。通过在白蛋白的存在下进行反应，反应的结果产生的残余物吸附在白蛋白上，可以防止这些残余物在后续步骤中干涉反应。只要是白蛋白即可，对白蛋白没有任何限定，可以优选使用血清白蛋白等市售的白蛋白。另外，对白蛋白的来源也没有任何限定，可以来自人、牛、猪、马等任一种动物，特别是可以优选使用广泛使用的牛血清白蛋白。反应溶液中的上述白蛋白的浓度优选0.01～30.0g/L，进一步优选0.3～20.0g/L。
在本发明的方法中，表面活性剂、包括脂蛋白脂肪酶、胆固醇酯酶、甘油激酶和甘油-3-磷酸氧化酶的与LDL以外的脂蛋白作用并分解这些脂蛋白的酶、以及过氧化氢酶等用于除去过氧化氢的酶可以同时添加，也可以分别添加。优选事先制备一并含有这些试剂的试剂，再与样品混合即可。
利用上述本发明的方法，LDL以外的脂蛋白中的甘油三酯被选择性地除去，所以在后续步骤中通过分解脂蛋白、并定量甘油三酯，可以定量LDL中的甘油三酯。
这例如可以通过加入至少与LDL发生作用的表面活性剂，并定量通过实施本发明的方法后的反应系统中残留的脂蛋白脂肪酶、甘油激酶和甘油-3-磷酸氧化酶的作用生成的过氧化氢来进行。另外，这些定量所需的酶类除了在本发明的方法中加入而残留在反应系统中以外，还可以进一步追加添加。另外，无论是在本发明的方法中、还是在后续步骤中，参与这些反应的酶类都不限于一种，还可以将两种以上的酶组合使用。
在该后续步骤中，至少与LDL发生作用的表面活性剂可以是选择性地只与LDL发生作用的表面活性剂，也可以是与所有的脂蛋白发生作用的表面活性剂。
作为与所有的脂蛋白发生作用的表面活性剂的优选例子，可以列举HLB值为11以上、优选12以上的聚氧化亚烷基衍生物。作为衍生物的例子，可以列举高级醇缩合物、高级脂肪酸缩合物、高级脂肪酸酰胺缩合物、高级烷基胺缩合物、高级烷基硫醇缩合物、烷基酚缩合物。
作为HLB值为11以上的聚氧化亚烷基衍生物的优选的具体例子，可以列举聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯鲸蜡醚、聚氧乙烯油醚、聚氧乙烯高级醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯多环苯基醚、HLB值不足13的聚氧化亚烷基多环苯基醚等，但并不限于这些。
另外，作为选择性地只与LDL发生作用的表面活性剂的例子，可以列举阴离子表面活性剂、或羧基甜菜碱类两性表面活性剂等。作为这里使用的阴离子表面活性剂，可以列举：具有芳环上结合有碳原子数为4～18的直链状或支链状烷基的阴离子表面活性剂、芳环为苯、萘、联苯等由碳和氢构成的阴离子表面活性剂、以及上述芳环上结合有磺酸盐这样的亲水基的阴离子表面活性剂，但并不限于这些。
后续步骤中使用的表面活性剂的浓度优选0.1～100g/L左右，进一步优选为1～50g/L左右。另外，表面活性剂既可以单独使用一种，也可以将两种以上组合使用。
后续步骤中的其他优选的反应条件与第1步骤中的优选的反应条件相同。
生成的过氧化氢的定量可以通过常规方法来进行，例如，在过氧化氢的存在下，通过过氧化物酶的作用使4-氨基安替比林与酚系或苯胺系供氢体化合物进行氧化缩合，再定量生成的色素即可。作为酚系或苯胺系供氢体化合物，例如可以列举：N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)等。
以下，根据本发明的实施例来具体地进行说明。但本发明并不限于下述的实施例。
实施例
比较例1
制备由下述组成构成的LDL-TG定量试剂。
实施例1
制备由下述组成构成的LDL-TG定量试剂。
实施例2
制备由下述组成构成的LDL-TG定量试剂。
实施例3
作为用于评价的样品，例如采用超离心法，分离收集成批回收(一括して回収した)CM、VLDL的分馏(比重不足0.96～1.006)、或成批回收CM、VLDL、IDL的分馏(比重不足0.96～1.019)、LDL分馏(比重为1.019～1.063)、HDL分馏(比重为1.063～1.210)，作为样品。测定这些分馏样品各自的总甘油三酯量，与使用上述实施例试剂定量的甘油三酯量进行比较。需要说明的是，超离心法按照“新生化学实验法讲座4 脂质I　中性脂肪和脂蛋白(新生化学実験法講座4　脂質I　中性脂肪とリポタンパク質)”(株)东京化学同人出版中记载的方法实施。
比较例1、实施例1和实施例2的试剂如下操作。采集2μL样本，与195μL第一试剂混和，在37℃下加热5分钟进行反应，在主波长600nm、副波长700nm下测定反应5分钟后的反应液的吸光度(E1)。接着，在该反应液中混合65μL第二试剂，再于37℃下加热5分钟进行反应，在主波长600nm、副波长700nm下测定反应5分钟后的反应液的吸光度(E2)。通过从上述测定的吸光度E2中减去E1，算出吸光度变化量(ΔE)。此时，通过从样本为各脂蛋白分馏样品时的吸光度变化量中减去样本为生理盐水等以代替各脂蛋白分馏样品时的吸光度变化量，可以算出使用了本实施例的试剂的各脂蛋白分馏样品的反应吸光度。另外，此时将比较例1或实施例1的第二试剂(试剂a)与实施例2(试剂b)的第二试剂互换使用当然都没有问题，可以测定样本。
此外，使用显示出同等的显色的总甘油三酯测定试剂来代替本实施例的试剂，进行相同的操作。由此算出的反应吸光度是各脂蛋白分馏样品的总甘油三酯量，通过将其与上述的使用本实施例的试剂的各脂蛋白分馏样品的反应吸光度进行比较，可以算出各样品中的本实施例的试剂的反应率。这里所说的“将总甘油三酯量的反应吸光度与使用了实施例的试剂的反应吸光度进行比较”，例如是指用使用了实施例的试剂的反应吸光度除以总甘油三酯量的反应吸光度。需要说明的是，显示出同等的显色的总甘油三酯测定试剂例如有TG-EX“生研”(酶法)(甘油三酯试剂盒)等。
由此算出的反应率汇总在表中，结果如下所示。
[表1]
可以确认：在实施例1和实施例2中，在LDL分馏中进行特异性反应，可以实现CM分馏、VLDL分馏、IDL分馏和HDL分馏与LDL分馏的差别化。在比较例1中，CM分馏、VLDL分馏、IDL分馏中的甘油三酯的除去没有完成、或者反应没有得到抑制。另外，还可以确认：在比较例1中，虽然在HDL分馏中已完成甘油三酯的除去、或者反应被抑制，但在实施例1、实施例2中特异性结果更好。需要说明的是，上述分馏的总甘油三酯量如下：在CM·VLDL分馏或CM·VLDL·IDL分馏中是大约450～950mg/dL，在LDL分馏中是大约50～220mg/dL，而在HDL分馏中是大约35～80mg/dL。
接着，利用超离心法和本发明的试剂，以新鲜人血清为样本，定量各样本中的LDL-TG。
实施例4
(1) 通过超离心法进行LDL-TG的定量测定
超离心法按照常规方法(“新生化学实验法讲座4 脂质I　中性脂肪和脂蛋白(新生化学実験法講座4　脂質I　中性脂肪とリポタンパク質)”(株)东京化学同人出版中记载的方法)，离心分离比重为1.019～1.063的LDL分馏，使用TG-EX“生研”(酶法)(DENKA生研公司制造)测定所得的LDL分馏中的甘油三酯量。
比较例2
以人血清为样本，使用由与上述比较例1相同的组成构成的、试剂A和试剂a的组合试剂，如下操作。
(2) 使用了本发明的试剂的LDL-TG的定量测定
采集2μL样本，与195μL第一试剂混和，在37℃下加热5分钟进行反应，在主波长600nm、副波长700nm下测定反应5分钟后的反应液的吸光度(E1)。接着，在该反应液中混合65μL第二试剂，再于37℃下加热5分钟进行反应，在主波长600nm、副波长700nm下测定反应5分钟后的反应液的吸光度(E2)。通过从上述测定的吸光度E2中减去E1，算出吸光度变化量(ΔE)。此时，通过从样本为人血清时的吸光度变化量中减去样本为生理盐水等以代替人血清时的吸光度变化量，算出使用了本实施例的试剂的人血清样品中的反应吸光度。
(3) 标准曲线的制作
通过利用超离心法进行的测定，以LDL-TG浓度已明确的多个新鲜人血清样本为标准品制作标准曲线，将(2)中算出的反应吸光度换算成mg/dL测定值。
实施例5
以人血清-01～人血清-14为样本，使用由与上述实施例1相同的组成构成的、试剂B和试剂a的组合试剂，进行与上述(2)、(3)中记载的操作相同的操作。
实施例6
以人血清-01～人血清-14为样本，使用由与上述实施例2相同的组成构成的、试剂C和试剂b的组合试剂，进行与上述(2)、(3)中记载的操作相同的操作。
实施例7
制备由下述组成构成的LDL-TG定量试剂。
以人血清-01～人血清-14为样本，使用试剂D和试剂c的组合试剂，进行与上述(2)、(3)中记载的操作相同的操作。
关于人血清-01～人血清-14这14个人血清样本，通过上述(1)算出的实施例4的超离心法LDL-TG测定值(mg/dL)和通过上述(2)、(3)算出的比较例2、实施例5、实施例6和实施例7的LDL-TG测定值(mg/dL)及相关图见以下的表2和图1、图2、图3、图4。
[表2]
关于与实施例4的相关性，在比较例2中相关系数的平方是0.481，相对于此，在实施例5中相关系数的平方是0.970，在实施例6中相关系数的平方是0.977，而在实施例7中相关系数的平方是0.856。
根据本发明的实施例可知：与比较例2相比，与已知能够正确测定的实施例4的超离心法的相关性明显高。
比较例3
制备由下述组成构成的LDL-TG定量试剂。
以人血清-15～人血清-30为样本，使用试剂A和试剂d的组合试剂，进行与上述(2)、(3)中记载的操作相同的操作。
实施例8
制备由下述组成构成的LDL-TG定量试剂。
以人血清-15～人血清-30为样本，使用试剂F和试剂d的组合试剂，进行与上述(2)、(3)中记载的操作相同的操作。
实施例9
制备由下述组成构成的LDL-TG定量试剂。
#5: 约300kDa (来自假单胞菌属，制造商公称)(通过SDS-PAGE确认到约60kDa、约30kDa的谱带)
以人血清-15～人血清-30为样本，使用试剂G和试剂d的组合试剂，进行与上述(2)、(3)中记载的操作相同的操作。
实施例10
制备由下述组成构成的LDL-TG定量试剂。
#6：分子量不详(来自微生物，制造商公称)(通过SDS-PAGE确认到约70kDa、约30kDa的谱带)
以人血清-15～人血清-30为样本，使用试剂H和试剂d的组合试剂，进行与上述(2)、(3)中记载的操作相同的操作。
关于人血清-15～人血清-30这16个人血清样本，通过上述(1)算出的对照例的超离心法LDL-TG测定值(mg/dL)和通过上述(2)、(3)算出的比较例3、实施例8、实施例9、实施例10的LDL-TG测定值(mg/dL)和相关图见以下的表3和图5、图6、图7、图8。
[表3]
关于与实施例4的相关性，在比较例3中相关系数的平方是0.031，相对于此，在实施例8中相关系数的平方是0.936，在实施例9中相关系数的平方是0.883，而在实施例10中相关系数的平方是0.887。
根据本发明的实施例可知：与比较例3相比，与已知能够正确测定的实施例4的超离心法的相关性明显高。

Claims (3)

1. 低密度脂蛋白以外的脂蛋白中的甘油三酯的除去方法，该方法包括：在与低密度脂蛋白以外的脂蛋白发生作用的表面活性剂或具有LDL保护作用的表面活性剂的存在下，使脂蛋白脂肪酶、胆固醇酯酶、甘油激酶和甘油-3-磷酸氧化酶与样品发生作用，除去所产生的过氧化氢。
2. 权利要求1所述的方法，其中，上述表面活性剂是HLB值为13以上且15以下的聚氧化亚烷基衍生物。
3. 权利要求2所述的方法，其中，上述聚氧化亚烷基衍生物是HLB值为13以上且15以下的聚氧化亚烷基多环苯基醚。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106950095A (zh) * 2017-04-01 2017-07-14 合肥迪安医学检验所有限公司 一种减少脂血样本检测干扰的方法
CN108949903A (zh) * 2017-05-17 2018-12-07 广州市伊川生物科技有限公司 一种甘油三酯测定试剂盒及其测定方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6967857B2 (ja) * 2017-02-03 2021-11-17 デンカ株式会社 循環器疾患等のリスクの判断を補助する方法
US11513131B2 (en) * 2018-01-22 2022-11-29 Global Genomics Group, LLC Low density lipoprotein triglycerides (LDL-TG) as a biomarker of cardiovascular disease and uses thereof
US20200400694A1 (en) * 2018-03-13 2020-12-24 Denka Company Limited Method for assisting determination of risk of cardiovascular disease or the like
JP7029139B2 (ja) 2018-08-23 2022-03-03 デンカ株式会社 非アルコール性脂肪性肝炎の検出を補助する方法
WO2021157631A1 (ja) 2020-02-04 2021-08-12 デンカ株式会社 非アルコール性脂肪肝炎の検出を補助する方法
EP3865874B1 (en) * 2020-02-13 2022-10-05 Zhejiang Orient Gene Biotech Co., LTD Distinguishing smoking e-cigarettes from smoking cigarettes

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1953240A1 (en) * 2005-10-31 2008-08-06 Kyowa Medex Co., Ltd. Method for measuring triglyceride in low-density lipoprotein and kit for measurement
US7682831B2 (en) * 2002-11-27 2010-03-23 Sekisui Medical Co., Ltd. Method of measuring lipid in specific lipoprotein

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3645688A (en) * 1970-03-25 1972-02-29 Oxford Lab Measuring triglyceride and cholesterol in blood plasma or serum
JPS61104798A (ja) * 1984-10-25 1986-05-23 Toyobo Co Ltd 脂質測定用酵素含有組成物
JP2000043537A (ja) 1998-07-31 2000-02-15 Denso Corp 空気通路切替装置および車両用空調装置
US6811994B1 (en) 1999-01-20 2004-11-02 Kyowa Medex Co., Ltd. Method for quantitating triglycerides in lipoproteins
CA2363570A1 (en) 1999-03-01 2000-09-08 International Reagents Corporation Method for assaying biological sample component
WO2001094619A1 (fr) * 2000-06-07 2001-12-13 International Reagents Corporation Methode d'analyse de composants dans des echantillons biologiques
US20050255536A1 (en) 2002-06-10 2005-11-17 Shino-Test Corporation Method of selectively measuring triglycerides
US7507551B2 (en) 2002-12-13 2009-03-24 Denka Seiken Co., Ltd. Multiple quantification method for cholesterol in low-density lipoproteins
JP2006180707A (ja) 2003-03-28 2006-07-13 Denka Seiken Co Ltd 低密度リポ蛋白中のトリグリセリドの定量方法
CA2589459C (en) * 2004-11-29 2014-01-07 Jimro Co., Ltd. Method of measuring cholesterol in remnant-like lipoproteins

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7682831B2 (en) * 2002-11-27 2010-03-23 Sekisui Medical Co., Ltd. Method of measuring lipid in specific lipoprotein
EP1953240A1 (en) * 2005-10-31 2008-08-06 Kyowa Medex Co., Ltd. Method for measuring triglyceride in low-density lipoprotein and kit for measurement

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
贺占博等: "表面活性剂对甘油三乙酯酸性水解的影响", 《化学工业与工程》, 30 June 2002 (2002-06-30), pages 257 - 264 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106950095A (zh) * 2017-04-01 2017-07-14 合肥迪安医学检验所有限公司 一种减少脂血样本检测干扰的方法
CN106950095B (zh) * 2017-04-01 2020-01-10 合肥迪安医学检验所有限公司 一种减少脂血样本检测干扰的方法
CN108949903A (zh) * 2017-05-17 2018-12-07 广州市伊川生物科技有限公司 一种甘油三酯测定试剂盒及其测定方法

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