TW201348691A - 低密度脂蛋白以外之脂蛋白中的三酸甘油酯之消除方法 - Google Patents

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Abstract

本發明為了可提供不進行離心分離、電泳等煩雜之預處理操作而直接使用自動分析裝置等對試樣進行簡便性、特異性、精密性優異之LDL-TG之分別定量測定的方法，而揭示一種選擇性地消除低密度脂蛋白以外之脂蛋白中之三酸甘油酯的方法。低密度脂蛋白以外之脂蛋白中的三酸甘油酯之消除方法包括於對低密度脂蛋白以外之脂蛋白起作用之界面活性劑或具有LDL保護作用之界面活性劑的存在下，使脂蛋白脂肪酶、膽固醇酯酶、甘油激酶及甘油-3-磷酸氧化酶作用於試樣，並消除產生之過氧化氫。

Description

低密度脂蛋白以外之脂蛋白中的三酸甘油酯之消除方法
本發明係關於一種試樣中低密度脂蛋白以外之脂蛋白中的三酸甘油酯之消除方法。
血清、血漿中之脂質之主成分為膽固醇、三酸甘油酯、磷脂質等，該等血中脂質與脫輔基蛋白結合，以脂蛋白之形式於血液中循環。該等脂蛋白根據密度之差異，分類為乳糜脂粒(以下稱為CM)、超低密度脂蛋白(以下稱為VLDL)、中密度脂蛋白(以下稱為IDL)、低密度脂蛋白(以下稱為LDL)、高密度脂蛋白(以下稱為HDL)等。該等脂蛋白中，HDL有將沈積於組織中之過量膽固醇向肝臟輸送的作用，而有抗動脈硬化作用。又，LDL為膽固醇自肝臟向各組織之主要輸送體，可認為LDL之增加與動脈硬化發生有密切關係。因此，LDL中之膽固醇(以下稱為LDL-C)可認作動脈硬化症、缺血性心臟病(冠狀動脈疾病)等之危險因素，瞭解LDL-C之含量於該等疾病之診斷、治療及預防中被視作重要指標。另一方面，亦可見大量即便血液中之LDL-C為正常範圍亦發生缺血性心臟病等的例子，最近亦開始關注LDL粒子之質之變化或膽固醇以外之構成成分。
大量含有三酸甘油酯之LDL(以下稱為TG-rich LDL)為與膽固醇之含量較高之正常LDL性狀不同的脂蛋白質，大多見於肝病患者血液中，隨著肝病之進行血液中濃度增加，有報告稱，於肝病末 期佔據存在於血液中之脂蛋白質之大部分。又，據報告稱，TG-rich LDL使巨噬細胞泡沫化，該由TG-rich LDL引起之巨噬細胞泡沫化率與氧化LDL之一種即丙二醛修飾LDL之血清中濃度呈正比例，健康人血液中幾乎檢測不出過氧化三酸甘油酯，相對於此，肝病患者血液中可見過氧化三酸甘油酯顯著增加等，可認為LDL中之三酸甘油酯與氧化LDL之關聯亦較深。即，可認為，LDL中之三酸甘油酯量為與肝病或氧化LDL參與之各種動脈硬化症、冠狀動脈疾病等相關的重要指標。
作為LDL中之三酸甘油酯(以下稱為LDL-TG)的定量方法，為將組分分離與三酸甘油酯定量兩階段操作組合而求出的方法。組分分離操作為利用超離心法、電泳法、高效液相層析法(HPLC)之方法等；作為定量法，例如為使用臨床檢查時使用之自動分析裝置並利用三酸甘油酯測定用試劑進行定量的方法等。將該兩者組合可進行LDL-TG之定量，但該等係以將LDL與LDL以外之脂蛋白完全分離之預處理步驟、與進行測定之步驟兩階段進行，因此操作煩雜耗費時間。又，根據分離方法不同，經分離之試樣其本身之回收較為困難，或定量回收較為困難，或即便為可定量回收之方法作業亦需熟練或需要特別機器。該等係費用昂貴、於簡便性及經濟性方面而言難以普及的方法。
解決該等問題之方法中，作為不進行區分操作而可以自動分析裝置等進行測定的方法，已知：第1步驟中去除LDL以外之所有脂蛋白中之三酸甘油酯，此後第2步驟中測定剩餘之LDL中之三酸甘油酯的方法(專利文獻1)；或第1步驟中去除(游離型甘油及)HDL中之三酸甘油酯，此後第2步驟中僅測定LDL中之三酸甘油酯的方法(專利文獻2)。
然而，該等方法於VLDL中之三酸甘油酯或CM中之三酸甘油酯較高的檢體中，有第1步驟中未完全去除而反應遺留至第2步驟而受到正向影響的情況。或者該等方法有如下情況：第2步驟中反應應受抑制之VLDL中三酸甘油酯未完全抑制而反應受到部分促進，因此受到正向影響。實際上，若將該等方法與標準法即超離心法以大量檢體進行比較，則判斷有正相關性，但可見較大背離之檢體，或偏差較大等，判斷在對檢體之特異性、精密性方面有較大問題。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利特開2006-180707號公報
[專利文獻2]日本專利再公表2000-043537號公報
因此，本發明所欲解決之課題係為了可提供不進行離心分離、電泳等煩雜預處理操作而直接使用自動分析裝置等對試樣進行簡便性、特異性、精密性優異之LDL-TG之分別定量測定的方法，而提供一種選擇性地消除低密度脂蛋白以外之脂蛋白中之三酸甘油酯的方法。
本案發明者發現，藉由將某種界面活性劑與脂蛋白脂肪酶組合並使之作用於試樣，而與試樣中LDL以外之脂蛋白即CM、VLDL、LDL、HDL中之三酸甘油脂稍稍發生反應使之解體，該等脂蛋白中之三酸甘油酯被分解。本發明者認為，藉由進而提高選擇性、特 異性，而使LDL以外之脂蛋白中之三酸甘油酯分解至極限，並藉由於後續步驟中添加與殘存之LDL發生反應之界面活性劑而使LDL解體，利用脂蛋白脂肪酶之作用使LDL中之三酸甘油酯分解而生成過氧化氫，藉由對該過氧化氫進行定量，可對LDL中之三酸甘油酯進行定量。於是進而推進研究，發現：藉由添加膽固醇酯酶，而極選擇性地、特異性地使試樣中之CM、VLDL、IDL、HDL解體，可使該等LDL以外之脂蛋白組分中之三酸甘油酯分解。為了抑制反應之結果產生之三酸甘油酯之分解產物即過氧化氫於後續步驟中被檢測出，而於其中組入消除過氧化氫之反應系統，藉此成功地選擇性地消除低密度脂蛋白以外之脂蛋白中之三酸甘油酯，以至完成本發明。
即，本發明提供一種低密度脂蛋白以外之脂蛋白中的三酸甘油酯之消除方法，其包括：於對低密度脂蛋白以外之脂蛋白產生作用之界面活性劑或具有LDL保護作用之界面活性劑的存在下，使脂蛋白脂肪酶、膽固醇酯酶、甘油激酶及甘油-3-磷酸氧化酶作用於試樣，並消除產生之過氧化氫。
根據本發明之方法，可不進行離心操作等煩雜處理便簡便地消除LDL以外之脂蛋白中之三酸甘油酯。
圖1係表示由超離心法所得之LDL中三酸甘油酯之定量值、與由下述比較例2之方法所得之LDL中三酸甘油酯之定量值的相關關係的圖。
圖2係表示由超離心法所得之LDL中三酸甘油酯之定量值、與由 下述實施例5之方法所得之LDL中三酸甘油酯之定量值的相關關係的圖。
圖3係表示由超離心法所得之LDL中三酸甘油酯之定量值、與由下述實施例6之方法所得之LDL中三酸甘油酯之定量值的相關關係的圖。
圖4係表示由超離心法所得之LDL中三酸甘油酯之定量值、與由下述實施例7之方法所得之LDL中三酸甘油酯之定量值的相關關係的圖。
圖5係表示由超離心法所得之LDL中三酸甘油酯之定量值、與由下述比較例3之方法所得之LDL中三酸甘油酯之定量值的相關關係的圖。
圖6係表示由超離心法所得之LDL中三酸甘油酯之定量值、與由下述實施例8之方法所得之LDL中三酸甘油酯之定量值的相關關係的圖。
圖7係表示由超離心法所得之LDL中三酸甘油酯之定量值、與由下述實施例9之方法所得之LDL中三酸甘油酯之定量值的相關關係的圖。
圖8係表示由超離心法所得之LDL中三酸甘油酯之定量值、與由下述實施例10之方法所得之LDL中三酸甘油酯之定量值的相關關係的圖。
本發明之方法係藉由下述方法而消除試樣中LDL以外之脂蛋白中之三酸甘油酯。LDL以外之脂蛋白有CM、VLDL、IDL及HDL。由於CM、VLDL、LDL及HDL中之三酸甘油酯被消除，故而 若於後續步驟中使脂蛋白分解並對三酸甘油酯進行定量，則該三酸甘油酯主要為試樣中LDL中之三酸甘油酯。
作為供於本發明之方法之試樣，若為也許含有CM、VLDL、IDL、LDL及HDL等脂蛋白之試樣，則任一者均可，例如可列舉血液、血清、血漿等體液或其稀釋物，但並不限定於該等。
本發明中，上述所謂「消除三酸甘油酯」，係指使三酸甘油酯分解、且使其分解產物於後續步驟中檢測不出。作為選擇性地消除LDL以外之脂蛋白、即CM、VLDL、IDL及HDL等中所含之三酸甘油酯的方法，係藉由以下方法進行。
即，於對LDL以外之脂蛋白起作用之界面活性劑、或具有LDL保護作用之界面活性劑的存在下，使脂蛋白脂肪酶、膽固醇酯酶、甘油激酶及甘油-3-磷酸氧化酶發生作用，並消除產生之過氧化氫。
作為消除過氧化氫之方法，可列舉：使觸酶發揮作用而使之分解成水與氧氣之方法，及使用過氧化酶使酚系或苯胺系供氫體化合物與過氧化氫發生反應而轉化成無色醌的方法；可使用任一方法，進而並不限定於該等方法。該等過氧化氫之消除方法本身於該領域中眾所周知。
反應液中之脂蛋白脂肪酶濃度較佳為0.01~2000KU/L左右，進而較佳為0.05~1000KU/L左右。甘油激酶之濃度較佳為0.02~80.0KU/L左右，進而較佳為0.05~40.0KU/L左右。甘油-3-磷酸氧化酶之濃度較佳為0.2~20.0KU/L左右，進而較佳為0.5~10.0KU/L左右。進而，使過氧化氫分解為水與氧氣之情形時，觸酶之濃度較佳為40~5000KU/L左右，進而較佳為50~2000KU/L左右。
又，使反應液中之過氧化氫向無色醌轉化之情形時，過氧化酶之濃度較佳為1~40KU/L，進而較佳為2~30KU/L。此時添加之酚系或苯胺系供氫體化合物之濃度較佳為0.2~3mmol/L。
作為本發明之方法中使用之膽固醇酯酶之較佳例，可列舉：分子量為50kDa以下之膽固醇酯酶，或分子量為50kDa以上但具有分子量為50kDa以下之次單元的膽固醇酯酶。又，膽固醇酯酶之來源並無任何限定，可為來源於任一動物、微生物，尤其可較佳地使用來源於假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)之膽固醇酯酶。
本發明之方法中使用之上述膽固醇酯酶濃度較佳為10~8000U/L左右，進而較佳為50~4000U/L左右。
作為本發明之方法中使用之作用於LDL以外之脂蛋白的界面活性劑、或具有LDL保護作用之界面活性劑的較佳例，可列舉HLB(Hydrophile Lipophile Balance，親水親油比)值為13以上且15以下之聚氧伸烷基衍生物。作為衍生物之例，可列舉：高級醇縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪醯胺縮合物、高級烷基胺縮合物、高級烷基硫醇縮合物、烷酚縮合物。
作為HLB值為13以上且15以下之聚氧伸烷基衍生物的較佳具體例，可列舉：聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯鯨蠟基醚、聚氧乙烯油醯基醚、聚氧乙烯高級醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯苄基苯基醚、聚氧伸烷基多環苯基醚等，但並不限定於該等。
又，作為本發明之方法中使用之界面活性劑，可使用陽離子界面活性劑。作為此處所使用之陽離子界面活性劑之例，可列舉具有四級銨鹽作為親水基者，但並不限定於此。又，該等界面活性劑 可單獨使用1種，亦可將2種以上組合使用。
所使用之上述界面活性劑之濃度較佳為0.01~20g/L左右，進而較佳為0.1~10g/L左右。
本發明之方法較佳為於pH值5~9之緩衝液中進行，作為緩衝液，較佳為三羥甲基胺基甲烷、三乙醇胺、古德緩衝液等含胺之緩衝液。尤佳為作為古德緩衝液之Bis-Tris(二(2-羥乙基)亞胺基三(羥甲基)甲烷)、PIPES(哌-1,4-二乙磺酸)、MOPSO(3-(N-啉基)-2-羥基丙磺酸)、BES(N,N-二(2-羥乙基)-2-胺基乙磺酸)、HEPES(羥乙基哌乙硫磺酸)及POPSO(哌-1,4-二羥基丙磺酸)，緩衝液之濃度較佳為5~5000mM左右，進而較佳為10~1000mM左右。
本發明之方法中，為了抑制與LDL之反應並進一步提高其他脂蛋白之消除，或為了增強反應液中酶類之活性作用並使其穩定化，可使反應液中含有2價金屬離子。作為2價金屬離子，可使用銅離子、鐵離子、鈣離子及鎂離子，尤佳為鎂離子。2價金屬離子之濃度較佳為1~500mM左右，進而較佳為5~200mM左右。
反應溫度例如15~55℃，25~45℃左右為適當，最佳為37℃。又，反應時間為1~30分鐘左右，進而較佳為2~15分鐘左右。
本發明之方法中，為了防止反應之結果產生之殘骸物干擾與LDL之反應，可添加白蛋白。藉由在白蛋白之存在下進行，反應之結果產生之殘骸物吸附於白蛋白，可防止於後續步驟中該等殘骸干擾反應。白蛋白只要為白蛋白則無任何限定，可較佳地使用血清白蛋白等市售白蛋白。又，白蛋白之來源亦無任何限定，可為人、牛、豬、馬等任一動物，尤其可較佳地使用廣泛使用之牛血清白蛋白。反應溶液中上述白蛋白之濃度較佳為0.01~30.0g/L，進而較佳為0.3~20.0 g/L。
於本發明之方法中，包含界面活性劑、脂蛋白脂肪酶、膽固醇酯酶、甘油激酶及甘油-3-磷酸氧化酶之作用於LDL以外之脂蛋白並使該等脂蛋白分解的酶、以及觸酶等用以消除過氧化氫之酶可同時添加，又可分別添加。較佳為，製備含有所有該等試劑之試劑並與試樣混合即可。
利用上述本發明之方法，選擇性地消除LDL以外之脂蛋白中之三酸甘油酯，因此可藉由於後續步驟中使脂蛋白分解並對三酸甘油酯進行定量，而對LDL中之三酸甘油酯進行定量。
其例如可藉由如下方式進行：添加至少作用於LDL之界面活性劑，利用殘餘於已實施本發明之方法後之反應系統中的脂蛋白脂肪酶、甘油激酶及甘油-3-磷酸氧化酶的作用產生過氧化氫，並對該過氧化氫進行定量。又，該等之定量所需之酶類係除了於本發明之方法中添加而殘餘在反應系統中以外，亦可進而追加而添加。又，參與該等反應之酶類於本發明之方法中，於後續步驟中並不限定於1種，亦可將2種以上酶組合使用。
於該後續步驟中，至少作用於LDL之界面活性劑可為僅選擇性地作用於LDL之界面活性劑，亦可為作用於所有脂蛋白之界面活性劑。
作為作用於所有脂蛋白之界面活性劑的較佳例，可列舉HLB值為11以上、較佳為12以上之聚氧伸烷基衍生物。作為衍生物之例，可列舉：高級醇縮合物、高級脂肪酸縮合物、高級脂肪醯胺縮合物、高級烷基胺縮合物、高級烷基硫醇縮合物、烷酚縮合物。
作為HLB值為11以上之聚氧伸烷基衍生物的較佳具體 例，可列舉：聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯鯨蠟基醚、聚氧乙烯油醯基醚、聚氧乙烯高級醇醚、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚氧乙烯多環苯基醚、HLB值未滿13之聚氧伸烷基多環苯基醚等，但並不限定於該等。
又，作為僅選擇性地作用於LDL之界面活性劑的例，可列舉陰離子界面活性劑、或羧基甜菜鹼系之兩性界面活性劑等。作為此處所使用之陰離子界面活性劑，可列舉：具有芳香環上鍵結有碳數4~18之直鏈狀或分枝狀烷基之結構者，芳香環為苯、萘、聯苯等由碳與氫構成者，以及上述芳香環上鍵結有如磺酸鹽之親水基者，但並不限定於該等。
後續步驟中使用之界面活性劑之濃度較佳為0.1~100g/L左右，進而較佳為1~50g/L左右。又，界面活性劑可單獨使用1種，亦可將2種以上組合使用。
後續步驟中之其他較佳之反應條件係與第1步驟之較佳反應條件相同。
產生之過氧化氫之定量可利用常法進行，例如，於過氧化氫存在下利用過氧化酶之作用使4-胺基安替比林與酚系或苯胺系供氫體化合物氧化縮合，並對產生之色素進行定量即可。作為酚系或苯胺系供氫體化合物，例如可列舉：N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N'-丁二醯基乙二胺(EMSE)等。
以下，基於本發明之實施例進行具體說明。但本發明並不限定於下述實施例。
[實施例] [比較例1]
製備包含以下組成之LDL-TG定量試劑。
第一試劑(試劑A)
＊1：聚氧伸烷基衍生物(HLB值13.2)
第二試劑(試劑a)
＊2：聚氧乙烯烷基醚(HLB值13.3)
[實施例1]
製備包含以下組成之LDL-TG定量試劑。
第一試劑(試劑B)
＊3：聚氧伸烷基衍生物(HLB值13.2)
#1：約30kDa(源自假單胞菌屬)
第二試劑(試劑a)
＊4：聚氧乙烯烷基醚(HLB值13.3)
[實施例2]
製備包含以下組成之LDL-TG定量試劑。
第一試劑(試劑C)
＊5：聚氧伸烷基衍生物(HLB值13.2)
#2：約30kDa(源自假單胞菌屬)
第二試劑(試劑b)
＊6：聚氧乙烯烷基醚(HLB值12.4)
[實施例3]
作為評價中使用之試樣，例如使用超離心法分取將CM、VLDL一次性回收而得之組分(比重未滿0.96~1.006)、或將CM、VLDL、IDL一次性回收而得之組分(比重未滿0.96~1.019)、LDL組分(比重1.019~1.063)、HDL組分(比重1.063~1.210)，製成試樣。測定該等組分試樣各自之總三酸甘油酯量，與使用上述實施例試劑進行定量之三酸甘油酯量進行比較。再者，超離心法係依據東京化學同人(股)出版之「新生化學實驗法講座4脂質|中性脂肪與脂蛋白質」所記載之方法而實施。
比較例1、實施例1及實施例2之試劑係以如下方式進行操作。採取檢體2μL，與第一試劑195μL混合，於37℃下加溫5分鐘進行反應，以主波長600nm、副波長700nm測定反應5分鐘後之反應液的吸光度(E1)。繼而，於該反應液中混合第二試劑65μL，進而於37℃下加溫5分鐘進行反應，以主波長600nm、副波長700nm測定反應5分鐘後之反應液的吸光度(E2)。藉由自該等測定之吸光度之E2減去E1，算出吸光度變化量(△E)。此時，自檢體為各脂蛋白組分試樣之情形的吸光度變化量減去檢體為代替各脂蛋白組分試樣之生理鹽水等之情形的吸光度變化量，藉此可算出使用本實施例之試劑之各脂蛋白組分試樣的反應吸光度。又，此時，將比較例1或實施例1之第二試劑(試劑a)與實施例2(試劑b)之第二試劑調換使用亦無任何問題，可測定檢體。
另外，使用顯示同等顯色之總三酸甘油酯測定試劑代替本實施例之試劑，進行同樣之操作。藉此算出之反應吸光度為各脂蛋白組分試樣之總三酸甘油酯量，與上述使用本實施例之試劑之各脂蛋 白組分試樣的反應吸光度進行比較，藉此可算出各試樣中本實施例之試劑之反應率。此處，所謂「總三酸甘油酯量之反應吸光度與使用實施例之試劑之反應吸光度進行比較」，係指例如用使用實施例之試劑之反應吸光度除以總三酸甘油酯量之反應吸光度。再者，作為顯示同等顯色之總三酸甘油酯測定試劑，例如有TG-EX「生研」(酶法)(三酸甘油脂試劑盒)等。
藉此，將於表中匯總有算出之反應率者示於以下。
可確認：實施例1及實施例2中，LDL組分發生特異性反應，出現CM組分、VLDL組分、IDL組分及HDL組分與LDL組分之差異化。比較例1中，CM組分、VLDL組分、IDL組分中之三酸甘油酯並未消除或反應未受抑制。又，可確認：比較例1中，HDL組分中三酸甘油酯消除或反應受到抑制，但實施例1、實施例2中為更良好之特異性結果。再者，關於該等組分之總三酸甘油酯量，於CM、VLDL組分或CM、VLDL、IDL組分中大約為450~950mg/dL，於LDL組分中大約為50~220mg/dL，於HDL組分中大約為35~80mg/dL。
繼而，使用超離心法及本發明之試劑，以新鮮人體血清為檢體並對各檢體中之LDL-TG進行定量。
[實施例4] (1)利用超離心法之LDL-TG之定量測定
超離心法係依據常法(東京化學同人(股)出版之「新生化學實驗法講座4脂質|中性脂肪與脂蛋白質」中所記載之方法)，將比重1.019~1.063之LDL組分離心分離，使用TG-EX「生研」(酶法)(Denka Seiken公司製造)測定所獲得之LDL組分中的三酸甘油酯量。
[比較例2]
以人體血清為檢體，使用包含與上述比較例1相同之組成之試劑A及試劑a之組合之試劑，以如下方式進行操作。
(2)使用本發明之試劑之LDL-TG的定量測定
採取檢體2μL，與第一試劑195μL混合，於37℃下加溫5分鐘進行反應，以主波長600nm、副波長700nm測定反應5分鐘後之反應液之吸光度(E1)。繼而，於該反應液中混合第二試劑65μL，進而於37℃下加溫5分鐘進行反應，以主波長600nm、副波長700nm測定反應5分鐘後之反應液之吸光度(E2)。藉由自該等測定之吸光度之E2減去E1而算出吸光度變化量(△E)。此時，自檢體為人體血清之情形之吸光度變化量減去檢體為代替人體血清之生理鹽水等之情形之吸光度變化量，藉此算出使用本實施例之試劑的人體血清試樣之反應吸光度。
(3)校準曲線之製作
根據利用超離心法之測定，以判明LDL-TG濃度之新鮮人體血清 數檢體為標準品製作校準曲線，將以(2)算出之反應吸光度換算成mg/dL測定值。
[實施例5]
以人體血清-01至人體血清-14為檢體，使用包含與上述實施例1相同組成之試劑B及試劑a之組合之試劑，進行與上述(2)(3)中記載者相同之操作。
[實施例6]
以人體血清-01至人體血清-14為檢體，使用包含與上述實施例2相同組成之試劑C及試劑b之組合之試劑，進行與上述(2)(3)中記載者相同之操作。
[實施例7]
製備包含以下組成之LDL-TG定量試劑。
第一試劑(試劑D)
＊7：聚氧伸烷基衍生物(HLB值13.2)
#3：分子量不明(來自微生物(Microbial)，製造商公稱)
第二試劑(試劑c)
＊8：聚氧乙烯烷基醚(HLB值12.4)
以人體血清-01至人體血清-14為檢體，使用試劑D及試劑c之組合之試劑，進行與上述(2)(3)中記載者相同之操作。
針對人體血清-01至人體血清-14之人體血清14檢體，將藉由上述(1)算出之實施例4之超離心法LDL-TG測定值(mg/dL)、及藉由上述(2)(3)算出之比較例2、實施例5、實施例6、及實施例7之LDL-TG測定值(mg/dL)及相關表格示於以下表2及圖1、圖2、圖3、圖4。
關於與實施例4之相關性，比較例2中相關係數之平方為0.481，相對於此，實施例5中相關係數之平方為0.970，實施例6中為0.977，實施例7中為0.856。
根據本發明之實施例可知，與已知可正確測定之實施例4之超離心法的相關性與比較例2相比，明顯較高。
[比較例3]
製備包含以下組成之LDL-TG定量試劑。
第一試劑(試劑A)
＊9：聚氧伸烷基衍生物(HLB值13.2)
第二試劑(試劑d)
＊10：聚氧乙烯烷基醚(HLB值13.3)
以人體血清-15至人體血清-30為檢體，使用試劑A及試劑d之組合之試劑，進行與上述(2)(3)記載者相同之操作。
[實施例8]
製備包含以下組成之LDL-TG定量試劑。
第一試劑(試劑F)
＊11：聚氧伸烷基衍生物(HLB值13.2)
#4：約30kDa(來自假單胞菌屬)
第二試劑(試劑d)
＊12：聚氧乙烯烷基醚(HLB值13.3)
以人體血清-15至人體血清-30為檢體，使用試劑F及試劑d之組合之試劑，進行與上述(2)(3)記載者相同之操作。
[實施例9]
製備包含以下組成之LDL-TG定量試劑。
第一試劑(試劑G)
＊13：聚氧伸烷基衍生物(HLB值13.2)
#5：約300kDa(來自假單胞菌屬，製造商公稱)(利用SDS-PAGE確認約60kDa、約30kDa之帶)
第二試劑(試劑d)
＊14：聚氧乙烯烷基醚(HLB值13.3)
以人體血清-15至人體血清-30為檢體，使用試劑G及試劑d之組合之試劑，進行與上述(2)(3)記載者相同之操作。
[實施例10]
製備包含以下組成之LDL-TG定量試劑。
第一試劑(試劑H)
＊15：聚氧伸烷基衍生物(HLB值13.2)
#6：分子量不明(來自微生物(Microorganism)，製造商公稱)(利用SDS-PAGE確認約70kDa、約30kDa之帶)
第二試劑(試劑d)
＊16：聚氧乙烯烷基醚(HLB值13.3)
以人體血清-15至人體血清-30為檢體，使用試劑H及試劑d之組合之試劑，進行與上述(2)(3)記載者相同之操作。
關於人體血清-15至人體血清-30之人體血清16檢體，將藉由上述(1)算出之對照例之超離心法LDL-TG測定值(mg/dL)、與藉由上述(2)(3)算出之比較例3、實施例8、實施例9、實施例10之LDL-TG 測定值(mg/dL)及相關表格示於以下表3及圖5、圖6、圖7、圖8。
關於與實施例4之相關性，比較例3中相關係數之平方為0.031，相對於此，實施例8中相關係數之平方為0.936，實施例9中為0.883，實施例10中為0.887。
根據本發明之實施例可知，與已知可正確測定之實施例4之超離心法的相關性與比較例3相比，明顯較高。

Claims (3)

  1. 一種低密度脂蛋白以外之脂蛋白中的三酸甘油酯之消除方法，其包括於對低密度脂蛋白以外之脂蛋白起作用之界面活性劑或具有LDL保護作用之界面活性劑的存在下，使脂蛋白脂肪酶、膽固醇酯酶、甘油激酶及甘油-3-磷酸氧化酶作用於試樣，並消除產生之過氧化氫。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，上述界面活性劑為HLB值為13以上且15以下之聚氧伸烷基衍生物。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中，上述聚氧伸烷基衍生物為HLB值為13以上且15以下之聚氧伸烷基多環苯基醚。
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