TW201348449A - 高密度脂蛋白（ｈｄｌ）中之膽固醇（－ｃ）之次組分定量方法 - Google Patents

高密度脂蛋白（ｈｄｌ）中之膽固醇（－ｃ）之次組分定量方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種分別或同時定量全部HDL-C以及含ApoE之HDL-C及缺乏ApoE之HDL-C之HDL次組分中之膽固醇的方法。本發明係如下方法：於受檢試樣中以最終濃度為0.05~0.10%之濃度添加包含聚氧乙烯苄基苯醚衍生物之界面活性劑，使膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶作用，對所產生之過氧化氫進行定量，藉此以利用酶之方式分別定量缺乏ApoE之HDL中之膽固醇的方法；及於受檢試樣中以最終濃度成為0.15~0.75%之方式添加包含聚氧乙烯苄基苯醚衍生物之界面活性劑，使膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶作用，對所產生之過氧化氫進行定量，藉此以利用酶之方式分別定量含ApoE之HDL中之膽固醇的方法。

Description

高密度脂蛋白(HDL)中之膽固醇(-C)之次組分定量方法
本發明係關於一種高密度脂蛋白(HDL)中之膽固醇(-C)之次組分定量方法。
已知HDL與由於自包括動脈硬化壁在內之各組織接收膽固醇而蓄積於細胞內之膽固醇之去除作用相關，係以冠狀動脈硬化症為代表之各種動脈硬化症之危險預防因子，其血中濃度成為對預知動脈硬化性疾病之發病有用之指標。
HDL為稱作缺輔基蛋白(apoprotein)之蛋白質與磷脂質、膽固醇、中性脂肪之類的脂質成分之複合體，根據作為其成分之一的載脂蛋白質E(ApoE)之含量比率之不同，可分類為含ApoE之HDL與缺乏ApoE之HDL之次組分。含ApoE之HDL奪取膽固醇之能力較強，亦具有抗血小板作用，作為HDL中之極其重要之脂蛋白而備受矚目。近來，作為繼斯達汀(statin)之後的脂質異常症治療藥，已知寄期望於使HDL-C上升之膽固醇酯輸送蛋白(CETP)抑制藥的CETP抑制藥係主要使HDL、尤其是含ApoE之HDL增加。
作為HDL-C之測定方法，已知有例如藉由超離心分離將HDL與其他脂蛋白分離後供於膽固醇測定的方法、或藉由電泳而分離後進行脂質之染色並測定其顯色強度的方法等。然而，該等方法均存在操作繁雜，無法對大量檢體進行處理等問題，日常中幾乎不使用。
作為HDL-C之測定方法，有對檢體添加沈澱劑使HDL以外之脂蛋 白質凝聚，藉由離心分離將其去除，對分離所得之僅含HDL之上清液中之膽固醇進行測定的方法。已知該方法中根據所使用之沈澱劑之種類，對HDL之次組分之反應性有所不同，於使用磷鎢酸-鎂或硫酸葡聚糖-鎂、肝素-鈣作為沈澱劑之方法中，含ApoE之HDL與VLDL(very low.density lipoprotein，極低密度脂蛋白)、LDL(low density lipoprotein，低密度脂蛋白)等脂蛋白一併凝聚，藉由離心分離而作為沈澱組分被去除，因此無法作為HDL組分而測定。另一方面，於使用肝素-錳或聚乙二醇(PEG)之方法中，含ApoE之HDL不凝聚而可作為HDL測定。總之，使用該沈澱劑將HDL分離而進行定量之方法與超離心法或電泳法相比較為簡便，但是由於包括添加沈澱劑進行分離之操作，故而於簡便性方面並不能夠令人滿意，又，需要相對較大量之檢體量。
近年來，作為定量HDL-C之簡便方法，已知有不進行使用沈澱劑之預處理操作而利用自動分析裝置定量HDL-C的方法，已知有對膽固醇酯酶或膽固醇氧化酶之酶進行化學修飾，於環糊精等包合化合物之存在下特異性地捕獲HDL-C的方法(參照專利文獻1)；或與HDL以外之脂蛋白形成凝聚體或複合體，其後藉由酶反應捕獲HDL中之膽固醇的方法(參照專利文獻2及3)；使用特異性地作用於HDL之HLB(Hydrophile Lipophile Balance，親水親油平衡值)為13~14之界面活性劑的方法(參照專利文獻4)等。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利特開平7-301636號公報
[專利文獻2]日本專利特開平8-131197號公報
[專利文獻3]日本專利特開平8-201393號公報
[專利文獻4]WO98/26090
以上所述之方法可測定HDL-膽固醇(HDL-C)(以下，有時以-C表示膽固醇)，但是於對HDL次組分之反應性不同，將HDL劃分為次組分而考慮之情形時，存在部分地無法分別測定或幾乎全部無法分別測定缺乏ApoE之HDL中之膽固醇(缺乏ApoE之HDL-C)、含ApoE之HDL中之膽固醇(含ApoE之HDL-C)，而無法分別定量缺乏ApoE之HDL-C、含ApoE之HDL-C之問題。
本發明之目的在於提供一種無需繁雜之組分分離操作而分別或同時定量全部HDL-C或含ApoE之HDL-C、缺乏ApoE之HDL-C等HDL次組分中之膽固醇的方法。
本案發明者等人進行努力研究，結果發現：根據包含聚氧乙烯苄基苯醚衍生物之界面活性劑之濃度，作為HDL次組分之缺乏ApoE之HDL-C、含ApoE之HDL-C之反應性有所不同，藉由調節與缺乏ApoE之HDL-C、含ApoE之HDL-C反應的該等界面活性劑之濃度，可分別或同時定量缺乏ApoE之HDL-C、含ApoE之HDL-C、總HDL-C。又，藉由調節該等界面活性劑之濃度，可區分含ApoE之HDL-C、缺乏ApoE之HDL-C而分別地測定，進而亦可測定全部HDL-C(包括含ApoE之HDL-C及缺乏ApoE之HDL-C)。又發現：於利用使用3種試劑之通用自動分析裝置以3個步驟進行測定之情形時，於第1步驟中將HDL以外之脂蛋白中之膽固醇導出至反應體系外，繼而改變第2步驟所使用之第2試劑中、及第3步驟所使用之第3試劑中之該等界面活性劑濃度之條件，藉此可單獨測定含ApoE之HDL-C、缺乏ApoE之HDL-C及全部HDL-C，或同時測定該等之複數種、即2種或3種。
進而發現：於合併第1步驟與第2步驟之條件的第1試劑中將含 ApoE之HDL以外之脂蛋白中之膽固醇導出至反應體系外，繼而利用第2試劑測定含ApoE之HDL-C，藉此可利用使用2種試劑之通用自動分析裝置以2個步驟測定含ApoE之HDL-C，從而完成了本發明。
如此，藉由本發明之方法，可分別定量受檢試樣中之粒子尺寸較大之缺乏ApoE之HDL-C及含ApoE之HDL-C，進而可定量包含該等次組分HDL-C之全部HDL-C。
即，本發明如下所述。
[1]一種缺乏ApoE之HDL中之膽固醇之定量方法，其係於受檢試樣中以最終濃度為0.05~0.10%之濃度添加包含聚氧乙烯苄基苯醚衍生物之界面活性劑，使膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶作用，對所產生之過氧化氫進行定量，藉此以利用酶之方式分別定量缺乏ApoE之HDL中之膽固醇。
[2]一種含ApoE之HDL中之膽固醇之定量方法，其係於受檢試樣中以最終濃度成為0.15~0.75%之方式添加包含聚氧乙烯苄基苯醚衍生物之界面活性劑，使膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶作用，對所產生之過氧化氫進行定量，藉此以利用酶之方式分別定量含ApoE之HDL中之膽固醇。
[3]一種HDL中之膽固醇之定量方法，其係於受檢試樣中以最終濃度為0.05~0.10%之濃度添加包含聚氧乙烯苄基苯醚衍生物之界面活性劑，使膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶作用，對所產生之過氧化氫進行定量，而以利用酶之方式分別定量缺乏ApoE之HDL中之膽固醇，繼而以最終濃度成為0.15~0.75%之方式添加包含聚氧乙烯苄基苯醚衍生物之界面活性劑，使膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶作用，對所產生之過氧化氫進行定量，藉此以利用酶之方式分別定量含ApoE之HDL中之膽固醇。
[4]一種測定HDL次組分中之膽固醇之方法，其包括：(i)將受檢 試樣中之HDL以外之脂蛋白中之膽固醇導出至反應體系外，(ii)藉由如[1]之方法分別定量缺乏ApoE之HDL中之膽固醇，(iii)進而藉由如[2]之方法以利用酶之方式分別定量含ApoE之HDL中之膽固醇。
[5]如[1]至[3]中任一項之方法，其係根據藉由如[1]之方法所獲得之缺乏ApoE之HDL中之膽固醇之定量值及藉由如[2]之方法所獲得之含ApoE之HDL中之膽固醇之定量值而定量總HDL-膽固醇。
[6]如[1]至[5]中任一項之方法，其係利用通用之自動分析裝置藉由1次取樣同時定量缺乏ApoE之HDL中之膽固醇、含ApoE之HDL中之膽固醇、及總HDL-膽固醇。
[7]一種含ApoE之HDL中之膽固醇之定量方法，其係於受檢試樣中以最終濃度為0.05~0.10%之濃度添加包含聚氧乙烯苄基苯醚衍生物之界面活性劑，使膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶作用，將所產生之過氧化氫消去，藉此將含ApoE之HDL以外之HDL中之膽固醇導出至反應體系外，繼而以最終濃度成為0.15~0.75%之方式添加包含聚氧乙烯苄基苯醚衍生物之界面活性劑，使膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶作用，對所產生之過氧化氫進行定量，藉此定量含ApoE之HDL中之膽固醇。
本說明書包含作為本申請案之優先權基礎的日本專利申請案2012-090423號之說明書及/或圖式中所記載之內容。
於本發明之方法中，藉由以低濃度(最終濃度0.05~0.10%)使用與HDL反應之界面活性劑，而僅使作為HDL之次組分之缺乏ApoE之HDL反應，並測定缺乏ApoE之HDL-C，於第2步驟中藉由以含ApoE之HDL-C之反應性較高之濃度範圍、即高濃度(最終濃度0.15~0.75%)使用界面活性劑，而僅使作為HDL之次組分之含ApoE之HDL反應，藉此定量含ApoE之HDL-C及缺乏ApoE之HDL-C，藉由上述本發明之方 法可分別定量受檢試樣中之粒子尺寸較大之缺乏ApoE之HDL-C及含ApoE之HDL-C，進而可定量包含該等次組分HDL-C之全部HDL-C。可僅測定含ApoE之HDL-C。
圖1係表示針對HDL試樣藉由本發明之實施例1之方法進行測定之情形時與PT-DS-Mg法之差值(偏差%)的圖。
圖2係表示針對HDL試樣藉由本發明之實施例2之方法進行測定之情形時與13%PEG沈澱法之差值(偏差%)的圖。
圖3係表示針對HDL試樣藉由本發明之實施例3之方法進行測定之情形時與13%PEG沈澱法(a)、PT-DS-Mg沈澱法(b)、13%PEG沈澱法與PT-DS-Mg之差值(c)之相關性的圖。
圖4係表示針對HDL試樣藉由本發明之實施例4之方法進行測定之情形時與13%PEG沈澱法和PT-DS-Mg之差值之相關性的圖。
以下，對本發明進行詳細說明。
作為脂蛋白中所含之膽固醇，有酯型膽固醇(膽固醇酯)及游離型膽固醇。於本說明書中，於簡稱為「膽固醇」之情形時，包含該等兩者。
脂蛋白大致分為VLDL、LDL及HDL之組分。其中，HDL根據ApoE之含量比率之不同可分類為含ApoE之HDL與缺乏ApoE之HDL之次組分。通常，含ApoE之HDL表示HDL中含有ApoE者，缺乏ApoE之HDL表示缺乏ApoE者。將HDL分為含ApoE之HDL與缺乏ApoE之HDL之原因在於，該等脂蛋白對動脈硬化之作用機制不同，因此必需分別測定。即，含ApoE之HDL奪取膽固醇之能力較強，亦具有抗血小板作用，於HDL中亦作為重要之脂蛋白而發揮作用。又，已知作為脂質異常症治療藥之使HDL-C上升之CETP抑制藥亦主要使含ApoE之HDL 上升。又，有將存在ApoE或ApoE含量較多之HDL稱為富含ApoE之HDL之情況，其亦包括在含ApoE之HDL中。由於存在於HDL內部之ApoE含量之分佈連續，故而根據脂蛋白中之ApoE含有比，無法明確地區別含ApoE之HDL與缺乏ApoE之HDL，但如下所述，例如於以ApoE含量為指標藉由層析法等將HDL組分化之情形時，只要確定特定之ApoE含量，根據其值區別含ApoE之HDL與缺乏ApoE之HDL即可。
又，HDL根據密度不同可分類為HDL2與HDL3，針對各者分別存在ApoE含量不同之含ApoE之HDL2、及含ApoE之HDL3。又，粒子尺寸較大之大型HDL中有通常存在之載脂蛋白A1(ApoA1)缺損而存在大量ApoE者，其亦包括在含ApoE之HDL中。對於脂蛋白粒子尺寸之直徑有不同報告，VLDL為30 nm~80 nm(30 nm~75 nm)，LDL為22 nm~28 nm(19 nm~30 nm)，HDL為直徑7~10 nm。關於比重，VLDL為1.006以下，LDL為1.019~1.063，HDL為1.063~1.21。
本發明之方法之目的在於測定含ApoE之HDL中之膽固醇、缺乏ApoE之HDL中之膽固醇、及包括含ApoE之HDL與缺乏ApoE之HDL之全部HDL中之膽固醇。
作為本發明之方法中供於測定之受檢試樣，只要為可能包含HDL、LDL、VLDL及CM(Chylomicron，乳糜微粒)等脂蛋白之試樣則可為任意者，例如可列舉血清、血漿等體液或其稀釋物，但並不限定於該等。
本發明之方法通常使用自動分析裝置而進行。本發明之方法可以第1步驟及第2步驟之2個步驟，或第1步驟、第2步驟及第3步驟之3個步驟進行。作為包括2個步驟之方法及包括3個步驟之方法，可例示以下方法，於各方法之各步驟中發生以下之反應。
(1)於第1步驟中測定缺乏ApoE之HDL-C，於第2步驟中測定含 ApoE之HDL-C的包括2個步驟之方法。
(2)於第1步驟中將HDL以外之脂蛋白(CM、VLDL、LDL)導出至反應體系外，於第2步驟中測定缺乏ApoE之HDL-C，於第3步驟中測定含ApoE之HDL-C的包括3個步驟之方法。於(2)之方法中，藉由第2步驟及第3步驟測定總HDL-C。該方法為下述之實施例3之方法。
(3)於第1步驟中將含ApoE之HDL-C以外之脂蛋白(CM、VLDL、LDL、缺乏ApoE之HDL-C)導出至反應體系外，於第2步驟中測定含ApoE之HDL-C的包括2個步驟之方法。該方法為下述實施例4之方法。
(1)之包括2個步驟之方法之詳情如下所述。
於第1步驟中使界面活性劑成為對缺乏ApoE之HDL之反應性較高之濃度範圍、即以低濃度(最終濃度0.05~0.10%)使用界面活性劑而測定缺乏ApoE之HDL-C，於第2步驟中以含ApoE之HDL之反應性較高之濃度範圍、即以高濃度(最終濃度0.15~0.75%)使用界面活性劑而測定含ApoE之HDL-C。於第1步驟中發生缺乏ApoE之HDL-C之反應，於第2步驟中發生含ApoE之HDL-C之反應。可根據第1步驟中之吸光度增加部分而定量缺乏ApoE之HDL-C濃度，又，可根據第2步驟中之吸光度增加部分而定量含ApoE之HDL-C濃度，進而可根據第1步驟及第2步驟中之總吸光度增加部分而定量總HDL-C濃度。
於本方法中，即便於試樣中存在HDL以外之脂蛋白，亦可定量缺乏ApoE之HDL-C濃度及含ApoE之HDL-C濃度，進而可定量總HDL-C濃度。
為了進一步特異性地測定缺乏ApoE之HDL-C濃度及含ApoE之HDL-C濃度，可如以下之(2)或(3)之方法般，預先將HDL以外之脂蛋白導出至反應體系外。
(2)之包括3個步驟之方法之詳情如下所述。
於第1步驟中，將CM、VLDL、LDL等測定對象以外之脂蛋白導出至反應體系外。其結果為，於第2步驟以後之步驟中包括含ApoE之HDL及缺乏ApoE之HDL之次組分HDL在內的HDL發生反應。即，使膽固醇酯酶與受檢試樣反應，使所生成之膽固醇於膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶等膽固醇反應酶之存在下反應並導出至反應體系外。此時，亦可於對欲導出至反應體系外之脂蛋白具有反應性的特定界面活性劑之存在下發生反應。
此處，所謂將脂蛋白之膽固醇導出至反應體系外係指以使CM、VLDL及LDL及測定對象以外之次組分HDL等脂蛋白中所含之膽固醇不會對作為測定對象之HDL-C或次組分HDL-C之定量造成影響之方式，使上述脂蛋白中所含之膽固醇消去、凝聚，或加以抑制以使其於其後之步驟中不反應。
所謂消去係指使受檢試樣中之脂蛋白膽固醇分解，使其分解物於其後之步驟中不被檢測出。作為用以將脂蛋白膽固醇消去之方法，可列舉使膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶作用於脂蛋白膽固醇而產生過氧化氫並使用觸酶將所產生之過氧化氫分解為水與氧氣之方法。又，亦可使用過氧化酶使所產生之過氧化氫與氫供與體反應而轉化為無色醌，但並不限定於該等。
又，亦有脂蛋白被封阻而不與酶反應之情形，於此情形時亦將脂蛋白之膽固醇導出至反應體系外。此處，所謂封阻係指界面活性劑等與脂蛋白結合(保護)而不再發生酶與脂蛋白之反應。例如於(2)之方法中，LDL於第1步驟至第3步驟之任一步驟中均不反應。於此情形時亦將LDL導出至反應體系外。
於第2步驟中，於對作為測定對象之包括含ApoE之HDL及缺乏ApoE之HDL在內的HDL具有反應性之界面活性劑之存在下使膽固醇酯酶與受檢試樣反應。使所產生之膽固醇於膽固醇氧化酶或膽固醇脫 氫酶等膽固醇反應酶之存在下反應，使所產生之過氧化氫轉化為醌色素，藉由吸光度測定對醌色素進行測定，藉此可利用酶定量測定對象。
根據所使用之界面活性劑之濃度，界面活性劑對缺乏ApoE之HDL及含ApoE之HDL之反應性有所不同。例如，如實施例1所示，於界面活性劑為低濃度(最終濃度0.05~0.10%)之情形時，對缺乏ApoE之HDL之反應性較高，但對含ApoE之HDL之反應性較低。另一方面，於界面活性劑濃度為高濃度(0.15~0.75%)之情形時，不僅對缺乏ApoE之HDL而且對含ApoE之HDL亦表現出反應性。因此，於以上述低濃度之範圍使用界面活性劑之情形時，可僅使缺乏ApoE之HDL反應，而僅定量缺乏ApoE之HDL-C。此處，所謂界面活性劑之最終濃度，於各步驟中係指該步驟中所添加之試劑添加完畢時之整個反應體系中之界面活性劑之濃度。例如，於上述(2)之方法中，於第1步驟中添加180 μl之第1試劑及數μl之試樣，於第2步驟中添加60 μl之第2試劑，於第3步驟中添加60 μl之第3試劑，且第2試劑中含有D1%之界面活性劑，第3試劑中含有D2%之界面活性劑之情形時，添加完第2試劑時之第2步驟中之界面活性劑最終濃度可以(D1×1/4)%表示，添加完第3試劑時之第3步驟中之界面活性劑之最終濃度可以{(D1×1/4)×4/5+D2×1/5}%表示。又，於上述之(3)之方法中，於第1步驟中添加180 μl之第1試劑及數μl之試樣，於第2步驟中添加60 μl之第2試劑，且第1試劑中含有D3%之界面活性劑，第2試劑中含有D4%之界面活性劑之情形時，添加完第1試劑時之第1步驟中之界面活性劑最終濃度可以D3%表示，添加完第2試劑時之第2步驟中之界面活性劑之最終濃度可以{(D3×3/4)+D4×1/4}%表示。
於第3步驟中，於以上述高濃度之範圍使用界面活性劑之情形時，可使含ApoE之HDL反應，而定量含ApoE之HDL-C。此時，於第2 步驟中僅對缺乏ApoE之HDL-C進行反應，根據缺乏ApoE之HDL-C之量而產生過氧化氫，生成醌色素。於在第3步驟中使用高濃度之界面活性劑之情形時，使含ApoE之HDL反應，根據含ApoE之HDL-C之量進而產生過氧化氫，生成醌色素。可將相對於第2步驟的第3步驟中所確認到之藉由含ApoE之HDL-C之反應而生成之醌色素之吸光度增加部分作為含ApoE之HDL-C而加以定量。又，可藉由累加第2步驟及第3步驟兩步驟之藉由界面活性劑與缺乏ApoE之HDL-C及含ApoE之HDL-C之反應而生成之醌色素之吸光度增加部分而定量包括缺乏ApoE之HDL-C及含ApoE之HDL-C在內的總HDL-C。
如此，為了特異性地測定缺乏ApoE之HDL-C及含ApoE之HDL-C，可於使缺乏ApoE之HDL-C、含ApoE之HDL-C反應並定量之步驟之前，加入將CM、VLDL、LDL等測定對象以外之脂蛋白導出至反應體系外之步驟。該方法中，於第1步驟中將HDL以外之脂蛋白導出至反應體系外，於第2步驟中發生缺乏ApoE之HDL-C之反應，於第3步驟中發生含ApoE之HDL-C之反應。可根據第2步驟中之吸光度增加部分而定量缺乏ApoE之HDL-C濃度，又，可根據第3步驟中之吸光度增加部分而定量含ApoE之HDL-C濃度，進而可根據第2步驟及第3步驟中之總吸光度增加部分而定量總HDL-C濃度。
於本發明中，使用通用之自動分析裝置分別於第1步驟、第2步驟、第3步驟中使用組成不同之試劑。將第1步驟、第2步驟、第3步驟中所使用之試劑稱為第1試劑、第2試劑、第3試劑。如此，藉由使用3種試劑，以一次受檢試樣之取樣，而引起一系列反應，並測定吸光度，藉此可算出缺乏ApoE之HDL-C、含ApoE之HDL-C、及總HDL-C濃度。
作為通用之自動分析裝置，可使用日立7180、TBA200FR、AU640、BM6050等。
(3)之包括2個步驟之方法之詳情如下所述。
於第1步驟中，將含ApoE之HDL-C以外之脂蛋白中之膽固醇(CM、VLDL、LDL、缺乏ApoE之HDL-C)導出至反應體系外。上述(2)之方法中，於第1步驟中將CM、VLDL、LDL等測定對象以外之脂蛋白導出至反應體系外，但於本方法中，只要於第1步驟中進而使界面活性劑成為對缺乏ApoE之HDL-C之反應性較高之濃度範圍、即以低濃度(最終濃度0.05~0.10%)使用界面活性劑即可。即，於本方法中，將含ApoE之HDL-C以外之脂蛋白中之膽固醇導出至反應體系外。於第2步驟中測定含ApoE之HDL-C。於測定含ApoE之HDL-C時，只要與(2)之方法同樣地，以高濃度(0.15~0.75%)使用界面活性劑濃度即可。於本方法中，於第2步驟中根據含ApoE之HDL-C之量而產生醌色素，測定利用該醌色素之吸光度，藉此可定量含ApoE之HDL-C。
關於該反應，於第1步驟中使用第1試劑，於第2步驟中使用第2試劑，因此可僅利用2種試劑而測定含ApoE之HDL-C。
如上所述，於使本發明之缺乏ApoE之HDL或含ApoE之HDL之HDL次組分之膽固醇反應，進行測定或導出至反應體系外之步驟中，使用與HDL反應之界面活性劑。於使缺乏ApoE之HDL-C分解並進行定量之步驟中，較佳為以低濃度使用界面活性劑，其濃度範圍如上所述以最終濃度計為0.05~0.10%，較佳為以最終濃度計為0.075~0.10%。另一方面，於使含ApoE之HDL-C分解並進行定量之步驟中，較佳為以高濃度使用界面活性劑，其濃度範圍如上所述以最終濃度計為0.15~0.75%，較佳為以最終濃度計為0.15~0.5%。
於上述包括3個步驟之(2)之方法中，只要於第2步驟中以低濃度使用與HDL反應之界面活性劑，於第3步驟中以高濃度使用與HDL反應之界面活性劑即可。於包括2個步驟之(3)之方法中，只要於第1步 驟中以低濃度使用與HDL反應之界面活性劑，於第2步驟中以高濃度使用與HDL反應之界面活性劑即可。於包括2個步驟之(1)之方法中，只要於第1步驟中以低濃度使用，於第2步驟中以高濃度使用即可。
於本發明之方法中，使用與包括缺乏ApoE之HDL及含ApoE之HDL在內之HDL發生反應之界面活性劑。作為與HDL反應之界面活性劑，可列舉含ApoE之HDL反應率/缺乏ApoE之HDL反應率之比為0.7以上且未達1.3之界面活性劑，可較佳地列舉含ApoE之HDL反應率/缺乏ApoE之HDL反應率之比為0.8以上且未達1.2之界面活性劑。此處，界面活性劑與脂蛋白之反應性於在該界面活性劑之存在下使膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶作用於脂蛋白之情形時，可以膽固醇之反應程度為指標而進行評價。具體而言，例如可藉由使與脂蛋白反應之試劑中含有各種界面活性劑進行測定而測定該界面活性劑對脂蛋白之反應性。只要測定界面活性劑對含ApoE之HDL之反應量與界面活性劑對缺乏ApoE之HDL之反應量，求出與各試樣中之總膽固醇量之比(以下，稱為「含ApoE之HDL反應率/缺乏ApoE之HDL反應率之比」)即可。藉此可算出含ApoE之HDL反應率/缺乏ApoE之HDL反應率的比。
作為與HDL反應之界面活性劑，具體而言，作為陰離子界面活性劑，較佳為烷基苯磺酸鈉；作為非離子界面活性劑，較佳為聚氧乙烯單月桂酸酯、月桂醇烷氧基化物、聚氧乙烯月桂胺、聚氧乙烯苄基苯醚衍生物、分子量未達1700之聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段聚合物、HLB為13.0以上且未達14.5之聚氧乙烯壬基苯醚；作為兩性界面活性劑，較佳為烷基二甲基胺基乙酸甜菜鹼、烷基羧基甲基羥基乙基咪唑鎓甜菜鹼，尤佳為聚氧乙烯苄基苯醚衍生物。
作為具體之界面活性劑之例子，作為陰離子界面活性劑，可列舉：New Rex Soft 60-N、New Rex Powder F、New Rex Paste H(以上為日本油脂公司製造)，Neopelex No.1-F、Neopelex G-65、Emal NC- 35(以上為花王公司製造)；作為非離子界面活性劑之例子，可列舉：Adekatol LB70、Adekatol LB-103、Adekatol LB-93(以上為旭電化公司製造)，Dispanol K-3、Nonion L-4、Nonion MN-811、Nonion NS-210、Nonion NS-212、Nymeen L-202、Puronon 102、Puronon 204(以上為日本油脂公司製造)，Nonipol 85、Nonipol 95、Nonipol 100、Nonipol 120(以上為三洋化成公司製造)，Emulgen B66(花王)；作為兩性界面活性劑之例子，可列舉：Amphitol 24B(花王公司製造)，Nissananon BF、Nissananon GLM-R-LV、Nissananon LG(以上為日本油脂公司製造)等。
其中，Emulgen B66等為聚氧乙烯苄基苯醚衍生物。
於本發明之方法中，為了測定受檢試樣中之HDL次組分之膽固醇，如上述之方法(2)或(3)般，最初藉由將HDL以外之脂蛋白消去，而將其導出至反應體系外。作為將HDL以外之脂蛋白消去之方法，可列舉使用觸酶之方法、及形成無色醌之方法。即，於不存在作用於HDL之界面活性劑之情況下，使膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶作用於受檢試樣，將所產生之源自HDL以外之脂蛋白的過氧化氫去除。藉由膽固醇酯酶之作用，使脂蛋白中之酯型膽固醇水解而生成游離型膽固醇與脂肪酸。繼而，該生成之游離型膽固醇與原本存在於脂蛋白中之游離型膽固醇於膽固醇氧化酶之作用下被氧化而生成膽甾烯酮(cholestenone)與過氧化氫。將該生成之過氧化氫去除，藉此可將脂蛋白消去。作為將過氧化氫去除之方法，可列舉：使觸酶作用於過氧化氫而使其分解為水與氧的方法、及藉由過氧化酶之作用而與例如DAOS(N-乙基-N-(2-羥基磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺)之類的與過氧化氫反應而生成無色醌的酚系或苯胺系氫供與體化合物進行反應從而將過氧化氫轉化為無色醌的方法等，但並不限定於該等。
於將HDL以外之脂蛋白導出至反應體系外之步驟中，只要於不存 在作用於HDL之界面活性劑之情況下進行即可。藉此，HDL幾乎不反應，僅LDL、VLDL-CM等脂蛋白發生反應，僅使LDL、VLDL-CM等其他脂蛋白中之膽固醇消去、或受到保護並導出至反應體系外。其結果為，於其後之第2步驟中，藉由使用與HDL反應之界面活性劑，可選擇性地定量總HDL或含ApoE之HDL及/或缺乏ApoE之HDL之HDL次組分中之膽固醇。
上述方法(2)及(3)之將HDL以外之脂蛋白導出至反應體系外之步驟、或將含ApoE之HDL-C以外之脂蛋白導出至反應體系外之第1步驟的反應液中之膽固醇酯酶之濃度較佳為0.2~1.0 U/ml左右，又，膽固醇氧化酶之濃度較佳為0.1~0.7 U/ml左右。進而，觸酶(catalase)之濃度較佳為40~100 U/ml左右，過氧化酶之濃度較佳為0.4~1.0 U/ml左右。又，與過氧化氫反應而生成無色醌之化合物之濃度較佳為0.4~0.8 mmol/l左右。
上述方法(2)及(3)之第1步驟之反應較佳為於pH值為5~8之緩衝液中進行，作為緩衝液，較佳為磷酸、甘胺酸、三羥甲基胺基甲烷及古德緩衝液。尤佳為作為古德之緩衝液之Bis-Tris(雙(2-羥基乙基)胺基三(羥甲基)甲烷)、PIPES(Piperazine-1,4-bis(ethanesulfonic acid)，哌-1,4-二乙磺酸)、MOPSO(3-(N-Morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid，3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸)、BES(N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid，N,N-雙(2-羥基乙基)-2-胺基乙磺酸)、HEPES(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，4-(2-羥基乙基)-1-哌乙磺酸)及POPSO(Piperazine-1,4-bis(2-hydroxypropanesulfonic acid)，哌-1,4-二羥基丙磺酸)，緩衝液之濃度較佳為10~500 mM左右。
於上述方法(2)及(3)之第1步驟中，為了提高HDL以外之脂蛋白之消去效率，亦可使反應液中含有2價金屬離子。作為2價金屬離子，可 較佳地使用銅離子、鐵離子及鎂離子，尤佳為鎂離子。2價金屬離子之濃度較佳為5~200 mM左右。例如添加氯化鎂即可。
進而，亦可於上述方法(2)及(3)之第1步驟之反應液中任意地添加脂蛋白水解酶。藉由添加該酶，尤其是VLDL中之膽固醇變得容易進行反應，故而較佳。該酶於反應液中之濃度較佳為5.0~10.0 U/ml左右。
上述方法(1)、(2)及(3)之各步驟之反應溫度適宜為25℃~40℃左右，最佳為37℃。又，反應時間宜為2~10分鐘左右。
於本發明之方法中所產生之膽固醇的利用酶之定量方法本身於該領域中眾所周知，例如可藉由與上述方法(2)及(3)之第1步驟同樣地藉由膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶之作用，由膽固醇酯及游離型膽固醇產生過氧化氫，並對所產生之過氧化氫進行定量而進行。過氧化氫之定量例如可藉由在過氧化酶之存在下與和過氧化氫反應而形成醌色素之化合物進行反應，藉由吸光度測定等來測定所生成之醌色素之量而進行。醌色素例如可藉由使用過氧化氫與4-胺基安替比林及酚系或苯胺系氫供與體而形成。
氫供與體化合物中，作為苯胺系氫供與體化合物，可列舉：N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-乙基-N-磺丙基-3-甲氧基苯胺(ADPS)、N-乙基-N-磺丙基苯胺(ALPS)、N-乙基-N-磺丙基-3,5-二甲氧基苯胺(DAPS)、N-磺丙基-3,5-二甲氧基苯胺(HDAPS)、N-乙基-N-磺丙基-3,5-二甲基苯胺(MAPS)、N-乙基-N-磺丙基-3-甲基苯胺(TOPS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺(ADOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)苯胺(ALOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)及N-磺丙基苯胺(HALPS)等。
生成醌色素之化合物之濃度並無特別限定，相對於反應混合物整體，例如若為4-胺基安替比林，較佳為0.1~2.0 mM，進而較佳為0.5~1.5 mM，若為酚系或苯胺系氫供與體化合物，較佳為0.5~2.0 mmol/L。又，過氧化酶之濃度並無特別限定，相對於反應混合物整體，較佳為0.4~5 U/ml。再者，形成醌色素之步驟之較佳反應條件(反應溫度、反應時間、緩衝液、pH值)與將HDL以外之脂蛋白導出至反應體系外之步驟、或將含ApoE之HDL-C以外之脂蛋白導出至反應體系外之步驟的較佳反應條件相同。
再者，於將HDL以外之脂蛋白導出至反應體系外之步驟、或將含ApoE之HDL-C以外之脂蛋白導出至反應體系外之步驟中，於利用觸酶使所產生之過氧化氫分解之情形時，需要在其後之形成醌色素之步驟中抑制該觸酶，因此於第2步驟中使用例如疊氮化鈉之類的觸酶抑制劑來抑制觸酶。
[實施例]
以下，基於實施例具體地說明本發明，但本發明並不限定於下述實施例。再者，於下述例中，「%」只要無特別說明則表示「重量%」。
實施例1
為了確認HDL次組分測定中之界面活性劑濃度之效果，而製備具有下述之組成之試劑。
第1試劑
氯化鎂 10 mmol/l
第2試劑
使用使第2試劑中之界面活性劑濃度於0.2~3.0%之範圍內變動之試劑測定包含缺乏ApoE之HDL-C濃度141.8 mg/ml之高HDL-C試樣(總HDL-C為195.8 mg/ml)，測定對缺乏ApoE之HDL之反應性。於試樣2.4 μl中混合第1試劑180 μl，於37℃下反應5分鐘後，使第2試劑60 μl於37℃下反應5分鐘，設為主波長/副波長=600 nm/700 nm而測定吸光度差，根據校準曲線求出膽固醇濃度。反應液中之界面活性劑之最最終濃度為0.05~0.75%。作為比較對照，使用可不測定含ApoE之HDL-C而僅測定缺乏ApoE之HDL-C之磷鎢酸-硫酸葡聚糖-鎂沈澱法(PT-DS-Mg法)(BIOCHEMICAL MEDICINE AND METABOLIC BIOLOGY 46,329-343(1991))測定相同之試樣。
於因所使用之試樣之容積相對於試劑之容積為微量而忽略試樣之容積之情形時，第1試劑與第2試劑之容積比為3：1。因此，添加完包含C1%之界面活性劑之第2試劑時之界面活性劑之最終濃度成為C1×1/4%。於本實施例中，由於第2試劑中之濃度為0.2~3.0%，故而最終濃度成為0.05~0.75%。
將結果示於圖1。圖1係以偏差%表示相對於界面活性劑之最最終濃度之結果。偏差%可根據(實施例測定值-基準法測定值)/基準法測 定值×100而求出。
如圖1所示，於第2試劑中之界面活性劑濃度為0.2~0.4%(最終濃度0.05~0.10%)之情形時，於HDL-C高值檢體中相對於PT-DS-Mg法之測定值之偏差%成為±2%以內。相對於此，於第2試劑之界面活性劑濃度為0.6~3.0%(最終濃度0.15~0.75%)時測定值上升，得知與缺乏ApoE之HDL-C以外之HDL次組分(含ApoE之HDL-C)反應。
實施例2
試劑或其他條件係設定為與實施例1相同，作為比較對照法，使用可測定包括含ApoE之HDL-C在內之總HDL-C之13%PEG法(J Lipid Research 38,1204-16：1997)而測定高HDL-C試樣(總HDL-C為195.8 mg/ml)。
將結果示於圖2。圖2係以偏差%表示相對於界面活性劑之最終濃度之結果。
如圖2所示，於第2試劑中之界面活性劑濃度為0.2~0.4%(最終濃度0.05~0.08%)之情形時，於HDL-C高值檢體中相對於13%PEG法之測定值之偏差%成為-2%以下。相對於此，於第2試劑之界面活性劑濃度為0.6~3.0%(最終濃度0.15~0.75%)時測定值上升，相對於13%PEG法之測定值之偏差%成為±2%以內。由此得知於高濃度之界面活性劑之存在下與包括含ApoE之HDL-C在內之總HDL-C反應。
實施例3
作為第1步驟(添加第1試劑)即將HDL以外之脂蛋白導出至反應體系外之步驟、第2步驟(添加第2試劑)即測定缺乏ApoE之HDL-C之步驟、第3步驟(第3試劑添加)即測定含ApoE之HDL-C之步驟所使用之試劑，製備以下之試劑。
第1試劑
BES緩衝液 pH值為7.0 100 mmol/l
第2試劑
第3試劑
使用日立7180作為分析裝置，於試樣2.4 μl中混合第1試劑180 μl，於37℃下反應5分鐘後，使第2試劑60 μl於37℃下反應5分鐘，其後使第3試劑60 μl於37℃下反應5分鐘。設為主波長/副波長=600 nm/700 nm並將測光點設為缺乏ApoE之HDL-C：△22-8、含ApoE之HDL-C：△27-22、總HDL-C：△27-9而測定吸光度差，再乘以根據校準求出之因數而算出膽固醇濃度(mg/dL)。作為比較對照法，利用PT-DS-Mg法作為缺乏ApoE之HDL-C測定法，利用13%PEG法作為包括含ApoE之HDL-C在內之總HDL-C測定法而進行測定。含ApoE之HDL-C可藉由自13%PEG法減去PT-DS-Mg法而算出。試樣係使用HDL-C濃度不同之人血清。
添加完第2試劑時之反應液中之界面活性劑之最終濃度為0.2×1/4=0.05%，添加完第3試劑時之反應液中之界面活性劑之最終濃度為 0.05×4/5+1.0×1/5=0.24%。
將結果示於圖3。圖3表示藉由本發明之方法而測定之值與13%PEG沈澱法(a)、PT-DS-Mg沈澱法(b)、13%PEG沈澱法與PT-DS-Mg之差值(c)之間的相關性。
如圖3a~c所示，藉由本發明法求出之缺乏ApoE之HDL-C、含ApoE之HDL-C、總HDL-C與比較對照法分別表現出良好之相關性(y=x+0.5，r=0.999；y=x+0.4，r=0.991；y=x+3.0，r=0.999)。
實施例4
作為第1步驟(添加第1試劑)即將含ApoE之HDL以外之脂蛋白導出至反應體系外之步驟、第2步驟(添加第2試劑)即測定含ApoE之HDL-C之步驟中所使用之試劑，製備以下之試劑。
第1試劑
第2試劑
本發明中之測定條件係設定為與實施例1相同。即，於試樣2.4 μl 中混合第1試劑180 μl，於37℃下反應5分鐘後，使第2試劑60 μl於37℃下反應5分鐘，設為主波長/副波長=600 nm/700 nm而測定吸光度差，根據校準曲線求出膽固醇濃度。作為比較對照法，含ApoE之HDL-C係藉由自13%PEG法減去PT-DS-Mg法而算出含ApoE之HDL-C濃度。試樣係使用HDL-C濃度不同之人血清。
添加完第1試劑時之反應液中之界面活性劑之最最終濃度為0.067%(因試樣之容積較小故而忽略)，添加完第2試劑時之反應液中之界面活性劑之最最終濃度為0.067×4/5+1.0×1/5=0.254%。
將結果示於圖4。圖4係表示針對HDL試樣藉由本發明之實施例4之方法進行測定之情形時與13%PEG沈澱法和PT-DS-Mg之差值的相關性。
如圖4所示，藉由本發明法求出之含ApoE之HDL-C與比較對照法表現出良好之相關性(y=x+1.4，r=0.984)。
將本說明書中所引用之全部刊物、日本專利及日本專利申請案直接作為參考而併入本說明書中。

Claims (7)

  1. 一種缺乏ApoE之HDL中之膽固醇之定量方法，其係於受檢試樣中以最終濃度為0.05~0.10%之濃度添加包含聚氧乙烯苄基苯醚衍生物之界面活性劑，使膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶作用，對所產生之過氧化氫進行定量，藉此以利用酶之方式分別定量缺乏ApoE之HDL中之膽固醇。
  2. 一種含ApoE之HDL中之膽固醇之定量方法，其係於受檢試樣中以最終濃度成為0.15~0.75%之方式添加包含聚氧乙烯苄基苯醚衍生物之界面活性劑，使膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶作用，對所產生之過氧化氫進行定量，藉此以利用酶之方式分別定量含ApoE之HDL中之膽固醇。
  3. 一種HDL中之膽固醇之定量方法，其係於受檢試樣中以最終濃度為0.05~0.10%之濃度添加包含聚氧乙烯苄基苯醚衍生物之界面活性劑，使膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶作用，對所產生之過氧化氫進行定量，而以利用酶之方式分別定量缺乏ApoE之HDL中之膽固醇，繼而以最終濃度成為0.15~0.75%之方式添加包含聚氧乙烯苄基苯醚衍生物之界面活性劑，使膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶作用，對所產生之過氧化氫進行定量，藉此以利用酶之方式分別定量含ApoE之HDL中之膽固醇。
  4. 一種測定HDL次組分中之膽固醇之方法，其包括：(i)將受檢試樣中之HDL以外之脂蛋白中之膽固醇導出至反應體系外的步驟，(ii)藉由如請求項1之方法分別定量缺乏ApoE之HDL中之膽固醇，(iii)進而藉由如請求項2之方法以利用酶之方式分別定量含ApoE之HDL中之膽固醇。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其係根據藉由如請求項1之方法 所獲得之缺乏ApoE之HDL中之膽固醇之定量值及藉由如請求項2之方法所獲得之含ApoE之HDL中之膽固醇之定量值而定量總HDL-膽固醇。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其係利用通用之自動分析裝置藉由1次取樣同時定量缺乏ApoE之HDL中之膽固醇、含ApoE之HDL中之膽固醇、及總HDL-膽固醇。
  7. 一種含ApoE之HDL中之膽固醇之定量方法，其係於受檢試樣中以最終濃度為0.05~0.10%之濃度添加包含聚氧乙烯苄基苯醚衍生物之界面活性劑，使膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶作用，將所產生之過氧化氫消去，藉此將含ApoE之HDL以外之HDL中之膽固醇導出至反應體系外，繼而以最終濃度成為0.15~0.75%之方式添加包含聚氧乙烯苄基苯醚衍生物之界面活性劑，使膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶作用，對所產生之過氧化氫進行定量，藉此定量含ApoE之HDL中之膽固醇。
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