TW201336996A - 高密度脂蛋白３中的膽固醇之定量方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種無需繁瑣之操作而定量受檢試樣中之HDL3之方法。高密度脂蛋白3中的膽固醇之定量方法包括對受檢試樣，使與高密度脂蛋白3特異性地反應之界面活性劑進行反應而定量膽固醇，且上述界面活性劑係選自由聚氧乙烯多環苯醚及聚氧乙烯苯乙烯化苯醚所組成之群中之至少一種。

Description

高密度脂蛋白3中的膽固醇之定量方法

本發明係關於一種高密度脂蛋白3(以下，有時稱為「HDL(High Density Lipoprotein)3」)中的膽固醇(以下，有時將HDL3中的膽固醇稱為「HDL3膽固醇」或「HDL3-C」)之定量方法。

由於高密度脂蛋白(HDL)膽固醇自包括動脈硬化血管壁在內之各組織接收膽固醇，故而與堆積於細胞內之膽固醇之去除作用相關，因此，亦被稱為膽固醇逆轉運系統。已知其與冠狀動脈硬化等動脈硬化疾病負相關，且已知HDL為低值係作為異常血脂症之一而設置有低值極限，可用作動脈硬化之指標。

HDL包含缺輔基蛋白(apoprotein)與磷脂質、膽固醇、中性脂肪。HDL之比重為d=1.063~1.210 g/mL，進而可分為d=1.063~1.125 g/mL之HDL2與d=1.125~1.210 g/mL之HDL3兩種組分。根據脂蛋白之分佈曲線，於d=1.125部分確認到凹口，自此將比重較重之部分設為HDL3。又，亦存在根據HDL中之缺輔基蛋白中載脂蛋白E含量差而將載脂蛋白E之含量較多之HDL設為富Apo E之HDL(富載脂蛋白E之HDL)的亞組分之劃分方式。

已知不僅以往之HDL蛋白整體，HDL2及HDL3各者之亞組分亦顯示出不同之功能。已知於臨床中，HDL會因CETP(Cholesteryl Ester Transfer Protein，膽固醇酯轉運蛋白)缺失而未 代謝成低密度脂蛋白(LDL，Low Density Lipoprotein)或中密度脂蛋白(IDL，Intermediate Density Lipoprotein)，而使HDL膽固醇量增加。因CETP缺損而增加之HDL為HDL2。一般認為HDL2具有抗動脈硬化作用。又，亦認為富Apo E之HDL會因CETP缺損而上升，且亦認為富Apo E之HDL之膽固醇奪取能力較強，具有抗血小板作用，於HDL之中為更佳者。又，HDL3會因肝性脂酶活性之降低而未轉化成HDL2，而使HDL3增加。已教示有由HDL3之增加而引起冠狀動脈疾病之發病率之增加。根據該等傾向可預想，分別測定HDL亞組分有助於判斷動脈硬化疾病之有無或原因。又，目前，各製造商基於該等HDL亞組分之功能，正進行抑制CETP之功能，減少LDL膽固醇量，增加HDL膽固醇量之治療藥的開發。

確立HDL亞組分之簡便之測定方法有可能牽涉到詳細功能之闡明、或該等治療之效果。

作為迄今為止已知作為HDL亞組分之測定法者，已知有超離心法、高效液相層析法(HPLC，High Performance Liquid Chromatography)、HDL3沈澱法(專利文獻1)、核磁共振(NMR，Nuclear Magnetic Resonance)法等。

超離心為藉由離心利用脂蛋白之比重之差而進行區分的方法，有作業必需熟練、費時、且費用亦昂貴之缺點。於岡崎等人之使用HPLC之區分HDL2與HDL3之方法中，作業需要時間，且需要特別之設備。HDL3沈澱法為利用包含二價金屬離子及硫酸葡聚糖之試劑使除HDL3以外之成分凝聚，藉由離心而回收上清液部分之HDL3，並利用自動分析裝置進行測定之方法。同樣地，有作業必需熟練、且為人工法、亦需要樣品之預處理操作、直至測定耗費某種程度之時間 等缺點而並不通用。又，NMR法為藉由磁共振而測量脂蛋白之粒子數之方法，但需要特殊機械而並不普遍。

再者，存在HDL亞組分之分析方法(專利文獻2)。其雖可利用通用自動分析裝置進行測定，但利用藉由使用界面活性劑而抑制HDL3以外之脂蛋白不受酵素之作用的方法，有於HDL3反應中存在目標以外之脂蛋白質而對測定造成影響之虞，或者有於無法完全抑制之情形時測定到HDL3以外之脂蛋白之虞。

故認為需要簡便且可進一步選擇性地定量膽固醇量之試劑之發明來代替此種方法。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本專利特開2009-207463號公報

[專利文獻2]日本專利特開2001-346598號公報

本發明之目的在於提供一種無需繁瑣之操作而定量受檢試樣中之HDL3之方法。

本申請案發明者等人進行努力研究，結果發現與HDL3特異性地反應之界面活性劑。並且思及藉由使受檢試樣與此種界面活性劑反應並定量膽固醇，可定量受檢試樣中之HDL3膽固醇，於實驗方面確認其可行，從而完成本發明。

即，本發明提供一種高密度脂蛋白3中的膽固醇之定量 方法，其包括對受檢試樣，使與高密度脂蛋白3特異性地反應之界面活性劑進行反應而定量膽固醇，且上述界面活性劑係選自由聚氧乙烯多環苯醚及聚氧乙烯苯乙烯化苯醚所組成之群中之至少一種。

根據本發明，可無需超離心或預處理等繁瑣之作業而利用自動分析裝置特異性地定量受檢試樣中之HDL3膽固醇。又，亦可根據藉由先前技術之受檢體中HDL總膽固醇定量法而獲得之總HDL膽固醇量，算出HDL3膽固醇量之差，藉此定量HDL2膽固醇量。

圖1係表示本發明之實施例3中進行之利用本發明所求出之HDL3膽固醇與利用沈澱法所求出之HDL3膽固醇之相互關係的圖。

圖2係表示本發明之實施例3中進行之根據利用本發明所求出之HDL3膽固醇與總HDL膽固醇並藉由計算而求出之HDL2膽固醇、與根據利用沈澱法所求出之HDL3膽固醇與總膽固醇並藉由計算而求出之HDL2膽固醇的相互關係之圖。

圖3係表示本發明之實施例4中進行之利用本發明所求出之HDL3膽固醇與利用超離心法所求出之HDL3膽固醇之相互關係的圖。

圖4係表示於本發明之實施例4中進行之根據利用本發明所求出之HDL3膽固醇與總HDL膽固醇並藉由計算而求出之HDL2膽固醇、與利用超離心法求出之HDL2膽固醇之相互關係的圖。

作為供至本發明之方法之受檢試樣，只要為欲定量該試樣中之HDL3膽固醇者，則並無特別限定，較佳為血清或血漿或該等 之稀釋物，尤佳為血清或其稀釋物。

於本發明之方法中，對受檢試樣使與HDL3特異性地反應(幾乎不與HDL3以外之脂蛋白反應)之界面活性劑反應。作為與HDL3特異性地反應之界面活性劑，為包含聚氧乙烯苯乙烯化苯醚及聚氧乙烯多環苯醚之至少1種。

更具體而言，作為聚氧乙烯多環苯醚，可列舉：Newcol-610(商品名，日本乳化劑公司製造，以下，公司名為製造公司，一併記載有公司名者均為商品名)、Newcol-710(日本乳化劑)；作為聚氧乙烯苯乙烯化苯醚，可列舉：Adekatol PC-10(Adeka)、Blaunon DSP-12.5(青木油脂)、Blaunon TSP-16(青木油脂)、Noigen EA-137(第一工業製藥)、Noigen EA-157(第一工業製藥)。該等界面活性劑可單獨使用，亦可組合兩種以上而使用。

於本發明中，於對界面活性劑使用「反應」之用語時，係指界面活性劑使酵素容易對脂蛋白質產生作用以將其導出反應系統外，或者以酵素無法對脂蛋白產生作用之方式進行保護。

界面活性劑之濃度較佳為0.01~5.0%(w/v)，更佳為0.05~3.0%(w/v)。

於本發明之方法中，藉由上述界面活性劑之反應而定量膽固醇。膽固醇之定量方法本身眾所周知，可採用周知之任一種方法，於下述實施例中亦具體進行記載。例如，對脂蛋白中之酯型膽固醇使用膽固醇酯酶進行水解，產生游離型膽固醇與脂肪酸，使用膽固醇氧化酶使所產生之游離型膽固醇與原本存在於脂蛋白中之游離膽固醇產生膽甾烯酮(cholestenone)與過氧化氫，並使其於過氧化酶之存在下形成醌色素而進行定量。作為產生醌色素之化合物，例如可列舉： HDAOS(N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline，N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺)、DAOS(N-ethyl-N-(-2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline sodium，N-乙基-N-(-2-羥基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺鈉)或TOOS(N-ethyl-N(-2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methyl aniline sodium dihydrate，N-乙基-N(-2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉二水合物)與4-胺基安替比林，只要為可產生醌色素之組合，則並不限定於該等。於在下述前期步驟中使用膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶之情形時，於本發明之步驟(使HDL3特異性界面活性劑反應之步驟)中，可直接使用前期步驟中使用之膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶，無需重新添加。

關於產生醌色素之化合物之濃度，例如若為TOOS，則濃度較佳為0.5~3.0 mmol/L左右，若為4-胺基安替比林，則較佳為0.1~2.0 mmol/L，又，過氧化酶之濃度較佳為0.4~5.0 U/mL。

可於反應液中使用通常之生物化學反應所使用之各種緩衝液，較佳係pH值為5~8之間。作為溶液，較佳為Good's、三羥甲基胺基甲烷、磷酸、甘胺酸之緩衝溶液，較佳為屬於Good's緩衝液之雙(2-羥基乙基)亞胺基參(羥基乙基)甲烷(Bis-Tris)、哌-1,4-雙(2-乙磺酸)(PIPES，piperazine-1,4-bis(2-ethane sulfonic acid))、哌-1,4-雙(2-乙磺酸)倍半鈉鹽一水合物(PIPES1.5Na)、2-羥基-3-啉基丙磺酸(MOPSO，2-hydroxy-3-morpholinopropane sulfonic acid)、N,N-雙(2-羥基乙基)-2-胺基乙磺酸(BES，N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethane sulfonic acid)、2-[4-(2-羥基乙基)-1-哌基]乙磺酸(HEPES，2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethane sulfonic acid)及哌-1,4-雙(2-羥基-3-丙磺酸)(POPSO，piperazine-1,4-bis(2-hydroxy-3-propane sulfonic acid)。

反應溫度較佳為25~40℃左右，進而較佳為35~38℃，最佳為37℃。反應時間並無特別限定，通常為2~10分鐘左右。

本發明之方法亦可直接使受檢試樣與上述界面活性劑反應而進行，但若先進行使HDL或HDL3中的膽固醇以外之膽固醇轉移至反應系統外之前期步驟，並對該前期步驟後之試樣進行上述本發明之方法，則可更正確地定量HDL3膽固醇，因此較佳。

上述前期步驟較佳係於與HDL以外之脂蛋白反應之界面活性劑、或與HDL3以外之脂蛋白反應之界面活性劑之存在下進行。

作為與HDL以外或HDL3以外之脂蛋白反應之界面活性劑，可列舉：聚氧乙烯去水山梨醇衍生物、聚氧乙烯-聚氧丙烯縮合物、聚氧乙烯硬脂醯胺等非離子界面活性劑；醯胺醚硫酸鹽、聚氧乙烯烷基醚硫酸鈉等陰離子界面活性劑；椰子油脂肪酸-醯胺丙基二甲基-胺基乙酸甜菜鹼、烷基二甲基-胺基乙酸甜菜鹼、月桂基甜菜鹼等兩性界面活性劑；以及月桂基三甲基氯化銨般之陽離子界面活性劑，但並不限定於該等。

更具體而言，作為與HDL以外或HDL3以外之脂蛋白反應之界面活性劑之例，作為非離子界面活性劑，可列舉：屬於聚氧乙烯去水山梨醇單油酸酯之非離子OT-221(日油)，屬於聚氧乙烯-聚氧丙烯縮合物之Pluronic F68(Adeka)、Pluronic F88(Adeka)、Pluronic F127(Adeka)、Pluronic P103(Adeka)、Pluronic P123(Adeka)，屬於聚氧乙烯硬脂醯胺之Nymeen S210(日油)、Emulgen A500(花王)；作為陰離子界面活性劑，可列舉：屬於醯胺醚硫酸鹽之Sunamide CF-10(日油)、聚氧乙烯烷基醚硫酸鈉之Levenol WX(花王)；作為兩性界面活性劑， 可列舉：屬於椰子油脂肪酸-醯胺丙基二甲基-胺基乙酸甜菜鹼之Nissan Anon BDF-SF(日油)，屬於烷基二甲基-胺基乙酸甜菜鹼之Nissan Anon BF(日油)，屬於月桂基甜菜鹼之Amphitol 24B(花王)；作為陽離子界面活性劑，可列舉：屬於月桂基三甲基氯化銨之Quartamin 24P(花王)。該等界面活性劑可單獨使用，亦可組合兩種以上而使用。

前期步驟中所使用之界面活性劑之濃度較佳為0.01~5.0%(w/v)，更佳為0.03~3.0%(w/v)左右。

於前期步驟中，受到界面活性劑之反應而使膽固醇轉移至反應系統外。此處，所謂「轉移至反應系統外」，係指藉由消除或保護膽固醇及其酯，而使膽固醇及其酯不參與其後之步驟。

此處，所謂「消除」，係指分解受檢試樣中之脂蛋白之膽固醇，而於其後之步驟中不對膽固醇測定之反應產生作用。作為用以消除脂蛋白膽固醇之方法，可列舉使用觸酶將使膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶起作用而產生之過氧化氫分解為水與氧氣之方法。又，亦可使用過氧化酶使供氫體與所產生之過氧化氫反應而轉化為無色醌，但並不限定於該等。消除膽固醇之方法本身於該領域中眾所周知，下述實施例中亦具體地進行記載。

所謂「保護」，係對受檢試樣中之脂蛋白以於其後之步驟中於膽固醇測定中不反應的方式進行保護。保護脂蛋白可列舉使用以膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶不產生作用之方式特異性地保護各脂蛋白之界面活性劑的方法，但並不限定於該等。

於使用藉由觸酶分解前期步驟中產生之過氧化氫之前期步驟的情形時，使用屬於觸酶之抑制劑之疊氮化鈉，並添加至第2步驟之反應液中。該情形時之疊氮化鈉之濃度通常為0.1 g/L~1.0 g/L左 右。

本申請案發明者等人進而發現，磷脂酶及/或神經鞘磷脂酶雖對脂蛋白產生作用，但幾乎不對HDL3產生作用。因此，藉由除上述界面活性劑以外，亦使磷脂酶及/或神經鞘磷脂酶(以下有時將兩者統稱為「磷脂酶等」)共存，可更正確地定量HDL3膽固醇，因此較佳。

作為磷脂酶，只要為至少對磷脂醯膽鹼產生作用者即可，較佳為磷脂酶A、磷脂酶C及磷脂酶D，尤佳為磷脂酶C及磷脂酶D。作為神經鞘磷脂酶，只要為至少對神經鞘磷脂產生作用者即可。由於磷脂酶等於市面上有售，因此可較佳地使用市售品。磷脂酶等可單獨使用，亦可組合兩種以上而使用。

磷脂酶等之最終濃度(於使用兩種以上者之情形時為其合計濃度，以下相同)較佳為0.1~100 U/mL左右，更佳為0.2~50 U/mL左右。

再者，於前期步驟中使界面活性劑共存之情形時，反應條件(反應溫度、時間、緩衝液等)亦如上所述。

前期步驟亦可藉由同時添加用以使膽固醇轉移至反應系統外之酵素系或界面活性劑，而將利用酵素之反應步驟及利用界面活性劑之反應步驟設為單一步驟而同時進行。再者，於第1步驟與第2步驟中係使用不同之界面活性劑。

於前期步驟中，於使用膽固醇酯酶及膽固醇氧化酶之情形時，膽固醇酯酶之濃度較佳為0.1~10.0 U/mL左右，更佳為0.2~3.0 U/mL左右。膽固醇氧化酶之濃度較佳為0.05~10.0 U/mL左右，更佳為0.1~1.0 U/mL左右。再者，膽固醇酯酶只要為對酯型膽固醇產生作用者，則並無特別限制，例如可使用旭化成公司製造之膽固醇酯酶 (CEBP)或東洋紡公司製造之膽固醇酯酶(COE-311、COE-312)等市售品。又，膽固醇氧化酶只要為對游離型膽固醇產生作用者，則並無特別限制，例如可使用旭化成公司製造之膽固醇氧化酶(CONII)或東洋紡公司製造之膽固醇氧化酶(COO-311、COO-321、COO-331)等市售品。

於前期步驟中，於使用過氧化酶之情形時，過氧化酶之濃度較佳為2.0~5.0 U/mL左右，進而較佳為3.0~4.0 U/mL左右。又，於使用轉化為無色醌之化合物之情形時，其濃度較佳為0.4~0.8 mmol/L左右。

前期步驟之其他條件(反應溫度、反應時間、緩衝液等)可與上述本發明之方法相同。

以下，根據實施例更具體地說明本發明。但本發明並不限定於下述實施例。

[實施例]

[實施例1]

HDL2組分與HDL3組分係以如下方式區分。使用包含HDL之受檢試樣、亦即於血清中使用有氯化鈉及溴化鈉之溶液，以藉由超離心而於HDL2與HDL3之分界線之比重(1.125)分離的方式區分，並回收各組分。

利用超離心區分CM(Chylomicron，乳糜微粒)~VLDL(Very Low Density Lipoprotein，極低密度脂蛋白)組分、LDL組分、HDL2組分、HDL3組分，使下述試劑A反應，進而，添加下述試劑B而進行測定。測定係於2 μL各組分中添加150 μL試劑A，進行5分鐘加熱反應後，添加50 μL試劑B，進而進行5分鐘加熱反應，並測定主波長600 nm、副波長700 nm之吸光度。

試劑A

試劑B

※於組合兩種以上之情形時共計為2.0 w/v%

將於添加試劑B後，經過單位時間後之各組分之吸光度變化量示於表1中。可確認對HDL3特異性地反應。

[實施例2]

利用超離心區分CM~VLDL組分、LDL組分、HDL2組分、HDL3組分，使下述試劑C反應，進而，添加下述試劑D而進行測定。測定係於2 μL各組分中添加150 μL試劑C，進行5分鐘加熱反應後，添加50 μL試劑D，進而進行5分鐘加熱反應，並測定主波長600 nm、副波長700 nm之吸光度。

試劑C

試劑D

將於添加試劑D後，經過單位時間後之各組分之吸光度變化量示於表2中。可確認對HDL3特異性地反應。

[實施例3]

使人血清試樣與上述試劑A反應，進而添加下述試劑E進行測定。測定係於2 μL血清中添加150 μL試劑A，進行5分鐘加熱反應後，添加50 μL試劑E，進而進行單位時間之加熱反應，測定主波長600 nm、副波長700 nm之吸光度而設為HDL3膽固醇，又，基於另外測定之總HDL膽固醇，藉由計算而求出HDL2膽固醇。

試劑E

將利用試劑A與試劑E求出之HDL3膽固醇與利用沈澱法(專利文獻1)求出之HDL3膽固醇之關聯示於圖1中，將根據利用試劑A與試劑E所求出之HDL3膽固醇與總HDL膽固醇並藉由計算而求出之HDL2膽固醇、與根據利用沈澱法所求出之HDL3膽固醇與總HDL膽固醇並藉由計算而求出之HDL2膽固醇的關聯示於圖2中。可確認本發明於HDL3與HDL2方面均與沈澱法有較強之相互關係。

[實施例4]

使人血清試樣與下述試劑F反應，進而，添加上述試劑E進行測定。測定係於2 μL血清中添加150 μL試劑F，進行5分鐘加熱反應後，添加50 μL試劑E，進而進行單位時間之加熱反應，測定主波長600 nm、副波長700 nm之吸光度而設為HDL3膽固醇，又，根據另外測定 之總HDL膽固醇，藉由計算而求出HDL2膽固醇。

試劑F

將利用試劑F與試劑E所求出之HDL3膽固醇與利用超離心法所求出之HDL3膽固醇的關聯示於圖3中，將根據利用試劑F與試劑E所求出之HDL3膽固醇與總HDL膽固醇並藉由計算而求出之HDL2膽固醇與利用超離心法而求出之HDL2膽固醇的關聯示於圖4中。可確認本發明於HDL3與HDL2方面均與超離心法有較強之相互關係。

Claims (1)

1. 一種高密度脂蛋白3中的膽固醇之定量方法，其包括對受檢試樣，使與高密度脂蛋白3特異性地反應之界面活性劑進行反應而定量膽固醇，且上述界面活性劑係選自由聚氧乙烯多環苯醚及聚氧乙烯苯乙烯化苯醚所組成之群中之至少一種。