WO2007052646A1 - 低密度リポ蛋白中トリグリセリドの測定方法及び測定用キット - Google Patents

低密度リポ蛋白中トリグリセリドの測定方法及び測定用キット Download PDF

Info

Publication number
WO2007052646A1
WO2007052646A1 PCT/JP2006/321730 JP2006321730W WO2007052646A1 WO 2007052646 A1 WO2007052646 A1 WO 2007052646A1 JP 2006321730 W JP2006321730 W JP 2006321730W WO 2007052646 A1 WO2007052646 A1 WO 2007052646A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
reagent
acid
ether
salt
glycerol
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/321730
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yuki Katayama
Kazuhito Miyauchi
Shizuyo Takada
Tomomi Uchida
Original Assignee
Kyowa Medex Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Medex Co., Ltd. filed Critical Kyowa Medex Co., Ltd.
Priority to US12/090,906 priority Critical patent/US9360432B2/en
Priority to EP06822659A priority patent/EP1953240A4/en
Priority to JP2007542753A priority patent/JP5191236B2/ja
Publication of WO2007052646A1 publication Critical patent/WO2007052646A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/61—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving triglycerides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/9121—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases
    • G01N2333/91215—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases with a definite EC number (2.7.1.-)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
    • G01N2333/918—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring triglycerides in a low density lipoprotein in a specimen and a measurement kit.
  • HDL high density lipoprotein
  • LDL low density lipoprotein
  • VLDL very low density lipoprotein
  • CM chylomicron
  • Each lipoprotein has a different lipid composition and apoprotein type, and thus functions in the living body.
  • IDL intermediate density lipoprotein
  • IDL intermediate density lipoprotein
  • each lipoprotein is fractionated by ultracentrifugation, precipitation, or a method utilizing an immune reaction, and the triglycerides contained therein are measured.
  • a certain force Each fractionation method takes time and labor, and is very complicated.
  • Patent Document 1 A method for measuring triglycerides in LDL remaining in the second step after removing triglycerides in all lipoproteins other than L (Patent Document 1 and Patent Document 2) is known.
  • Triglycerides in VLDL CM Samples with high triglycerides are not completely removed in the first step, and the reaction is carried over to the second step, resulting in a positive effect.
  • Patent Document 1 International Publication No. 00Z43537 Pamphlet
  • Patent Document 2 International Publication No. WO2004Z087945 Pamphlet
  • Patent Document 3 International Publication No. WO00Z60112 Pamphlet
  • Patent Document 4 Special Table 2002—508519
  • An object of the present invention is to provide a simple and accurate method for measuring triglycerides in LDL and a measuring reagent.
  • the present invention relates to the following [1] to [20].
  • a method for measuring triglycerides in a low-density lipoprotein in a specimen comprising sequentially performing the following steps (i) to (iv):
  • Tellurium polyoxypropylene polyoxyalkylene alkyl phenyl ether, polyoxyethylene polycyclic phenol ether condensate, polyoxyethylene alkyl phenyl ether sulfate, polyoxyethylene polycyclic phenol ether sulfate, and HLB value of 9
  • step (ii) Removability of free glycerol in step (ii) This is enzymatic conversion of free glycerol into components other than those related to the measurement of free glycerol in step (iv) [1] or [2] The method described.
  • step (ii) Hydrogen peroxide is generated by a reagent that generates hydrogen peroxide as well as free glycerol, and the hydrogen peroxide is removed in the next step.
  • step (iv) Measuring power of free glycerol in step (iv) Free hydrogen glycerol is also generated by a reagent that generates hydrogen peroxide and hydrogen peroxide, and the hydrogen peroxide is measured in the next step.
  • the method according to any one of [1] to [5].
  • Hydrogen peroxide is measured by causing a peroxide to react with a peroxide active substance and an oxidative coloring chromogen to form a dye, and measuring the absorbance of the dye. [6] or [7].
  • Bile acid derivative power Cholic acid or its salt Taurocholic acid or its salt, Glycocholic acid or its salt, Lithocholic acid or its salt, Deoxycholic acid or its salt, Kenodeoxycholic acid or Its salt, ursodeoxycholic acid or its salt, 7-oxolithocholic acid or its salt, 12-oxolithocholic acid or its salt, 12-oxokenodeoxycholic acid or its salt, 7-oxodeo Xicholic acid or salt thereof, hyocholic acid or salt thereof, hydroxycholic acid or salt thereof, deoxycholic acid or salt thereof, general formula (I)
  • R 1 is a 3- (3-colamidopropyl) dimethylammonium group, and R 2 is a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • the hydrogen peroxide removing reagent is a reagent containing a combination of catalase or one of oxidatively coupled chromogens and a peracid-active substance.
  • the free glycerol measurement reagent is a reagent containing a reagent that generates free glycerol power peroxyhydrogen and a hydrogen peroxide measurement reagent.
  • Free glycerol power Reagent power for generating peroxyhydrogen is a reagent containing glycerol kinase and glycerol 3-phosphate oxidase or a reagent containing glycerol oxidase [14] to The kit according to any one of [16].
  • the bile acid derivative is cholic acid or a salt thereof, taurocholic acid or a salt thereof, glycocholic acid or a salt thereof, lithocholic acid or a salt thereof, deoxycholic acid or a salt thereof, chenodeoxycholic acid or a salt thereof Ursodeoxycholic acid or a salt thereof, 7-oxolithocholic acid or a salt thereof, 12-oxolithocholic acid or a salt thereof, 12-oxokenodeoxycholic acid or a salt thereof, 7-oxodeoxycol Acid or salt thereof, hyocholic acid or salt thereof, hydroxycholic acid or salt thereof, deoxycholic acid or salt thereof, general formula (I)
  • R 1 is a 3- (3-colamidopropyl) dimethylammonium group
  • R 2 is a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • the triglyceride in the LDL of the present invention is measured using a sample, polyoxyethylene polyoxyalkylene polycyclic ether (hereinafter abbreviated as POE-POA polycyclic ether), polyoxypropylene polyoxyalkylene.
  • POE-POA polycyclic ether polyoxyethylene polyoxyalkylene polycyclic ether
  • Polycyclic ethers (hereinafter abbreviated as PO P—POA polycyclic ethers), polyoxyethylene alkyl ether ether formaldehyde condensates (hereinafter abbreviated as POE alkyl ether ether formaldehyde condensates) And at least one surfactant selected from the group consisting of polyoxyethylene polycyclic ethers having an HLB value of 13.0 to 17.0 (hereinafter abbreviated as POE polycyclic ether)
  • the lipotin tin lipase is allowed to act on the sample, and the free glycerol produced thereby is detected.
  • the free glycerol originally present in the body is removed, and the reaction solution after removing the free glycerol is polyoxyethylene polyoxyalkylene alkyl ether (hereinafter abbreviated as POE-POA alkyl ether), poly Oxypropylene polyoxyalkylene alkyl ether (hereinafter abbreviated as POP—POA alkyl ether), polyoxyethylene polyoxyalkylene alkyl phenyl ether (hereinafter referred to as POE—POA alkyl phenyl) Abbreviated as ether.
  • POE-POA alkyl ether polyoxyethylene polyoxyalkylene alkyl ether
  • POP—POA alkyl ether polyoxypropylene polyoxyalkylene alkyl ether
  • POE—POA alkyl phenyl polyoxyethylene polyoxyalkylene alkyl phenyl
  • POP-POA alkyl ether Polyoxypropylene polyoxyalkylene alkyl ether
  • POE polycyclic ether condensate abbreviated as POE polycyclic ether
  • POE alkyl ether ether sulfate Polyoxyethylene alkyl phenyl ether sulfate
  • POE polycyclic phenyl ether sulfate Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether sulfate
  • polyoxyethylene polyoxyalkylene group is abbreviated as POE-POA
  • polyoxypropylene polyoxyalkylene group is abbreviated as POP-POA.
  • the preferred measurement of triglycerides in LDL of the present invention is characterized in that in any reaction step, the reaction between triglycerides in VLDL in a sample and lipoprotein lipase is suppressed or not accelerated. In this way, the effect on the measured value of triglycerides derived from VLDL, which is rich in triglycerides, can be substantially avoided.
  • the preferred measurement of triglycerides in LDL of the present invention is carried out in a state where the reaction of VLDL and CM in the sample with triglycerides and lipoprotein lipase is suppressed or not accelerated in any reaction step. It is characterized by that. As a result, the influence on the measured value of triglycerides derived from VLDL and CM containing abundant triglycerides can be substantially avoided.
  • a particularly preferable method for measuring triglycerides in LDL of the present invention is to inhibit or promote the reaction between triglycerides in HDL and lipoprotein lipase, and to triglycerides and lipoproteins in LDL and VLDL. Suppresses or does not promote reaction with protein lipase, POE—POA polycyclic ether, POP—PO A polycyclic ether, POE alkylphenol ether formaldehyde condensate, and HLB value of 13.
  • a reaction solution containing one surfactant, triglyceride and free daricerol in HDL are removed, and then the reaction between triglyceride in LDL and lipoprotein lipase is not inhibited or promoted, and in VLDL Does not inhibit or promote the reaction between triglycerides and lipoprotein lipase
  • the reaction between triglycerides in HDL and lipoprotein lipase is not suppressed or promoted, and in LDL, VLDL and CM Does not inhibit or promote the reaction between triglycerides and lipoprotein lipase, POE—POA polycyclic ether, POP—POA polycyclic ether, POE alkylphenol ether formaldehyde condensate, and HLB value of 13.0
  • a reaction solution containing at least one surfactant selected from the group consisting of POE polycyclic ethers having a molecular weight of 17.0 or less triglycerides in HDL and free glycerol are removed, and then triglycerides in LDL are removed.
  • the LDL to be measured according to the present invention may be any one of a broad sense LDL whose specific gravity is classified as 1.006 to 1.063 and a narrow sense LDL whose specific gravity is classified as 1.001 to 1.063. May be, When measuring LDL in a broad sense, the specific gravity is 10 parts classified as 1.006-1.019 and part of lipoprotein particles called so-called VLDL remnants and has the same specific gravity as IDL Lipoprotein particle force is also included in the measurement target.
  • specimen used in the present invention examples include whole blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, saliva, amniotic fluid, urine, sweat, and spleen fluid, with plasma and serum being preferred.
  • the lipoprotein lipase used in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme having the ability to hydrolyze triglycerides in lipoproteins.
  • lipoprotein lipase derived from animals, plants or microorganisms, and produced by genetic engineering techniques. And lipoprotein lipase.
  • cholesterol ester hydrolase having the ability to hydrolyze triglycerides in lipoproteins is also included in the lipoprotein lipase of the present invention.
  • lipoprotein lipase chemically modified ones can also be used. Commercial products can also be used.
  • the commercially available lipoprotein lipases include cholesterol esterase "Aman 0" 3 (CHE3; Amano Enzyme), cholesterol esterase (CEBP-M; Asahi Kasei), lipoprotein lipase (LPL311; Toyobo) Lipoprotein lipase "Amano” 6 (LPL6; Amano Enzym), Lipoprotein lipase “Amano” 3 (LPL 3; Amano Enzym), EST “Amano” 2 (Amano Enzym) And lipoprotein lipase (LPBP; manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.), cholesterol esterase [COE313 (chemically modified cholesterol esterase); manufactured by Toyobo Co., Ltd.], and the like.
  • Examples of the group (chemical modification group) that modifies the enzyme over the chemical modification of lipoprotein lipase include, for example, a group mainly composed of polyethylene glycol, a group mainly composed of polypropylene glycol, and polypropylene glycol and polyethylene.
  • a group mainly composed of polyethylene glycol is preferable.
  • Examples of the water-soluble polysaccharide include dextran, pullulan, and soluble starch.
  • a reagent for chemically modifying lipoprotein lipase examples thereof include compounds having both the chemical modification group described above and a functional group or structure capable of reacting with an amino group, carboxyl group, sulfhydryl group or the like of an enzyme.
  • functional groups or structures capable of reacting with amino groups in the enzyme include carboxyl groups, active ester groups (N-hydroxysuccinimide groups, etc.), acid anhydrides, acid chlorides, aldehydes, epoxide groups, 1,3 propanthultone, 1, 4 Butane sultone.
  • the functional group or structure capable of reacting with the carboxyl group in the enzyme include an amino group.
  • the group or structure reactive with the sulfhydryl group in the enzyme include maleimide groups, disulfides, ⁇ -haloesters such as ⁇ -node esters, and the like.
  • Chemical modifiers include Sunbright VFM—4101, Sunbright ME—050AS, and Sunbright DE—030 AS (both containing polyethylene glycol as the main component and N-hydroxysuccinimide group) Manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd., Sunbright AKM series (for example, Sunbright AKM-1510, etc.) having a group mainly composed of polyalkylene glycol and an acid anhydride structure, Sunbright ADM series, Sunbright ACM series (all Nippon Oil & Fats Co., Ltd.), EPOX-3400 having a group consisting mainly of polyethylene glycol and an epoxide group, M-EPOX-5000 (both manufactured by Sheawater Polymers), a group having a chelating function and an acid anhydride structure. Examples include diethylenetriamine- ⁇ , ⁇ , ', ⁇ ',, ⁇ ', -pent
  • Chemical modification of lipoprotein lipase is not limited to this method, which can be performed by the following method, for example.
  • the enzyme is dissolved in a pH 8.0 or higher buffer solution (for example, HEPE S buffer solution), and 0.01 to 500-fold molar amount of a chemical modifier is added at 0 to 55 ° C for 5 minutes or more. Stir for 5 hours.
  • a pH 8.0 or higher buffer solution for example, HEPE S buffer solution
  • 0.01 to 500-fold molar amount of a chemical modifier is added at 0 to 55 ° C for 5 minutes or more. Stir for 5 hours.
  • the reaction solution not only the reaction solution itself but also the one obtained by removing the unreacted chemical modifier with an ultrafiltration membrane or the like, if necessary, should be used as the chemically modified enzyme. You can also.
  • the concentration of the lipoprotein lipase used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it allows the measurement of tridalylide in LDL, but a concentration of 0.01 to 40 OUZmL in the reaction solution. It is more preferable that it is 0.02 to 200 UZmL.
  • two or more lipoprotein lipases are used in combination. It ’s because of being.
  • polyoxyalkylene in the POE-POA polycyclic phenol used in the present invention examples include polyoxypropylenes other than polyoxyethylene, such as polyoxypropylene and polyoxybutylene.
  • polyoxyalkylene in the POP-POA polycyclic ether used in the present invention examples include polyoxyethylene, polyoxybutylene and the like other than polyoxypropylene.
  • the polymerization degree of polyoxyethylene oxyethylene and polyoxypropylene oxypropylene in each of POE POA polycyclic ether and POP-POA polycyclic ether is preferably 2 to 60, more
  • the degree of polymerization of the polyoxyalkylene oxyalkylene is preferably 1 to 40, and more preferably 1 to 20.
  • polymerization mode of POE-POA and POP-POA in the POE-POA polycyclic ether and POP-POA polycyclic ether used in the present invention.
  • block polymerization type The power S of the random polymerization type polymerization mode can be mentioned.
  • block polymerization type include a diblock copolymer, a triblock copolymer, and a tetrablock copolymer.
  • POE Specific examples (products) of POA polycyclic phenol ethers include, for example, -Eucol 2608F, New Coal 2600FB (both manufactured by Nippon Emulsifier Co., Ltd.), New Calgen GP 120, New Calgen CP 15- 150 ( V, the deviation is made by Takemoto Yushi Co., Ltd.).
  • the degree of polymerization of oxyethylene of polyoxyethylene in the POE alkyl furether formaldehyde condensate used in the present invention is preferably 1 to 60, and more preferably 2 to 30.
  • alkyl in the POE alkylphenol ether formaldehyde condensate include linear or branched carbon atoms having 6 to 30 carbon atoms, such as hexyl, heptyl, octyl, isooctyl, noel, decyl, undecyl, dodecyl (lauryl), tridecyl, tetradecyl.
  • Myristyl pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecyl, icosyl, henecosyl, docosinore (beheninore), tricosinole, tetracosyl, pentacosyl, hexacosyl, heptacosyl, Examples include octacosyl, nonacosyl, and triaconsil.
  • Specific examples (products) of the POE alkyl fur ether formaldehyde condensate include, for example, -KKOR R1020 (manufactured by Nikko Chemicals).
  • the degree of polymerization of oxyethylene of polyoxyethylene in the POE polycyclic ether having an HLB value of not less than 13.0 and not more than 17.0 used in the present invention is preferably 1 to 60, more preferably 2 ⁇ 30.
  • a polycyclic phenol is a group having one aromatic ring in the group (substituent), a phenyl group substituted by more than one force, and a group having two or more aromatic rings in the group (substituent). Examples thereof include one or more substituted full groups. Examples of the group having one aromatic ring in the group include benzyl and 1 (phenyl) ethyl.
  • the group having two or more aromatic rings in the group include naphthyl.
  • the PLB polycyclic ether having an HLB value of 13.0 or more and 17.0 or less is preferably 13.1 or more and 15 or less, particularly preferably 13.2 or more and 14 or less.
  • Specific examples (products) of POE polycyclic ethers having an HLB value of 13.0 or more and 17.0 or less include, for example, Emargen B66 (HLB value 13.2 manufactured by Kao Corporation), New Coal 610 (HLB Value 13.8 Nippon Emulsifier Co., Ltd., New Coal 710 (HLB value 13.6 Nippon Emulsifier Co., Ltd.), Emulgen A—90 (HLB value 14.5, Kao Corporation), BLAUNONTSP— 50 (HLB value 16.9 Aoki) (Oil & Fats Co., Ltd.), New Coal 714 (HLB value 15.0 made by Nippon Emulsifier Co., Ltd.), New Cornole 2614 (HLB value 15.0 made by Nihon Ei Liao Pharmaceutical Co., Ltd.), New Cornore 2609 (HLB value 13.0 Japan Emulsifier Co., Ltd.) And New Calgen CP120 (HLB value: 13.0, Takemoto Yushi Co., Ltd.).
  • concentration of ruether is not particularly limited as long as it enables the reaction of triglyceride in HDL, but it is preferable that the concentration in the reaction solution is 0.01 to 10%. ⁇ 5% is more preferred. In the present invention, two or more of these compounds may be used in combination.
  • Polyoxyalkylene in POE—POA alkyl ether used in the present invention examples thereof include polyoxypropylene and polyoxybutylene other than polyoxyethylene.
  • polyoxyalkylene in the POP-POA alkyl ether used in the present invention examples include polyoxyethylene, polyoxybutylene and the like other than polyoxypropylene.
  • the degree of polymerization of oxyethylene of polyoxyethylene and oxypropylene of polyoxypropylene in each of POE POA alkyl ether and POP-POA alkyl ether is preferably 2 to 60, more preferably 4 to 30.
  • the degree of polymerization of oxyalkylene of polyoxyalkylene is preferably 1 to 40, more preferably 1 to 20.
  • Examples of the alkyl in each of POE POA alkyl ether and POP-POA alkyl ether include straight-chain or branched 6 to 30 carbon atoms such as hexyl, heptyl, octyl, isooctyl, noel, decyl, Undecyl, dodecyl (lauryl), tridecyl, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecyl, icosyl, henicosyl, docosyl (veheninore), tricosine, tetracosyl, Examples include pentacosyl, hexacosyl, heptacosyl, octacosyl, nonacosyl, and triaconsil.
  • the polymerization mode of POE-POA and POP-POA in each of the POE-POA alkyl ether and POP-POA alkyl ether used in the present invention is not particularly limited.
  • block polymerization type and random polymerization type A polymerization mode is mentioned.
  • block polymerization type include diblock copolymers, triblock copolymers, and tetrablock copolymers.
  • Specific examples (products) of POE-— alkyl ether include Wandersurf S 1400, Wandersurf RL100 (V, shift is manufactured by Aoki Yushi Co., Ltd.) and the like.
  • polyoxyalkylene in the ⁇ -alkylphenol ether used in the present invention examples include polyoxypropylene and polyoxybutylene other than polyoxyethylene.
  • the POP-polyalkyl ether used in the present invention examples include polyoxyethylene, polyoxybutylene and the like other than polyoxypropylene.
  • the degree of polymerization of oxyethylene of polyoxyethylene and oxypropylene of polyoxypropylene in each of POE POA alkyl ether and POP-POA alkyl ether is preferably 2 to 60, more preferably 4 to 30.
  • the degree of polymerization of polyoxyalkylene oxyalkylene is preferably 1 to 40, more preferably 1 to 20.
  • the alkyl in each of the POE POA alkyl ether and the POP-POA alkyl ether has 6 to 30 linear or branched carbon atoms such as hexyl, heptyl, octyl, isooctyl, nonyl, decyl, Undecyl, dodecyl (lauryl), tridecyl, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecyl, icosyl, henecosyl, docosyl (beheryl), tricosyl, tetracosyl, pentacosyl Hexacosyl, heptacosyl, octacosyl, nonacosyl, triaconsil and the like.
  • polymerization mode of POE-POA and POP-POA in the POE-POA alkylphenyl ether and POP-POA alkylphenyl ether used in the present invention for example, block polymerization type, random Examples of the polymerization type are polymerization types.
  • block polymerization type include a diblock copolymer, a triblock copolymer, and a tetrablock copolymer.
  • the degree of polymerization of oxyethylene in polyoxyethylene in the POE polycyclic phenol condensate used in the present invention is preferably 1 to 60, more preferably 2 to
  • the polycyclic phenol in the POE polycyclic phenol ether condensate is a phenyl group having two or more groups (substituents) having one aromatic ring in the group, and two or more groups in the group. Examples thereof include a fullerene group in which one or more substituted groups (substituents) having an aromatic ring are substituted. Examples of the group having one aromatic ring in the group include benzyl and 1 (phenyl) ethyl. It is. Examples of the group having two or more aromatic rings in the group include naphthyl and the like.
  • Specific examples (products) of the POE polycyclic phenol ether condensate include New Calgen E150 (manufactured by Takemoto Yushi Co., Ltd.) and the like.
  • the degree of polymerization of oxyethylene in the polyoxyethylene in the POE alkylphenol sulfate used in the present invention is preferably 1 to 60, more preferably 2 to 30.
  • alkyl in the POE alkyl ether sulfate examples include linear or branched carbon atoms having 6 to 30 carbon atoms such as hexinole, heptinole, octinole, isooctinole, noninore, decyl, undecyl, dodecyl (lauryl), tridecyl, tetradecyl (Myristyl), pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecyl, icosyl, henecosyl, docosyl (beher), tricosyl, tetracosyl, pentacosyl, hexacosyl, heptacosyl, octacosyl, Nonacosyl, triaconsil and the like can be mentioned.
  • polyoxyethylene alkylphenol ether sulfate examples include NO, Itenol N08 (Daiichi Kogyo Co., Ltd.) and the like.
  • the degree of polymerization of oxyethylene in polyoxyethylene in the POE polycyclic phenol ether sulfate used in the present invention is preferably 1 to 60, more preferably 2 to 30.
  • the polycyclic phenol in the POE polycyclic phenol ether sulfate is a phenyl group in which two or more groups (substituents) having one aromatic ring in the group are substituted, and two or more groups in the group. Examples thereof include a fullerene group in which one or more substituted groups (substituents) having an aromatic ring are substituted. Examples of the group having one aromatic ring in the group include benzyl and 1 (phenyl) ethyl. Examples of the group having two or more aromatic rings in the group include naphthyl and the like.
  • POE polycyclic phenol ether sulfate examples include New Coal 707 SF (manufactured by Nippon Emulsifier Co., Ltd.).
  • POE polycyclic phenol having an HLB value of 9.0 or more and less than 13.0 used in the present invention
  • the degree of polymerization of oxyethylene of polyoxyethylene in is preferably 1 to 60, more preferably 2 to 30.
  • the polycyclic phenyl in the POE polycyclic phenol ether having an HLB value of 9.0 or more and less than 13.0 is a phenyl group in which two or more groups (substituents) having one aromatic ring in the group are substituted, Examples thereof include a full group in which one or more groups (substituents) having two or more aromatic rings in the group are substituted. Examples of the group having one aromatic ring in the group include benzyl and 1 (phenyl) ethyl.
  • the HLB value of the POE polycyclic ether having an HLB value of 9.0 or more and less than 13.0 is preferably 10 or more and 12.9 or less, particularly preferably 11 or more and 12.8 or less.
  • the polycyclic phenol in the POE polycyclic phenol ether having an HLB value of 9.0 or more and less than 13.0 is substituted with two or more groups (substituents) having one aromatic ring in the group.
  • groups (substituents) having one aromatic ring in the group include a phenyl group, a vinyl group in which one or more groups (substituents) having two or more aromatic rings in the group are substituted.
  • Examples of the group having one aromatic ring in the group include benzyl and 1 (phenyl) ethyl.
  • Examples of the group having two or more aromatic rings in the group include naphthyl.
  • Emargen A60 HLB value 12.8 manufactured by Kao Corporation
  • BLAUNON DSP12.5 H LB value 12.7 Aoki Yushi Co., Ltd.
  • BLAUNON TSP20 HLB value 12.7 Aoki Yushi Co., Ltd.
  • BLAUNON DSP—9 HLB value 11.4 Aoki Yushi Co., Ltd.
  • BLAUNON DSP-7.5 HLB value 9. 2 Aoki Yushi Co., Ltd.
  • BLAUNON TSP-16 HB value 12.7 Aoki Yushi Co., Ltd.
  • concentration of ruether sulfate, POE polycyclic phenol ether sulfate, and POE polycyclic phenol with an HLB value of 9.0 or more and less than 13.0 is a concentration that allows the reaction of triglycerides in LDL.
  • the concentration in the reaction solution is preferably 0.01 to 10%, more preferably 0.02 to 5%. In the present invention, two or more of these are combined. They can also be used together.
  • the HLB value means a hydrophilic mono-lipophilic equilibrium value.
  • the HLB value of the POE polycyclic phenyl ether used in the present invention is determined by the method described in the surfactant handbook (Tokiyuki Yoshida et al. Kogyoshosho Co., Ltd.) or the new surfactant (Hiroguchi Horiguchi Sankyo Publishing Co., Ltd.). It is possible to calculate. Further, as the HLB value, it is also possible to use the HLB value described in the catalog or pamphlet of the manufacturer of various surfactants.
  • the bile acid derivative used in the present invention is not particularly limited as long as it is a bile acid derivative capable of measuring triglycerides in LDL.
  • a bile acid derivative having an anionic surfactant activity examples include bile acid derivatives having an amphoteric surface active action, bile acid derivatives having a nonionic surface active action, and the like.
  • Examples of bile acid derivatives having an anionic surfactant include cholic acid or a salt thereof, taurocholic acid or a salt thereof, glycocholic acid or a salt thereof, lithocholic acid or a salt thereof, deoxycholic acid or a salt thereof, and kenode.
  • Examples thereof include oxodeoxycholic acid or a salt thereof, hyocholic acid or a salt thereof, hydroxycholic acid or a salt thereof, dehydrocholic acid or a salt thereof.
  • salts include ammonium salt, lithium salt, sodium salt, potassium salt, and magnesium salt.
  • bile acid derivatives having an amphoteric surfactant activity include those represented by the general formula (I)
  • R 1 is a 3- (3 colamidopropyl) dimethylammonium group, and R 2 is a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • compound (I ) is a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • CHAPS the compound (I) in which R 2 is a hydrogen atom
  • CHAPSO the compound (I) in which R 2 is a hydroxyl group
  • bile acid derivatives having nonionic surfactant activity include, for example, the general formula (II)
  • (X represents a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • R 3 and R 4 are the same or different and each represents a substituted or unsubstituted alkyl, or a substituted or unsubstituted alkanol)
  • alkyl and alkanoyl alkyl include linear or branched carbon atoms having 1 to 10 carbon atoms such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, neopentyl, and the like.
  • R 3 and R 4 are both
  • a compound which is (hereinafter referred to as substituent A) is preferred.
  • substituent A a compound in which X, R 3, and R 4 are each a hydrogen atom, substituent A, and substituent A is deoxy-BIGCHAP, and a compound in which hydroxyl group, substituent A, and substituent A are BIGCHAP!
  • the concentration of the bile acid derivative used in the present invention is not particularly limited as long as it allows the measurement of triglycerides in LDL, but the concentration in the reaction solution is preferably 0.001 to 10%. More preferably, 0.01 to 1% is more preferable. In the present invention, two or more bile acid derivatives may be used.
  • the reaction solution used in the measurement of triglycerides in LDL of the present invention is preferably a force buffer solution such as deionized water, distilled water, or buffer solution.
  • a force buffer solution such as deionized water, distilled water, or buffer solution.
  • the buffer used in the buffer include tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, and boron. Examples include acid buffers and Good's buffers.
  • Good buffering agents include, for example, 2 morpholinoethanesulfonic acid (MES), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), N- (2-acetamido) iminonic acid (ADA), piperazine 1 N, N, 1 bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPE S), N— (2 acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES), 3-morpholino 1 2-hydroxypropanesulfone Acid (MOPSO), N, N bis (2-hydroxyethyl) 2 aminoethanesulfonic acid (BES), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), N- [tris (hydroxymethyl) methyl] 2 aminoethanesulfonic acid (TES), 2- [4- (2-Hydroxyethyl) 1-piperadyl] ethanesulfonic acid (HEPES), 3- [N, N bis
  • TAPS N cyclohexyl 2 Aminoethanesulfonic acid
  • CHES N-cyclohexyl 3 Amino 2 hydroxypropane sulfonic acid
  • CAPSO propanesulfonic acid
  • the concentration of the buffer solution is not particularly limited as long as it is suitable for measurement, but is preferably 0.001 to 2. Omol /! L force, more preferably 0.005 to 1. Omol /: L force ⁇ ! / ⁇ .
  • the reaction solution is mixed with POE-POAT alkyl ether, POP-POA alkyl ether, POE-POA alkylphenol, POP-POA alkylphenol ether, POE Selected from the group consisting of a polycyclic phenol ether condensate, a POE alkyl phenyl ether sulfate, a POE polycyclic phenol ether sulfate, and a POE polycyclic ether having an HLB value of 9.0 or more and less than 13.0 Allowing lipoprotein lipase to act to produce free glycerol in the presence of at least one surfactant;
  • the reaction temperature of the reaction in each step is, for example, 10 to 50 ° C, preferably 20 to 40 ° C, and the reaction time is 1 to 20 minutes, preferably 2 to: L0 minutes. .
  • Step (i) and step (ii), and step (iii) and step (iv) can also be performed simultaneously.
  • step (ii) the free glycerol present in the reaction solution is removed by enzymatic conversion of free daricerol into components other than those related to the measurement of free glycerol produced in step (iv). It can be carried out.
  • a person skilled in the art can appropriately select the method for removing free glycerol in step (ii) in combination with the method for measuring free glyceride in step (iv).
  • Removal of free glycerol can be achieved, for example, by causing a reagent that generates free glycerol power peracid hydrogen to act on free glycerol to generate hydrogen peroxide, and removing the generated hydrogen peroxide.
  • the method of performing is mentioned.
  • a method for measuring free glycerol in step (iv) when using this removal method for example, a reagent that generates free glycerol power hydrogen peroxide is allowed to act to generate hydrogen peroxide. The method of measuring is mentioned.
  • Examples of the reagent for generating free glycerol power peroxyhydrogen include a reagent containing glycerol kinase and glycerol 3-phosphate oxidase, a reagent containing glycerol oxidase, and the like.
  • the glycerol kinase in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme having an activity of converting glycerol into glycerol 3-phosphate in the presence of ATP.
  • glycerol kinase produced by genetic engineering techniques can also be used, such as glycerol kinase (GYK-301; manufactured by Toyobo Co., Ltd.), glycerol kinase (GYK-311; Commercial products such as Toyobo Co., Ltd. and dalycerol kinase (GKZ; manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) can also be used.
  • Glycerol kinase may be an unmodified enzyme or a chemically modified enzyme.
  • a chemically modified glycerol kinase can be prepared by the above-described chemical modification method using, for example, the above-described chemical modifier.
  • the concentration of glycerol kinase used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it enables measurement of triglyceride in LDL, but it may be 0.1 to 20 UZ mL in the reaction solution. Preferred 0.2-: More preferably, the concentration is LOUZmL. In the present invention, it is possible to use two or more kinds of glycerol kinases in combination.
  • the glycerol 3 phosphate oxidase in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme having the ability to generate glycerol 3 phosphate power peracid hydrogen, for example, glycerol 3 derived from animals, plants or microorganisms.
  • glycerol 3-phosphate oxidase produced by genetic engineering techniques can also be used, such as L-hyperglycephosphate phosphate oxidase (G30-301; manufactured by Toyobo Co., Ltd.), L- Commercially available products such as dallicerophosphate oxidase (GPOM; manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) and L- ⁇ -glyceguchi phosphate oxidase (GPOSP; manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) can also be used.
  • L-hyperglycephosphate phosphate oxidase G30-301; manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • L- Commercially available products such as dallicerophosphate oxidase (GPOM; manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) and L- ⁇ -glyceguchi phosphate oxidase (GPOSP; manufactured by Asahi Kasei
  • Glycerol 3 phosphate oxidase may be an unmodified enzyme or a chemically modified enzyme. Chemically modified glycerol 3-phosphate oxidase can be produced, for example, by the aforementioned chemical modification method using the aforementioned chemical modifier.
  • the concentration of glycerol 3-phosphate oxidase used in the method of the present invention is not particularly limited as long as it allows measurement of triglycerides in LDL, but it should be 1 to 60 UZmL in the reaction solution. It is more preferable that the concentration is 2 to 30 UZmL.
  • two or more kinds of glycerol triphosphate oxidase can be used in combination.
  • the glycerol oxidase in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme having the ability to generate peroxyhydrogen from glycerol, for example, glycerol oxidase derived from animals, plants or microorganisms, as well as genetic engineering.
  • Glycerol oxidase produced by various techniques can also be used, and commercially available products can also be used.
  • Glycerol oxidase may be an unmodified enzyme or a chemically modified enzyme.
  • Chemically modified glycerol 3-phosphate oxidase can be produced, for example, by the aforementioned chemical modification method using the aforementioned chemical modifier.
  • the concentration of glycerol oxidase in the present invention is not particularly limited as long as it is a concentration that enables measurement of triglycerides in LDL, but it is preferably a concentration of 1 to 400 UZmL in the reaction solution. More preferably, the concentration is 200 UZmL.
  • two or more kinds of glycerol oxidase can be used in combination.
  • free glycerol power Peroxyhydrogen generated can be removed by a peracid hydrogen removal reagent.
  • the peroxide removal reagent include a reagent containing catalase, a peracid-active substance such as peroxidase, and one of the acid-coupled chromogens, that is, a phenol-based or aromatic-containing reagent.
  • hydrogen donor compounds such as those of systems or couplers such as 4-aminoantipyrine.
  • the peracid-hydrogen removal reagent When a reagent containing catalase is used as the peracid-hydrogen removal reagent, it is removed by allowing catalase to act on the peracid-hydrogen in the first step to convert the hydrogen peroxide into water and hydrogen. be able to.
  • a peroxydase active substance such as peroxidase and an acid coupling type chromogen
  • the hydrogen peroxide is used in the presence of a peroxidative active substance. It can be removed by reacting with one of the oxidatively coupled chromogens to produce a colorless substance.
  • the concentration of catalase when a reagent containing catalase is used as the hydrogen peroxide removal reagent is not particularly limited as long as it can remove triglycerides in HDL and peroxyhydrogen derived from free glycerol.
  • the concentration in the reaction solution is preferably 50 to 4000 UZmL, more preferably 100 to 2000 UZmL.
  • Peroxidase as peroxidase as a hydrogen peroxide removal reagent and oxidation cup When a combination with one of the ring type chromogens is used, the concentration of the peroxidation active substance is determined by combining the peracid active substance with triglycerides in HDL and peroxyhydrogen derived from free glycerol.
  • the concentration is not particularly limited as long as a colorless substance can be produced by the reaction.
  • the concentration of peroxidase is preferably 1 to: LOOUZmL in the reaction solution, more preferably 2 to 50 UZmL. ,.
  • Examples of the coupler include 4-aminoantipyrine (4-AA), 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone, and the like.
  • phenolic hydrogen donor compound examples include phenol, 4-chlorophenol, 3-methylphenol, 3-hydroxy-2,4,6 tolyobenzoic acid (HTIB), and the like.
  • A-phosphorus hydrogen donor compounds include N- (3 sulfopropyl) a-line, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3-methyl-aline (TOOS) , N—Ethyluo N— (2-Hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaline (M AOS), N-Ethylu N— (2 Hydroxy-3-sulfopropyl) 3,5 Dimethoxyalkylene (DAOS), N-ethyl N— (3-sulfopropyl) -3-methylaline (T OPS), N— (2 hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5 dimethoxy-line (HDA OS), N, N-dimethyl-3-methylaline, N, N-di (3-sulfopropyl) -3, 5-dimethoxylin, N-ethyl N- (3-sulfopropyl)
  • the hydrogen peroxide removing reagent When a peroxidase active substance such as peroxidase and one of the oxidized coupling type chromogens are used as the hydrogen peroxide removing reagent, one of the acid coupling type chromogens
  • the concentration of is not particularly limited as long as it is a concentration capable of removing the produced hydrogen peroxide and hydrogen, preferably 0.05 to 4 gZL, more preferably 0.1 to 2 g / L.
  • catalase inhibitors include sodium azide, H 2 S, HCN, NH 4 OH, 3-amino-1, 2, 4-triazo
  • the concentration to be used is not particularly limited as long as it is a concentration that inhibits catalase activity and does not affect the measurement of hydrogen peroxide generated in step (iv).
  • it is 0.5-60 mmolZL, More preferably, it is 1-30 mmol / L.
  • Examples of the method for measuring peroxyhydrogen derived from triglycerides in LDL produced in step (iv) of the present invention include a method of directly measuring with a hydrogen peroxide electrode and a method of measuring with a hydrogen peroxide measuring reagent.
  • the hydrogen peroxide measuring reagent is a reagent for converting the generated hydrogen peroxide into a detectable substance.
  • Examples of the detectable substance include dyes and luminescent substances, and dyes are preferable.
  • the detectable substance is a dye
  • the hydrogen peroxide measuring reagent contains an oxidative coloring type chromogen and a peroxidation active substance such as peroxidase.
  • the oxidative coloring type chromogen examples include the aforementioned oxidative coupling chromogen and the leuco chromogen described below.
  • the detectable substance is a luminescent substance
  • the hydrogen peroxide measuring reagent contains a luminescent substance.
  • the light-emitting substance examples include luminol, isoluminol, lucigenin, and ataridi-um ester.
  • a reagent containing a peroxidation active substance such as an oxidative coloring type chromogen and peroxidase
  • hydrogen peroxide is used in the presence of the peroxidation active substance.
  • an oxidative coloring type chromogen By reacting with an oxidative coloring type chromogen to produce a dye and measuring the produced dye, hydrogen peroxide can be measured.
  • hydrogen peroxide measuring reagent containing a luminescent substance hydrogen peroxide can be measured by reacting hydrogen peroxide with the luminescent substance and measuring the generated photons.
  • the oxidative coupling type chromogen is a chromogen that reacts with hydrogen peroxide in the presence of a peroxidic active substance such as peroxidase to produce a dye by an oxidative coupling reaction.
  • a coupler such as 4 AA and a phenolic or aryl phosphorus hydrogen donor compound produce a dye by an oxidative coupling reaction.
  • a leuco chromogen is a chromogen that reacts with hydrogen peroxide in the presence of a peroxidase active substance such as peroxidase to produce a pigment alone.
  • CCAP 10-N-carboxymethylcarbamoyl-3,7 bis (dimethylamino) -10H phenothiazine
  • MCDP 10-N-methylcarbamoyl-3,7 bis (dimethylamino) -10H phenothiazine
  • DA-64 monobis (dimethylamino) diphenylamine sodium salt
  • B CMA monobis (dimethylamino) diphenylamine, bis [3— And bis (4-chlorophenol) methyl 4-dimethylaminophenol] amine
  • step (ii) a peroxidase-active substance such as peroxidase and one of oxidatively coupled chromogens are used as a hydrogen peroxide removal reagent, and step (iv) )
  • a peroxidase-active substance such as peroxidase and one of oxidatively coupled chromogens
  • step (iv) a peroxidase-active substance such as peroxidase and one of oxidatively coupled chromogens are used as a hydrogen peroxide removal reagent
  • step (iv) In the case of using an acid coupling type chromogen and a peroxidase active substance such as peroxidase as a reagent for measuring hydrogen peroxide, the oxidative coupling type chromogen used in step (ii) Another side of the body can be used as a reagent for measuring hydrogen peroxide in step (iv).
  • a coupler such as 4 AA is used as the oxidative coupling chromogen in the step of removing peroxyhydrogen in step (ii)
  • a phenolic or charline in step (iv) is used. It is sufficient to add a hydrogen donor compound such as a system, and in the process of removing hydrogen peroxide, if a phenolic or aryl phosphorus compound is used, (iv
  • a coupler such as 4 AA may be added.
  • the concentration of the peracid active substance is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for the measurement, but it is perovskite as the peracid active substance.
  • perovskite as the peracid active substance.
  • LOOUZmL is preferred 2 to 50 UZmL is more preferred.
  • concentration of the oxidative coloring type chromogen is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for measurement, but 0.01 to: LOgZL is preferable, and 0.02 to 5 g / L force is preferable! / ⁇ .
  • step (ii) of the present invention is not limited to the above example.
  • glycerol kinase is allowed to act on the free glycerol produced in step (ii) to convert the free glycerol into glycerol 3-phosphate.
  • a glycerol mouth kinase inactivating agent, etc. examples thereof include a method of measuring peroxyhydrogen produced by acting glycerol oxidase in the presence of.
  • the kit for measuring triglycerides in LDL of the present invention is preferably a two-reagent system comprising the following first reagent and second reagent, but it can also take the form of a kit such as a three-reagent system as appropriate.
  • a reagent comprising at least one selected surfactant, lipoprotein lipase and a free glycerol removal reagent.
  • Second reagent [0099] Second reagent:
  • lipoprotein lipase examples include those described above.
  • an enzyme group that generates peroxyhydrogen from triglycerides is contained in the first reagent. It may also be contained in the second reagent.
  • the hydrogen peroxide removing reagent is contained in the first reagent.
  • the second reagent preferably contains a catalase activity inhibitor.
  • the catalase activity inhibitor include the aforementioned catalase activity inhibitors.
  • Peroxidase active substances such as peroxidase as a hydrogen peroxide removing reagent and oxidized cappuri
  • the peroxide-active substance and the one acid-coupling chromogen also serve as components of the hydrogen peroxide measuring reagent.
  • the peroxy acid dehydrogenation reagent it is not necessary to remove or inactivate the peroxy acid dehydrogenation reagent, in particular, if another acid-coupled chromogen necessary for color development is included. Good.
  • some components in the peroxyhydrogen measurement reagent in particular, one of the oxidatively coupled chromogens is contained in the first reagent. It may be done.
  • the bile acid derivative may be contained in either or both of the first reagent and the second reagent, but is preferably contained in the second reagent.
  • the LDL triglyceride measurement kit of the present invention may contain a reaction solution, a stabilizer, an antiseptic, an influential substance removing agent, a reaction accelerator, a nonspecific reaction inhibitor, and the like, if necessary.
  • the reaction liquid include the above-described reaction liquid.
  • the stabilizer include ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), sucrose, calcium chloride, amino acids, albumin and the like.
  • antiseptics include sodium azide and antibiotics.
  • the influence substance removing agent include ascorbate oxidase for eliminating the influence of ascorbic acid.
  • reaction accelerator examples include enzymes such as colipase and phospholipase, and salts such as sodium sulfate, sodium chloride salt, and magnesium sulfate.
  • Nonspecific reaction inhibitors include polymer compounds such as dextran sulfate.
  • the LDL triglyceride measurement kit of the present invention may be lyophilized or dissolved in a reaction solution.
  • the kit can be used by dissolving in the above-mentioned aqueous medium or reaction solution.
  • the content of lipoprotein lipase in the LDL triglyceride measurement kit of the present invention is preferably such that the concentration in a state dissolved in an aqueous medium is 0.01 to 1200 UZmL is 0.02 to 600 UZmL. The content is more preferable.
  • the content of glycerol kinase in the kit for measuring triglycerides in LDL of the present invention is preferably such that the concentration in a state dissolved in an aqueous medium is 0.1 to 60 UZmL, and the content to be 0.2 to 30 UZmL. More preferred.
  • the content of 3-phosphate oxidase is preferably a content of 2 to 90 U / mL, which is preferably a concentration of about 180 U / mL when dissolved in an aqueous medium.
  • the content of the surfactant in the kit for measuring triglycerides in LDL of the present invention is preferably such that the concentration in the state dissolved in an aqueous medium is 0.01 to 20%. A content of 10% is more preferable.
  • the content of catalase in the LDL triglyceride measurement kit is such that the concentration when dissolved in an aqueous medium is 0.05-1 2 kU / mL. The content of 0.1 to 6. OkU / mL is more preferable.
  • the content of the catalase activity inhibitor in the LDL triglyceride measurement kit is 0.5 to 180 mmol when dissolved in an aqueous medium. A content of 1 to 90 mmol / L is more preferred.
  • kits for measuring triglycerides in LDL when a reagent containing a peroxidase active substance such as peroxidase and one of oxidatively coupled chromogens is used as a peracid hydrogen removal reagent
  • a peroxidase active substance such as peroxidase and one of oxidatively coupled chromogens
  • the concentration in a state dissolved in an aqueous medium is 1 to 600 UZmL and 0.05 to 8 gZ L, respectively. More preferred is a content of ⁇ 150 U / mL, 0.1 to 4 g / L.
  • the baroxidase in the LDL triglyceride measurement kit and the oxidative coupling type color when a reagent containing peroxidase and an acid coupling type chromogen is used as the peracid hydrogen measurement reagent The content of the active ingredient is preferably 1 to 600 UZmL, 0.05 to 8 gZL, and 2 to 150 UZmL and 0.1 to 4 g / L when dissolved in an aqueous medium. The content is more preferable.
  • the content of the bile acid derivative in the kit for measuring triglycerides in LDL of the present invention is preferably such that the concentration in a state dissolved in an aqueous medium is 0.01 to 20%. % Content is more preferred.
  • a kit for measuring triglycerides in LDL having the following first reagent (reagent A) and second reagent (reagent a) was prepared.
  • a kit for measuring triglycerides in LDL having the following first reagent (reagent B) and second reagent (reagent a) was prepared.
  • a kit for measuring triglycerides in LDL having the following first reagent (reagent C) and second reagent (reagent a) was prepared.
  • a kit for measuring triglycerides in LDL comprising the following first reagent (reagent A) and second reagent (reagent b) was prepared.
  • first reagent (reagent A) and second reagent (reagent c) kit for measuring triglycerides in LDL were prepared.
  • Example 8 A kit for measuring triglycerides in LDL having the following first reagent (reagent A) and second reagent (reagent d) was prepared.
  • a kit for measuring triglycerides in LDL consisting of the following first reagent (reagent A) and second reagent (reagent e) was prepared.
  • a kit for measuring triglycerides in LDL such as the following first reagent (reagent A) and second reagent (reagent f) was prepared.
  • a kit for measuring triglycerides in LDL comprising the following first reagent (reagent A) and second reagent (reagent g) was prepared.
  • a kit for measuring LDL triglyceride which also has the following first reagent (reagent F) and :: reagent (reagent a ) was prepared.
  • LDL triglyceride measurement kits were prepared, including the following first reagent (reagent A) and second reagent (Trial).
  • reaction absorbance was calculated by the following operation.
  • each lipoprotein fraction as a sample, add (2 L) to the reaction cell, and then add the first reagent (0.15 mL) of the kits of Examples 1 to 11 and Comparative Examples 1 and 2, respectively.
  • the first reaction was started, and the mixture was heated at 37 ° C. for 5 minutes, and the absorbance (E1) of the reaction solution 5 minutes after the reaction was measured at a main wavelength of 600 nm and a subwavelength of 700 nm.
  • Measure the absorbance (E2) of the reaction solution 5 minutes after the second reaction at a main wavelength of 600 nm and a subwavelength of 700 nm, subtract E1 from E2, and change the absorbance ( ⁇ ⁇ ) Lipoprotein Fractions were calculated.
  • the same measurement was performed using physiological saline as a specimen instead of each lipoprotein fraction, and the change in absorbance ( ⁇ ) was calculated.
  • kits containing a surfactant selected from the group consisting of sulfates and POE polycyclic felt ethers with HLB values of 9.0 or more and less than 13.0 may preferentially react triglycerides in LDL. found.
  • Example 13 A kit for measuring triglycerides in LDL comprising the following first reagent (reagent A) and second reagent (reagent k) was prepared.
  • a kit for measuring triglycerides in LDL comprising the following first reagent (reagent A) and second reagent (reagent 1) was prepared.
  • a kit for measuring triglycerides in LDL comprising the following first reagent (reagent A) and second reagent (reagent m) was prepared.
  • the POE polycyclic ether having an HLB value of 9.0 or more and less than 13.0
  • the correlation coefficient with the reference method was improved by using a second reagent containing POE alkyl ether sulfate.
  • the HLB value was 9.0 or more and less than 13.0 based on the measurement using the kit of Example 1 and Example 13 and the comparison with the measurement using the kit of Example 8 and Example 14.
  • LDL specific gravity 1
  • Table 3 shows the measured values of the three samples using the ultracentrifugation method measured in (1) above and the kit of Example 15 measured in (3) above.
  • Measurement kit A and measurement kit B having the following first reagent and second reagent power were prepared.
  • a measurement kit A and a measurement kit B having the following first reagent and reagent power were prepared.
  • Measurement kit A and measurement kit B having the following first reagent and second reagent power were prepared.
  • the reaction absorbance was calculated by the following operation using a Hitachi 7170S automatic analyzer. Using each lipoprotein fraction as a sample, add (2 L) to the reaction cell, and then add the first reagent (0.15 mL) from Measurement Kit A or Measurement Kit B in Reference Examples 1 to 5 to react (first The reaction was started and heated at 37 ° C. for 5 minutes, and the absorbance (E1) of the reaction solution 5 minutes after the reaction was measured at a main wavelength of 600 nm and a subwavelength of 700 nm.
  • the second reagent (0.05 mL) of Measurement Kit A or Measurement Kit B of Reference Examples 1 to 5 was added to this reaction solution, respectively, and further heated at 37 ° C for 5 minutes to react (second The absorbance (E2) of the reaction solution 5 minutes after the second reaction was measured at a main wavelength of 600 nm and a subwavelength of 700 nm, and E1 was subtracted from E2 to calculate a change in absorbance ( ⁇ ).
  • Example 12 Detamina CTG (manufactured by Kyowa Medettas) was used to calculate the “reaction absorbance” when all triglycerides in lipoprotein had reacted, and each lipoprotein fraction in Reference Examples 1 to 5 was calculated.
  • the reaction rate (%) with medium triglyceride was calculated by the following formula.
  • Table 3 shows the reaction rate of triglycerides in each lipoprotein fraction in Reference Examples 1 to 5.
  • the reaction rate power ⁇ ) ⁇ 10% is ⁇ 1 '', 10 ⁇ 20% is ⁇ Sat '', 20 ⁇ 40% is ⁇ + '', 40 ⁇ 60% is ⁇ ++ '', 60 ⁇ 80% is ⁇ +++ ”, 80-100% was defined as“ ++++ ”.
  • polyoxyethylene polyoxyalkylene polycyclic phenol ether (-Fucor 2608F, Neukalgen GP 120), polyoxyethylene alkylphenol terformaldehyde condensate (-Cockol R1020) and HLB 13. 0 or more 17.0 or more
  • the following polyoxyethylene polycyclic ether (Emargen B66, Neucor 610) Triglycerides in HD L react preferentially in a reagent containing at least one surfactant selected from the group consisting of: There was found.
  • polyoxyethylene polyoxyalkylene polycyclic phenol ether polyoxyethylene alkyl phenol ether formaldehyde condensate, and polyoxyethylene polycyclic phenol ether strength of HLB of 13.0 to 17.0
  • triglycerides in LDL, IDL, VLDL, and CM remain in addition to HDL.
  • this treated sample is further treated with polyoxyethylene polyoxyalkylene alkyl ether.
  • a method for measuring triglyceride in low-density lipoprotein and a measurement kit useful for diagnosis of coronary artery disease such as arteriosclerosis are provided.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

（i）検体とポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル等の特定の界面活性剤を含有する水性媒体中で、検体にリポプロテインリパーゼを作用させ、遊離型グリセロールを生成させる工程、（ii）前記工程（i）の反応液中に存在する遊離型グリセロールを除去する工程、（iii）前記工程（ii）で遊離型グリセロールを除去した後の反応液にポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル等の特定の界面活性剤存在下、リポプロテインリパーゼを作用させ、遊離型グリセロール生成させる工程、（iv）前記工程（iii）で生成する遊離型グリセロールを測定する工程を順次行うことを特徴とする、簡便で、かつ、正確な検体中の低密度リポ蛋白中のトリグリセリドの測定方法及び該方法に使用するキットが提供される。

Description

明 細 書
低密度リポ蛋白中トリグリセリドの測定方法及び測定用キット
技術分野
[0001] 本発明は、検体中の低密度リポ蛋白中トリグリセリドの測定方法及び測定用キットに 関する。
背景技術
[0002] 生体中リポ蛋白は、その比重により高密度リポ蛋白（以下、 HDLと略記する）、低密 度リポ蛋白（以下、 LDLと略記する）、超低密度リポ蛋白（以下、 VLDLと略記する）、 及びカイロミクロン (以下、 CMと略記する）の 4つに大きく分類されて 、る。
各リポ蛋白質は、脂質組成及びアポ蛋白の種類が異なっており、それ故生体中で の働きが大きく異なる。また、 VLDL力も LDLへ代謝される過程において生成するリ ポ蛋白として、 VLDLと LDLの密度の中間に相当する中間密度リポ蛋白（以下、 IDL と略記する）が存在するが、広義には LDLとして分類されている。
[0003] 現在、動脈硬化診断のスクリーニングとして臨床検査分野では、総コレステロール、 総トリグリセリド、 HDL中コレステロール、アポリポ蛋白 AI、アポリポ蛋白 Bなどが一般 的に測定されている。最近では総コレステロールに代わり、動脈硬化形成に強く関与 すると 、われて 、る LDL中コレステロールが頻繁に測定されるようになってきた。一 方、血中の LDL中コレステロールが高くないにも関わらず冠動脈硬化病変を有する 者も多く認められ、肥満、高トリグリセリド血症、高血圧症、高血糖を併せ持った状態 力 冠動脈疾患の形成において極めて危険な病態であるともいわれている。また、血 中 LDL中トリグリセリド値は LDL中コレステロール値以上に冠動脈疾患と関係すると いう報告もある。
[0004] LDL中トリグリセリドを測定する一般的な方法としては、超遠心、沈殿法、免疫反応 を利用した方法により各リポ蛋白を分画分取し、その中に含まれるトリグリセリドを測定 する方法がある力 いずれの分画法においても時間や手間がかかり、非常に煩雑で ある。
分画操作を行うことなく自動分析装置で測定可能な方法としては、第一工程で LD L以外の全てのリポ蛋白中のトリグリセリドを除去した後、第二工程で残った LDL中の トリグリセリドを測定する方法 (特許文献 1及び特許文献 2)が知られている力 VLDL 中のトリグリセリドゃ CM中のトリグリセリドが高い検体においては第一工程で除去しき れず第二工程に反応が持ち越され正の影響を受けるといった問題がある。
[0005] また、分画操作を行うことなく自動分析装置で測定可能な方法としては、広義的に LDLとして分類される IDLに含まれるトリグリセリドを測定する方法 (特許文献 3)が知 られている力 通常の LDLに含まれるトリグリセリドは測定対象としていない方法であ り、 LDL中のトリグリセリドの測定法としては不適当である。
また、分画操作を行うことなく自動分析装置で測定可能な方法としては、プロピレン オキサイドとエチレンオキサイドのブロックコポリマー、特に、ポリオキシプロピレンとポ リオキシエチレンのトリブロックコポリマー存在下での酵素反応を特徴とする、 LDL中 のトリグリセリドの測定方法 (特許文献 4)が知られて 、る。
特許文献 1：国際公開第 00Z43537号パンフレット
特許文献 2：国際公開第 WO2004Z087945号パンフレット
特許文献 3 :国際公開第 WO00Z60112号パンフレット
特許文献 4：特表 2002— 508519公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の目的は、簡便で、かつ、正確な LDL中のトリグリセリドの測定方法及び測 定試薬を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明は、下記 [1]〜[20]に関する。
[1] 下記工程 (i)〜(iv)を順次行うことを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋 白中のトリグリセリドの測定方法。
( 検体及びポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フエ-ルエーテル、ポリ ォキシプロピレンポリオキシアルキレン多環フエニルエーテル、ポリオキシエチレンァ ルキルフエ-ルエーテルホルムアルデヒド縮合物及び HLB値が 13. 0以上 17. 0以 下のポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つ の界面活性剤を含有する水性媒体中で、該検体にリポプロテインリパーゼを作用さ せ、遊離型グリセロールを生成させる工程；
(ii)前記工程 ( の反応液中に存在する遊離型グリセロールを除去する工程；
(iii)前記工程 (ii)で遊離型グリセロールを除去した後の反応液に、ポリオキシェチ レンポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンポリオキシアルキ レンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフエニルェ 一テル、ポリオキシプロピレンポリオキシアルキレンアルキルフエニルエーテル、ポリ ォキシエチレン多環フエ-ルエーテル縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフエ-ル エーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテル硫酸塩、及び HLB値が 9. 0以上 13. 0未満のポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテル力もなる群より選ば れる少なくとも一つの界面活性剤の存在下、リポプロテインリパーゼを作用させ、遊離 型グリセロールを生成させる工程；
(iv)前記工程 (iii)で生成する遊離型グリセロールを測定する工程。
[0008] [2] 工程 (i)で生成する遊離型グリセロール力 高密度リポ蛋白中のトリグリセリド 力も生成するものである [1]記載の方法。
[3] 工程 (ii)の遊離型グリセロールの除去力 遊離型グリセロールを工程 (iv)の 遊離型グリセロールの測定に係る成分以外の成分に酵素的に変換することである [1 ]又は [2]記載の方法。
[0009] [4] 工程 (ii)の遊離型グリセロールの除去力 遊離型グリセロール力も過酸ィ匕水 素を発生させる試薬により過酸化水素を発生させ、次 ヽで該過酸化水素を除去する ことにより行われる [1]又は [2]記載の測定方法。
[5] 過酸化水素の除去が、過酸ィ匕水素にカタラーゼを作用させる力、又は、酸ィ匕 カップリング色原体の片方の存在下に、過酸ィ匕水素に過酸ィ匕活性物質を作用させる ことにより行われる [4]に記載の測定方法。
[0010] [6] 工程 (iv)の遊離型グリセロールの測定力 遊離型グリセロール力も過酸ィ匕水 素を発生させる試薬により過酸化水素を発生させ、次 ヽで該過酸化水素を測定する ことにより行われる [1]〜 [5]の 、ずれかに記載の方法。
[7] 遊離型グリセロール力も過酸ィ匕水素を発生させる試薬力 グリセロールキナ 一ゼとグリセロール 3—リン酸ォキシダーゼとを含有する試薬又はグリセロールォキシ ダーゼを含有する試薬である [4]〜 [6]の 、ずれかに記載の測定方法。
[0011] [8] 過酸化水素の測定が、過酸化水素に過酸化活性物質と酸化発色型色原体 とを作用させて色素を生成させ、該色素の吸光度を測定することにより行われる [6] 又は [7]に記載の方法。
[9] 胆汁酸誘導体の存在下に、工程 (iii)のリポプロテインリパーゼを作用させる [ 1]〜 [8]の 、ずれかに記載の方法。
[0012] [10] 胆汁酸誘導体力 コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、 グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デォキシコール酸もしく はその塩、ケノデォキシコール酸もしくはその塩、ウルソデォキシコール酸もしくはそ の塩、 7—ォキソリトコール酸もしくはその塩、 12—ォキソリトコール酸もしくはその塩、 12—ォキソケノデォキシコール酸もしくはその塩、 7—ォキソデォキシコール酸もしく はその塩、ヒォコール酸もしくはその塩、ヒォデォキシコール酸もしくはその塩、デヒド 口コール酸もしくはその塩、一般式 (I)
[0013] [化 1]
R1 - CH2 - CH(R2) - CH2 - S03~ ( I )
[0014] [式中、 R1は、 3—（3—コラミドプロピル)ジメチルアンモ-ォ基であり、 R2は、水素原 子又は水酸基である]で表される化合物、及び一般式 (II)
[0015] [化 2]
Figure imgf000005_0001
(Xは、水素原子又は水酸基を表し、 R3及び R4は、同一又は異なって、置換もしくは 非置換のアルキル基、又は、置換もしくは非置換のアルカノィル基を表す)で表され る化合物力 なる群より選ばれる少なくとも一つの物質である [9]に記載の方法。
[0017] [11] (a)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フエ-ルエーテル、ポリオ キシプロピレンポリオキシアルキレン多環フエニルエーテル、ポリオキシエチレンアル キルフエ-ルエーテルホルムアルデヒド縮合物及び HLB値が 13. 0以上 17. 0以下 のポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つの 界面活性剤、リポプロテインリパーゼ、及び遊離型グリセロール除去試薬を含有する 第一試薬と、（b)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオ キシプロピレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキ シアルキレンアルキルフエニルエーテル、ポリオキシプロピレンポリオキシアルキレン アルキルフエ-ルエーテル、ポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテル縮合物、ポリ ォキシエチレンアルキルフエ-ルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン多環フエ-ル エーテル硫酸塩及び HLB値が 9. 0以上 13. 0未満のポリオキシエチレン多環フエ- ルエーテル力 なる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤及び遊離型グリセ口 ール測定試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中の低密度 リポ蛋白中のトリグリセリド測定用キット。
[0018] [12] ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フエ-ルエーテル、ポリオキシ プロピレンポリオキシアルキレン多環フエ-ルエーテル、ポリオキシエチレンアルキル フエ-ルエーテルホルムアルデヒド縮合物及び HLB値が 13. 0以上 17. 0以下のポ リオキシエチレン多環フエニルエーテル力もなる群より選ばれる少なくとも一つの界面 活性剤が、高密度リポ蛋白中のトリグリセリドにリポプロテインリパーゼを作用させるも のである [11]記載のキット。
[0019] [13] 遊離グリセロール除去試薬が、遊離グリセロールを遊離グリセロール測定試 薬による測定に係る成分以外の成分に変換する酵素である [11]又は [12]記載のキ ッ卜。
[14] 遊離グリセロール除去試薬が、グリセロール力 過酸ィ匕水素を生成させる 試薬及び過酸化水素除去試薬を含有する試薬である、 [11]〜[12]記載のキット。
[0020] [15] 過酸化水素除去試薬が、カタラーゼ、又は、酸化カップリング色原体の片 方と過酸ィ匕活性物質との組み合わせを含有する試薬である [14]記載のキット。 [16] 遊離型グリセロール測定試薬が、遊離型グリセロール力 過酸ィ匕水素を生 成させる試薬及び過酸化水素測定試薬を含有する試薬である、 [11]〜 [15]のいず れかに記載のキット。
[0021] [17] 遊離型グリセロール力 過酸ィ匕水素を生成させる試薬力 グリセロールキナ 一ゼとグリセロール 3—リン酸ォキシダーゼとを含む試薬又はグリセロールォキシダー ゼを含む試薬である [ 14]〜 [ 16]の 、ずれかに記載のキット。
[18] 過酸化水素測定試薬が、過酸化活性化物質と酸化発色型色原体とを含有 する試薬である [ 16]又は [ 17]に記載のキット。
[0022] [19] 第二試薬が、さらに胆汁酸誘導体を含有する [11]〜[18]のいずれかに記 載のキット。
[20] 胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、 グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デォキシコール酸もしく はその塩、ケノデォキシコール酸もしくはその塩、ウルソデォキシコール酸もしくはそ の塩、 7—ォキソリトコール酸もしくはその塩、 12—ォキソリトコール酸もしくはその塩、 12—ォキソケノデォキシコール酸もしくはその塩、 7—ォキソデォキシコール酸もしく はその塩、ヒォコール酸もしくはその塩、ヒォデォキシコール酸もしくはその塩、デヒド 口コール酸もしくはその塩、一般式 (I)
[0023] [化 3]
R1 - CH2 - CH(R2) - CH2 - S03~ ( I )
[0024] [式中、 R1は、 3—（3—コラミドプロピル)ジメチルアンモ-ォ基であり、 R2は、水素原 子又は水酸基である]で表される化合物、及び一般式 (II)
[0025] [化 4]
Figure imgf000008_0001
[0026] (Xは、水素原子又は水酸基を表し、 R3及び R4は、同一又は異なって、置換もしくは 非置換のアルキル基、又は、置換もしくは非置換のアルカノィル基を表す)で表され る化合物力 なる群より選ばれる少なくとも一つの物質である [19]に記載のキット。 発明の効果
[0027] 本発明により、簡便で、かつ、正確な LDL中のトリグリセリドの測定方法及び測定キ ットが提供される。
発明を実施するための最良の形態
[0028] 本発明の LDL中のトリグリセリドの測定は、検体及びポリオキシエチレンポリオキシ アルキレン多環フエ-ルエーテル（以下、 POE— POA多環フエ-ルエーテルと略記 する。）、ポリオキシプロピレンポリオキシアルキレン多環フエ-ルエーテル（以下、 PO P— POA多環フエ-ルエーテルと略記する。）、ポリオキシエチレンアルキルフエ-ル エーテルホルムアルデヒド縮合物（以下、 POEアルキルフエ-ルエーテルホルムアル デヒド縮合物と略記する。）、及び HLB値が 13. 0以上 17. 0以下のポリオキシェチレ ン多環フエ-ルエーテル（以下、 POE多環フエ-ルエーテルと略記する。）からなる 群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤を含有する反応液中で、該検体にリポプ 口ティンリパーゼを作用させ、これにより生成する遊離型グリセロールと検体に元々存 在する遊離型グリセロールを除去し、該遊離型グリセロールを除去した後の反応液に 、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（以下、 POE— POAァ ルキルエーテルと略記する。）、ポリオキシプロピレンポリオキシアルキレンアルキルェ 一テル（以下、 POP— POAアルキルエーテルと略記する。）、ポリオキシエチレンポリ ォキシアルキレンアルキルフエ-ルエーテル（以下、 POE— POAアルキルフエニル エーテルと略記する。 )、ポリオキシプロピレンポリオキシアルキレンアルキルフエ-ル エーテル（以下、 POP— POAアルキルフエ-ルエーテルと略記する。）、ポリオキシ エチレン多環フエ-ルエーテル縮合物（以下、 POE多環フエ-ルエーテル縮合物と 略記する。）、ポリオキシエチレンアルキルフエ-ルエーテル硫酸塩（以下、 POEアル キルフエ-ルエーテル硫酸塩と略記する。 )、ポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテ ル硫酸塩（以下、 POE多環フエニルエーテル硫酸塩と略記する。）、及び HLB値が 9 . 0以上 13. 0未満のポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテル（以下、 POE多環フ ヱニルエーテルと略記する）カゝらなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤の 存在下、リポプロテインリパーゼを作用させ、遊離型グリセロールを生成させ、該生成 した遊離型グリセロールを測定することにより行われる。
[0029] なお、以後、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン基を POE— POAと略記し、ポ リオキシプロピレンポリオキシアルキレン基を POP— POAと略記する。
本発明の好ましい LDL中のトリグリセリドの測定は、いずれの反応工程においても、 検体中の VLDL中のトリグリセリドとリポプロテインリパーゼとの反応を抑制した状態、 もしくは促進しない状態で行うことを特徴とする。これにより、トリグリセリドを豊富に含 む VLDLに由来するトリグリセリドの測定値への影響を実質的に回避することができ る。
[0030] 本発明の好ましい LDL中のトリグリセリドの測定は、いずれの反応工程においても、 検体中の VLDL及び CM中のトリグリセリドとリポプロテインリパーゼとの反応を抑制し た状態、もしくは促進しない状態で行うことを特徴とする。これにより、トリグリセリドを豊 富に含む VLDL及び CMに由来するトリグリセリドの測定値への影響を実質的に回 避することができる。
[0031] 本発明の特に好ましい具体的な LDL中のトリグリセリドの測定方法としては、 HDL 中のトリグリセリドとリポプロテインリパーゼとの反応を抑制しない、もしくは促進し、 つ、 LDL及び VLDL中のトリグリセリドとリポプロテインリパーゼとの反応を抑制し、も しくは促進しない、 POE— POA多環フエ-ルエーテル、 POP— PO A多環フエ-ル エーテル、 POEアルキルフエ-ルエーテルホルムアルデヒド縮合物、及び HLB値が 13. 0以上 17. 0以下の POE多環フエ-ルエーテルからなる群より選ばれる少なくと も一つの界面活性剤を含有する反応液中で、 HDL中のトリグリセリド及び遊離のダリ セロールを除去し、ついで LDL中のトリグリセリドとリポプロテインリパーゼとの反応を 抑制しないもしくは促進し、かつ VLDL中のトリグリセリドとリポプロテインリパーゼとの 反応を抑制し、もしくは促進しない、 POE— POAアルキルエーテル、 POP— POAァ ルキルエーテル、 POE— POAアルキルフエ-ルエーテル、 POP— POAアルキルフ ェ-ルエーテル、 POE多環フエ-ルエーテル縮合物、 POEアルキルフエ-ルエーテ ル硫酸塩、 POE多環フエ-ルエーテル硫酸塩、及び HLB値が 9. 0以上 13. 0未満 の POE多環フエニルエーテル力もなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤 の存在下に、リポプロテインリパーゼを作用させ、これにより、 LDL中のトリグリセリドを 選択的に測定する方法が挙げられる。
[0032] 本発明の特に好ましい具体的な LDL中のトリグリセリドの測定方法としては、例えば 、 HDL中のトリグリセリドとリポプロテインリパーゼとの反応を抑制しない、もしくは促進 し、かつ LDL, VLDLおよび CM中のトリグリセリドとリポプロテインリパーゼとの反応 を抑制し、もしくは促進しない、 POE— POA多環フエ-ルエーテル、 POP— POA多 環フエ-ルエーテル、 POEアルキルフエ-ルエーテルホルムアルデヒド縮合物、及 び HLB値が 13. 0以上 17. 0以下の POE多環フエ-ルエーテルからなる群より選ば れる少なくとも一つの界面活性剤を含有する反応液中で、 HDL中のトリグリセリド及 び遊離のグリセロールを除去し、ついで LDL中のトリグリセリドとリポプロテインリパー ゼとの反応を抑制しない、もしくは促進し、かつ VLDLおよび CM中のトリグリセリドとリ ポプ口ティンリパーゼとの反応を抑制し、もしくは促進しない、 POE— POAアルキル エーテル、 POP— POAアルキルエーテル、 POE— POAアルキルフエ-ルエーテル 、 POP— PO Aアルキルフエ-ルエーテル、 POE多環フエ-ルエーテル縮合物、 PO Eアルキルフエ-ルエーテル硫酸塩、 POE多環フエ-ルエーテル硫酸塩、及び HL B値が 9. 0以上 13. 0未満の POE多環フエ-ルエーテルからなる群より選ばれる少 なくとも一つの、界面活性剤の存在下に、リポプロテインリパーゼを作用させ、これに より、 LDL中のトリグリセリドを選択的に測定する方法が挙げられる。
[0033] 本発明の測定対象となる LDLは、比重が 1. 006〜1. 063に分類される広義の L DL、比重が 1. 019〜1. 063に分類される狭義の LDLのいずれであっても良いが、 広義の LDLが測定対象となる場合、比重が 1. 006-1. 019に分類される10レ及 び、所謂 VLDLレムナントと称されるリポ蛋白粒子の一部であって IDLと同一比重を 有するリポ蛋白粒子力 なるものも測定対象に含まれる。
[0034] 本発明に用いられる検体としては、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、 尿、汗、脾液等が挙げられるが、血漿及び血清が好ましい。
本発明に用いられるリポプロテインリパーゼとしては、リポタンパク中トリグリセリドを 加水分解する能力を有する酵素であれば特に限定はなぐ例えば動物、植物又は微 生物由来のリポプロテインリパーゼ、遺伝子工学的な手法により製造されるリポプロテ インリパーゼ等が挙げられる。また、リポ蛋白中トリグリセリドを加水分解する能力を有 するコレステロールエステル加水分解酵素等も本発明のリポプロテインリパーゼに包 含される。
[0035] リポプロテインリパーゼとしては、化学的に修飾したものも使用することができる。ま た、市販品を使用することもできる。
巿販されて 、るリポプロテインリパーゼとしては、コレステロールエステラーゼ" Aman 0" 3 (CHE3；天野ェンザィム社製）、コレステロールエステラーゼ（CEBP— M；旭化 成社製）、リポプロテインリパーゼ (LPL311 ;東洋紡績製社製）、リポプロテインリパー ゼ" Amano"6 (LPL6；天野ェンザィム社製）、リポプロテインリパーゼ" Amano"3 (LPL 3；天野ェンザィム社製）、 EST"Amano"2 (天野ェンザィム社製）、リポプロテインリパ ーゼ（LPBP；旭化成社製）、コレステロールエステラーゼ [COE313 (化学的に修飾 されたコレステロールエステラーゼ）；東洋紡績社製]等が挙げられる。
[0036] リポプロテインリパーゼの化学修飾にぉ ヽて当該酵素を修飾する基 (化学修飾基） としては、例えばポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコール を主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を 有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウ レタン基、キレート機能を有する基等が挙げられる力 ポリエチレングリコールを主成 分とする基が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プルラン、可溶 性デンプン等が挙げられる。
[0037] リポプロテインリパーゼをィ匕学的に修飾するための試薬 (ィ匕学修飾剤）としては、上 記の化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得 る官能基又は構造とを併せ持つ化合物等が挙げられる。酵素中のアミノ基と反応し 得る官能基又は構造としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基 (N ヒドロキ シサクシンイミド基等）、酸無水物、酸塩化物、アルデヒド、エポキシド基、 1, 3 プロ パンスルトン、 1, 4 ブタンスルトン等が挙げられる。酵素中のカルボキシル基と反応 し得る官能基又は構造としては、例えばアミノ基等が挙げられる。酵素中のスルフヒド リル基と反応性がある基又は構造としては、例えばマレイミド基、ジスルフイド、 α—ョ ードエステル等の α—ハロエステル等が挙げられる。
[0038] 化学修飾剤として、市販品を使用することもできる。市販されている化学修飾剤とし ては、ポリエチレングリコールを主成分とする基と N ヒドロキシサクシンイミド基とを有 するサンブライト VFM— 4101、サンブライト ME— 050AS、サンブライト DE— 030 AS (いずれも日本油脂社製）、ポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水 物構造とを有するサンブライト AKMシリーズ (例えば、サンブライト AKM— 1510等） 、サンブライト ADMシリーズ、サンブライト ACMシリーズ (いずれも日本油脂社製）、 ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有する EPOX— 3400、 M— EPOX— 5000 (いずれも Sheawater Polymers社製)、キレート機能を有する基と 酸無水物構造とを有するジエチレントリァミン- Ν,Ν,Ν' ,Ν'， ,Ν'，-ペンタ無水二酢酸（ DTPA anhydride;同仁化学社製)等が挙げられる。
[0039] リポプロテインリパーゼの化学修飾は、例えば以下の方法で行うことができる力 本 方法に限定されるものではない。まず、酵素を PH8. 0以上の緩衝液 (例えば HEPE S緩衝液）に溶解し、 0〜55°Cで 0. 01〜500倍モル量の化学修飾剤を添カ卩し、 5分 間〜 5時間攪拌する。実際の酵素反応においては、化学的に修飾された酵素として 、この反応液そのもののみならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学 修飾剤等を除去したものも、使用することもできる。
[0040] 本発明の方法に用いられるリポプロテインリパーゼの濃度としては、 LDL中トリダリ セリドの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で 0. 01〜40 OUZmLの濃度であることが好ましぐ 0. 02〜200UZmLであることがより好ましい 。また、本発明においては、 2種類以上のリポプロテインリパーゼを組み合わせて用 いることちでさる。
[0041] 本発明に用いられる POE— POA多環フエ-ルエーテルにおけるポリオキシアルキ レンとしては、ポリオキシエチレン以外の、例えばポリオキシプロピレン、ポリオキシブ チレン等が挙げられる。
本発明に用いられる POP— POA多環フエ-ルエーテルにおけるポリオキシアルキ レンとしては、ポリオキシプロピレン以外の、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシブ チレン等が挙げられる。
[0042] POE POA多環フエ-ルエーテル及び POP— POA多環フエ-ルエーテルそれ ぞれにおけるポリオキシエチレンのォキシエチレン及びポリオキシプロピレンのォキシ プロピレンの重合度としては、好ましくは 2〜60であり、より好ましくは 4〜30であり、 ポリオキシアルキレンのォキシアルキレンの重合度としては、好ましくは 1〜40であり 、より好ましくは 1〜20である。
[0043] なお、本発明に用いられる POE— POA多環フエ-ルエーテル及び POP— POA 多環フエ-ルエーテルそれぞれにおける POE— POA及び POP— POAの重合様式 としてはとくに制限はなぐ例えば、ブロック重合型、ランダム重合型の重合様式のも の力 S挙げられる。ブロック重合型としては、例えばジブロックコポリマー、トリブロックコ ポリマー、テトラブロックコポリマなどが挙げられる。
[0044] POE— POA多環フエ-ルエーテルの具体例（製品）としては、例えば-ユーコール 2608F、ニューコール 2600FB (いずれも日本乳化剤社製）、ニューカルゲン GP 12 0、ニューカルゲン CP 15— 150 (V、ずれも竹本油脂社製)等が挙げられる。
[0045] 本発明に用いられる POEアルキルフ -ルエーテルホルムアルデヒド縮合物にお けるポリオキシエチレンのォキシエチレンの重合度としては、好ましくは 1〜60であり 、より好ましくは 2〜30である。 POEアルキルフエ-ルエーテルホルムアルデヒド縮合 物におけるアルキルとしては、直鎖又は分枝状の炭素数 6〜30の、例えばへキシル 、ヘプチル、ォクチル、イソオタチル、ノエル、デシル、ゥンデシル、ドデシル（ラウリル )、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、へキサデシル（セチル）、へ プタデシル、ォクタデシル (ステァリル）、ノナデシル、ィコシル、へネィコシル、ドコシ ノレ（ベへ二ノレ）、トリコシノレ、テトラコシル、ペンタコシル、へキサコシル、ヘプタコシル、 ォクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられる。
[0046] POEアルキルフ -ルエーテルホルムアルデヒド縮合物の具体例（製品）としては、 例えば-ッコール R1020 (日光ケミカルズ社製)等が挙げられる。
[0047] 本発明に用いられる HLB値が 13. 0以上 17. 0以下の POE多環フエ-ルエーテル におけるポリオキシエチレンのォキシエチレンの重合度としては、好ましくは 1〜60で あり、より好ましくは 2〜30である。 HLB値が 13. 0以上 17. 0以下の POE多環フエ- ルエーテルにおける。多環フエ-ルとは、基内に 1つの芳香環を有する基 (置換基） 力^つ以上置換したフエ二ル基、基内に 2つ以上の芳香環を有する基 (置換基）が 1 つまたは複数置換したフ -ル基等が挙げられる。基内に 1つの芳香環を有する基と しては、例えばベンジル、 1 （フエニル）ェチル等が挙げられる。基内に 2つ以上の 芳香環を有する基としては、例えばナフチル等が挙げられる。 HLB値が 13. 0以上 1 7. 0以下の POE多環フエ-ルエーテルの HLB値としては、 13. 1以上 15以下が好 ましぐ 13. 2以上 14以下が特に好ましい。
[0048] HLB値が 13. 0以上 17. 0以下の POE多環フエ-ルエーテルの具体例（製品）とし ては、例えばェマルゲン B66 (HLB値 13. 2 花王社製）、ニューコール 610 (HLB 値 13. 8 日本乳化剤社製）、ニューコール 710 (HLB値 13. 6 日本乳化剤社製）、 ェマルゲン A— 90 (HLB値 14. 5 花王社製）、 BLAUNONTSP— 50 (HLB値 16 . 9 青木油脂社製)、ニューコール 714 (HLB値 15. 0 日本乳化剤社製)、ニュー コーノレ 2614 (HLB値 15. 0 日本孚 Lィ匕剤社製）、ニューコーノレ 2609 (HLB値 13. 0 日本乳化剤社製）、ニューカルゲン CP120 (HLB値 13. 0 竹本油脂社製)等が挙 げられる。
[0049] 本発明に用いられる POE— POA多環フエ-ルエーテル、 POP— POA多環フエ- ルエーテル、 POEアルキルフエ-ルエーテルホルムアルデヒド縮合物及び HLB値が 13. 0以上 17. 0以下の POE多環フエ-ルエーテルの濃度としては、 HDL中トリグリ セリドの反応を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が 0. 0 1〜10%であることが好ましぐ 0. 02〜5%がより好ましい。また、本発明においては 、これらの化合物を 2種類以上組み合わせて用いることもできる。
[0050] 本発明に用いられる POE— POAアルキルエーテルにおけるポリオキシアルキレン としては、ポリオキシエチレン以外の、例えばポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレ ン等が挙げられる。
本発明にお 、て用いられる POP— POAアルキルエーテルにおけるポリオキシアル キレンとしては、ポリオキシプロピレン以外の、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシ ブチレン等が挙げられる。
[0051] POE POAアルキルエーテル及び POP— POAアルキルエーテルそれぞれにお けるポリオキシエチレンのォキシエチレン及びポリオキシプロピレンのォキシプロピレ ンの重合度としては、好ましくは 2〜60であり、より好ましくは 4〜30であり、ポリオキシ アルキレンのォキシアルキレンの重合度としては、好ましくは 1〜40であり、より好まし くは 1〜20である。
[0052] POE POAアルキルエーテル及び POP— POAアルキルエーテルそれぞれにお けるアルキルとしては、直鎖又は分枝状の炭素数 6〜30の、例えばへキシル、ヘプ チル、ォクチル、イソオタチル、ノエル、デシル、ゥンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリ デシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、へキサデシル（セチル）、ヘプタデ シル、ォクタデシル (ステァリル）、ノナデシル、ィコシル、へネィコシル、ドコシル（ベ へ二ノレ）、トリコシノレ、テトラコシル、ペンタコシル、へキサコシル、ヘプタコシル、ォクタ コシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられる。
[0053] なお、本発明に用いられる POE— POAアルキルエーテル及び POP— POAアル キルエーテルそれぞれにおける POE— POA及び POP— POAの重合様式としては とくに制限はなぐ例えば、ブロック重合型、ランダム重合型の重合様式のものが挙げ られる。ブロック重合型としては、 ί列えばジブロックコポリマー、トリブロックコポリマー、 テトラブロックコポリマなどが挙げられる。
[0054] POE— ΡΟΑアルキルエーテルの具体的例（製品）としては、ワンダサーフ S 1400、 ワンダサーフ RL100 (V、ずれも青木油脂社製)等が挙げられる。
本発明に用いられる ΡΟΕ— ΡΟΑアルキルフエ-ルエーテルにおけるポリオキシァ ルキレンとしては、ポリオキシエチレン以外の、例えばポリオキシプロピレン、ポリオキ シブチレン等が挙げられる。
[0055] 本発明において用いられる POP— ΡΟΑアルキルフエ-ルエーテルにおけるポリオ キシアルキレンとしては、ポリオキシプロピレン以外の、例えばポリオキシエチレン、ポ リオキシブチレン等が挙げられる。
POE POAアルキルフエ-ルエーテル及び POP— POAアルキルフエ-ルエーテ ルそれぞれにおけるポリオキシエチレンのォキシエチレン及びポリオキシプロピレン のォキシプロピレンの重合度としては、好ましくは 2〜60であり、より好ましくは 4〜30 であり、ポリオキシアルキレンのォキシアルキレンの重合度としては、好ましくは 1〜4 0であり、より好ましくは 1〜20である。
[0056] POE POAアルキルフエ-ルエーテル及び POP— POAアルキルフエ-ルエーテ ルそれぞれにおけるアルキルとしては、直鎖又は分枝状の炭素数 6〜30の、例えば へキシル、ヘプチル、ォクチル、イソオタチル、ノニル、デシル、ゥンデシル、ドデシル (ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、へキサデシル（セチ ル）、ヘプタデシル、ォクタデシル (ステァリル）、ノナデシル、ィコシル、へネィコシル 、ドコシル（ベへ-ル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、へキサコシル、ヘプタ コシル、ォクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられる。
[0057] なお、本発明に用いられる POE— POAアルキルフエニルエーテル及び POP— P OAアルキルフエ-ルエーテルそれぞれにおける POE— POA及び POP— POAの 重合様式としてはとくに制限はなぐ例えば、ブロック重合型、ランダム重合型の重合 様式のものが挙げられる。ブロック重合型としては、例えばジブロックコポリマー、トリ ブロックコポリマー、テトラブロックコポリマなどが挙げられる。
[0058] POE— POAアルキルフエ-ルエーテルの具体的例（製品）としては、ェマルゲン L
40 (花王社製）が挙げられる。
[0059] 本発明に用いられる POE多環フエ-ルエーテル縮合物中のポリオキシエチレンに おけるォキシエチレンの重合度としては、好ましくは 1〜60であり、より好ましくは 2〜
30である。
[0060] POE多環フエ-ルエーテル縮合物における多環フエ-ルとは、基内に 1つの芳香 環を有する基 (置換基）が 2つ以上置換したフエニル基、基内に 2つ以上の芳香環を 有する基 (置換基)が 1つまたは複数置換したフ -ル基等が挙げられる。基内に 1 つの芳香環を有する基としては、例えばベンジル、 1 （フエ-ル)ェチル等が挙げら れる。基内に 2つ以上の芳香環を有する基としては、例えばナフチル等が挙げられる
POE多環フエ-ルエーテル縮合物の具体例（製品）としては、ニューカルゲン E15 0 (竹本油脂社製)等が挙げられる。
[0061] 本発明に用いられる POEアルキルフエ-ルエーテル硫酸塩中のポリオキシェチレ ンにおけるォキシエチレンの重合度としては、好ましくは 1〜60であり、より好ましくは 2〜30である。
POEアルキルフエ-ルエーテル硫酸塩におけるアルキルとしては、直鎖又は分枝 状の炭素数 6〜30の、例えばへキシノレ、へプチノレ、ォクチノレ、イソォクチノレ、ノニノレ、 デシル、ゥンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペン タデシル、へキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、ォクタデシル (ステァリル）、ノナデ シル、ィコシル、へネィコシル、ドコシル（ベへ-ル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタ コシル、へキサコシル、ヘプタコシル、ォクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が 挙げられる。
[0062] ポリオキシエチレンアルキルフエ-ルエーテル硫酸塩の具体的例（製品）としては、 ノ、ィテノール N08 (第一工業社製)等が挙げられる。
本発明に用いられる POE多環フエ-ルエーテル硫酸塩中のポリオキシエチレンに おけるォキシエチレンの重合度としては、好ましくは 1〜60であり、より好ましくは 2〜 30である。
[0063] POE多環フエ-ルエーテル硫酸塩における多環フエ-ルとは、基内に 1つの芳香 環を有する基 (置換基）が 2つ以上置換したフエニル基、基内に 2つ以上の芳香環を 有する基 (置換基)が 1つまたは複数置換したフ -ル基等が挙げられる。基内に 1 つの芳香環を有する基としては、例えばベンジル、 1 （フエ-ル)ェチル等が挙げら れる。基内に 2つ以上の芳香環を有する基としては、例えばナフチル等が挙げられる
POE多環フエ-ルエーテル硫酸塩の具体的例（製品）としては、ニューコール 707 SF (日本乳化剤社製)等が挙げられる。
[0064] 本発明に用いられる HLB値が 9. 0以上 13. 0未満の POE多環フエ-ルエーテル におけるポリオキシエチレンのォキシエチレンの重合度としては、好ましくは 1〜60で あり、より好ましくは 2〜30である。 HLB値が 9. 0以上 13. 0未満の POE多環フエ- ルエーテルにおける多環フエニルとは、基内に 1つの芳香環を有する基 (置換基）が 2つ以上置換したフエ-ル基、基内に 2つ以上の芳香環を有する基 (置換基）が 1つ または複数置換したフ -ル基等が挙げられる。基内に 1つの芳香環を有する基とし ては、例えばベンジル、 1 （フエ-ル)ェチル等が挙げられる。基内に 2つ以上の芳 香環を有する基としては、例えばナフチル等が挙げられる。 HLB値が 9. 0以上 13. 0未満の POE多環フエ-ルエーテルの HLB値としては、 10以上 12. 9以下が好まし く、 11以上 12. 8以下が特に好ましい。
[0065] HLB値が 9. 0以上 13. 0未満の POE多環フエ-ルエーテルにおける多環フエ- ルとは、基内に 1つの芳香環を有する基 (置換基）が 2つ以上置換したフエ二ル基、基 内に 2つ以上の芳香環を有する基 (置換基)が 1つまたは複数置換したフ 二ル基等 が挙げられる。基内に 1つの芳香環を有する基としては、例えばベンジル、 1 （フエ -ル)ェチル等が挙げられる。基内に 2つ以上の芳香環を有する基としては、例えば ナフチル等が挙げられる。
HLB値が 9. 0以上 13. 0未満の POE多環フ ニルエーテルの具体的例（製品）と しては、ェマルゲン A60 (HLB値 12. 8 花王社製）、 BLAUNON DSP12. 5 (H LB値 12. 7 青木油脂社製）、 BLAUNON TSP20 (HLB値 12. 7 青木油脂社 製）、 BLAUNON DSP— 9 (HLB値 11. 4 青木油脂社製）、 BLAUNON DSP - 7. 5 (HLB値 9. 2 青木油脂社製）、 BLAUNON TSP— 16 (HLB値 12. 7 青 木油脂社製)等が挙げられる。
[0066] 本発明に用いられる POE— POAアルキルエーテル、 POP— POAアルキルエーテ ル、 POE— POAアルキルフエニルエーテル、 POP— POAアルキレンアルキルフエ -ルエーテル、 POE多環フエ-ルエーテル縮合物、 POEアルキルフエ-ルエーテル 硫酸塩、 POE多環フエ-ルエーテル硫酸塩、及び HLB値が 9. 0以上 13. 0未満の POE多環フエ-ルエーテルの濃度としては、 LDL中トリグリセリドの反応を可能とする 濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が 0. 01〜10%であることが好ま しぐ 0. 02〜5%がより好ましい。また、本発明においては、これらを 2種類以上組み 合わせて用いることもできる。
[0067] なお、 HLB値とは、親水性一親油性均衡値を意味する。本発明に用いられる POE 多環フエニルエーテルの HLB値は、界面活性剤ハンドブック（吉田 時行ら著 工業 図書株式会社)や新界面活性剤 (堀口 博著 三共出版株式会社)に記載の方法で 算出することが可能である。また、該 HLB値としては、各種界面活性剤の製造メーカ 一のカタログやパンフレットに記載されている HLB値を利用することも可能である。
[0068] 本発明に用いられる胆汁酸誘導体としては、 LDL中トリグリセリドの測定を可能とす る胆汁酸誘導体であれば特に制限はないが、例えば陰イオン性界面活性作用を有 する胆汁酸誘導体、両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体、非イオン性界面活 性作用を有する胆汁酸誘導体等が挙げられる。
陰イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体としては、例えばコール酸もしくは その塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココール酸もしくはその塩、リトコール酸も しくはその塩、デォキシコール酸もしくはその塩、ケノデォキシコール酸もしくはその 塩、ウルソデォキシコール酸もしくはその塩、 7 ォキソリトコール酸もしくはその塩、 1 2 ォキソリトコール酸もしくはその塩、 12-ォキソケノデォキシコ一ル酸もしくはその 塩、 7—ォキソデォキシコール酸もしくはその塩、ヒォコール酸もしくはその塩、ヒォデ ォキシコール酸もしくはその塩、デヒドロコール酸もしくはその塩等が挙げられる。塩と しては、例えばアンモ-ゥム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩
、カルシウム塩等が挙げられる。
[0069] 両性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体としては、例えば一般式 (I)
[0070] [化 5]
R1 - CH2 - CH(R2) - CH2 - S03~ ( I )
[0071] [式中、 R1は、 3—（3 コラミドプロピル)ジメチルアンモ-ォ基であり、 R2は、水素原 子又は水酸基である]で表される化合物 [以下、化合物 (I)という]等が挙げられる。 以下、 R2が水素原子である化合物 (I)を CHAPSと、 R2が水酸基である化合物 (I)を CHAPSOとよぶ。
非イオン性界面活性作用を有する胆汁酸誘導体としては、例えば一般式 (II)
[0072] [化 6]
Figure imgf000020_0001
[0073] (Xは、水素原子又は水酸基を表し、 R3及び R4は、同一又は異なって、置換もしくは 非置換のアルキル、又は、置換もしくは非置換のアルカノィルを表す)で表されるィ匕 合物 [以下、化合物（Π)という]等が挙げられる。アルキル、アルカノィルにおけるアル キルとしては、直鎖又は分枝状の炭素数 1〜10の、例えばメチル、ェチル、プロピル 、イソプロピル、ブチル、イソブチル、 sec—ブチル、 tert—ブチル、ペンチル、ネオペ ンチル、へキシル、ヘプチル、ォクチル、ノエル、デシル等が挙げられる。置換アルキ ル及び置換アルカノィルにおける置換基としては、例えば水酸基、ハロゲン原子等が 挙げられる。ハロゲン原子は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子を意味する。 化合物 (Π)のうち、 R3及び R4が共に、
[0074] [化 7]
COCH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH2OH
[0075] (以下、置換基 Aと 、う）である化合物が好ま ヽ。以下、 X、 R3及び R4がそれぞれ、 水素原子、置換基 A及び置換基 Aである化合物を deoxy— BIGCHAP、水酸基、置 換基 A及び置換基 Aである化合物を BIGCHAPと!、う。
本発明に用いられる胆汁酸誘導体の濃度としては、 LDL中トリグリセリドの測定を 可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が 0. 001〜10%であ ることが好ましぐ 0. 01〜1%がより好ましい。本発明においては、胆汁酸誘導体を 2 種類以上用いても良い。
[0076] 本発明の LDL中トリグリセリドの測定において用いられる反応液としては、例えば脱 イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられる力 緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩 衝剤としては、例えばトリス (ヒドロキシメチル)ァミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ 酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
[0077] グッドの緩衝剤としては、例えば 2 モルホリノエタンスルホン酸（MES)、ビス（2— ヒドロキシェチル)イミノトリス（ヒドロキシメチル)メタン（Bis— Tris)、 N— (2—ァセトァ ミド)イミノニ酢酸 (ADA)、ピペラジン一 N, N，一ビス（2—エタンスルホン酸） (PIPE S)、 N— (2 ァセトアミド） - 2-アミノエタンスルホン酸 (ACES)、 3 -モルホリノ一 2 —ヒドロキシプロパンスルホン酸（MOPSO)、 N, N ビス（2—ヒドロキシェチル） 2 アミノエタンスルホン酸（BES)、 3—モルホリノプロパンスルホン酸（MOPS)、 N— 〔トリス（ヒドロキシメチル)メチル〕 2 アミノエタンスルホン酸 (TES)、 2— [4- (2- ヒドロキシェチル） 1—ピペラジ -ル〕エタンスルホン酸（HEPES)、 3—〔N, N ビ ス（2—ヒドロキシェチル）ァミノ〕— 2—ヒドロキシプロパンスルホン酸（DIPSO)、 N— 〔トリス（ヒドロキシメチル)メチル〕 - 2-ヒドロキシ 3—ァミノプロパンスルホン酸 (TA PSO)、ピペラジン一 N, N，一ビス（2 ヒドロキシプロパンスルホン酸）（POPSO)、 3 —〔4— (2—ヒドロキシェチル） 1—ピペラジ -ル〕 2—ヒドロキシプロパンスルホン 酸（HEPPSO)、 3—〔4一（2 ヒドロキシェチル） 1ーピぺラジュル〕プロパンスル ホン酸〔（H) EPPS〕、 N 〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Tricine)、 N, N
—3 ァミノプロパンスルホン酸（TAPS)、 N シクロへキシル 2 アミノエタンスル ホン酸（CHES)、 N -シクロへキシル 3 ァミノ 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸 (CAPSO)、 N シクロへキシル—3—ァミノプロパンスルホン酸（CAPS)等が挙げ られる。緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、 0. 001 〜2. Omol/!L力好ましく、 0. 005〜1. Omol/:L力 ^より好まし!/ヽ。
[0078] 本発明の LDL中のトリグリセリドの測定は、下記工程 (i)〜 (iv)を順次行うことによつ て達成される。
( 検体及び POE— POA多環フエ-ルエーテル、 POP— POA多環フエ-ルエー テル、 POEアルキルフエ-ルエーテルホルムアルデヒド縮合物、及び HLB値が 13. 0以上 17. 0以下の POE多環フエ-ルエーテル力もなる群より選ばれる少なくとも一 つの界面活性剤を含有する反応液中で、該検体にリポプロテインリパーゼを作用さ せ、遊離型グリセロールを生成させる工程、 (ii)前記工程 (i)の反応液中に存在する遊離型グリセロールを除去する工程、
(iii)前記工程 (ii)で遊離型グリセロールを除去した後の反応液に、 POE-POAT ルキルエーテル、 POP— POAアルキルエーテル、 POE— POAアルキルフエ-ルェ 一テル、 POP— POAアルキルフエ-ルエーテル、 POE多環フエ-ルエーテル縮合 物、 POEアルキルフエ-ルエーテル硫酸塩、 POE多環フエ-ルエーテル硫酸塩、及 び HLB値が 9. 0以上 13. 0未満の POE多環フエ-ルエーテルからなる群より選ば れる少なくとも一つの界面活性剤の存在下、リポプロテインリパーゼを作用させ、遊離 型グリセロール生成させる工程、
(iv)前記工程 (iii)で生成する遊離型グリセロールを測定する工程。
[0079] 各工程の反応の反応温度としては、例えば 10〜50°Cで、好ましくは 20〜40°Cで あり、反応時間としては、 1〜20分、好ましくは 2〜： L0分である。工程 (i)と工程 (ii)、 及び工程 (iii)と工程 (iv)は、それぞれ同時に行うこともできる。
工程 (ii)における、反応液中に存在する遊離型グリセロールの除去は、遊離型ダリ セロールを工程 (iv)で生成する遊離型グリセロールの測定に係る成分以外の成分に 酵素的に変換することにより行うことができる。なお、工程 (iv)における遊離型グリセ口 ールの測定方法との組み合わせで工程 (ii)の遊離型グリセロールの除去方法は、当 業者が適宜選択できる。
[0080] 遊離型グリセロールの除去は、例えば遊離型グリセロール力 過酸ィ匕水素を生成 する試薬を遊離型グリセロールに作用させて過酸化水素を生成させ、生成した過酸 化水素を除去することにより行う方法が挙げられる。該除去方法を用いる場合の工程 (iv)の遊離型グリセロールの測定方法としては、例えば遊離型グリセロール力 過酸 化水素を生成する試薬を作用させ過酸化水素を生成させ、生成した過酸化水素を 測定する方法が挙げられる。
[0081] 遊離型グリセロール力 過酸ィ匕水素を生成させる試薬としては、例えばグリセロー ルキナーゼ及びグリセロール 3—リン酸ォキシダーゼを含有する試薬、グリセロール ォキシダーゼを含有する試薬等が挙げられる。
本発明におけるグリセロールキナーゼとしては、グリセロールを ATPの存在下グリセ ロール 3—リン酸に変換する活性を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動 物、植物又は微生物由来のグリセロールキナーゼの他、遺伝子工学的な手法により 製造されるグリセロールキナーゼ等も用いることができ、グリセロールキナーゼ（GYK - 301 ;東洋紡績社製）、グリセロールキナーゼ (GYK— 311 ;東洋紡績社製）、ダリ セロールキナーゼ (GKZ；旭化成社製)等の市販品を使用することもできる。
[0082] グリセロールキナーゼは、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であ つてもよい。化学的に修飾されたグリセロールキナーゼは、例えば前述の化学修飾 剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本発明の方法に用いられるグリセロールキナーゼの濃度としては、 LDL中トリグリセ リドの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で 0. 1〜20UZ mLの濃度であることが好ましぐ 0. 2〜： LOUZmLの濃度であることがより好ましい。 また、本発明においては、 2種類以上のグリセロールキナーゼを組み合わせて用いる ことちでさる。
[0083] 本発明におけるグリセロール 3 リン酸ォキシダーゼとしては、グリセロール 3 リン 酸力 過酸ィ匕水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなぐ例えば動 物、植物又は微生物由来のグリセロール 3—リン酸ォキシダーゼの他、遺伝子工学 的な手法により製造されるグリセロール 3—リン酸ォキシダーゼ等も用いることができ 、 L- ひーグリセ口リン酸ォキシダーゼ (G30— 301 ;東洋紡績社製）、 L—ひ ダリ セロリン酸ォキシダーゼ（GPOM ;旭化成社製）、 L— α—グリセ口リン酸ォキシダー ゼ (GPOSP；旭化成社製)等の市販品を用いることもできる。
[0084] グリセロール 3 リン酸ォキシダーゼは、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾さ れた酵素であってもよい。化学的に修飾されたグリセロール 3—リン酸ォキシダーゼ は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することが できる。
本発明の方法に用いられるグリセロール 3—リン酸ォキシダーゼの濃度としては、 L DL中トリグリセリドの測定を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で l〜60UZmLの濃度であることが好ましぐ 2〜30UZmLの濃度であることがより好 ましい。また、本発明においては、 2種類以上のグリセロール 3 リン酸ォキシダーゼ を組み合わせて用いることもできる。 [0085] 本発明におけるグリセロールォキシダーゼとしては、グリセロールより過酸ィ匕水素を 生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなぐ例えば動物、植物又は微生物 由来のグリセロールォキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるグリセ ロールォキシダーゼ等も用いることができ、市販品を用いることもできる。グリセロール ォキシダーゼは、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい 。化学的に修飾されたグリセロール 3—リン酸ォキシダーゼは、例えば前述の化学修 飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。本発明におけるグ リセロールォキシダーゼの濃度としては、 LDL中トリグリセリドの測定を可能とする濃 度であれば特に制限はないが、反応液中で l〜400UZmLの濃度であることが好ま しぐ 2〜200UZmLの濃度であることがより好ましい。また、本発明においては、 2 種類以上のグリセロールォキシダーゼを組み合わせて用いることもできる。
[0086] 前記の方法により遊離型グリセロール力 過酸ィ匕水素を生成させる試薬を用いて 遊離型グリセロール力 発生させた過酸ィ匕水素は、過酸ィ匕水素除去試薬により除去 することができる。該過酸化水除去試薬としては、例えばカタラーゼを含む試薬、パ 一ォキシダーゼ等の過酸ィヒ活性物質と、酸ィヒカップリング型色原体の片方、すなわ ち、フエノール系もしくはァ-リン系等の水素供与体ィ匕合物又は 4ーァミノアンチピリ ン等のカプラーが挙げられる。過酸ィ匕水素除去試薬としてカタラーゼを含む試薬を 用いる場合は、第一工程においてカタラーゼを該過酸ィ匕水素に作用させて該過酸 化水素を水と水素に変換することにより、除去することができる。過酸化水素除去試 薬としてパーォキシダーゼ等の過酸ィヒ活性物質と、酸ィヒカップリング型色原体の片 方を用いる場合は、該過酸化水素を過酸化活性物質の存在下、該酸化カップリング 型色原体の片方と反応させて、無色の物質を生成させることによって、除去すること ができる。
[0087] 過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを含む試薬を使用する場合のカタラーゼの 濃度としては、 HDL中トリグリセリド及び遊離のグリセロール由来の過酸ィ匕水素を除 去可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で 50〜4000UZmLの濃 度であることが好ましぐ 100〜2000UZmLの濃度であることがより好ましい。 過酸化水素除去試薬としてパーォキシダーゼ等の過酸化活性物質と、酸化カップ リング型色原体の片方との組み合わせを使用する場合、過酸化活性物質の濃度とし ては、該過酸ィ匕活性物質と HDL中のトリグリセリド及び遊離のグリセロール由来の過 酸ィ匕水素との反応により、無色の物質が生成し得る濃度であれば特に制限はない。 過酸化活性物質として、パーォキシダーゼを用いる場合、パーォキシダーゼの濃度 としては、反応液中で 1〜： LOOUZmLの濃度であることが好ましぐ 2〜50UZmLの 濃度であることがより好まし 、。
[0088] カプラーとしては、例えば 4ーァミノアンチピリン（4— AA)、 3—メチルー 2 べンゾ チアゾリノンヒドラゾン等が挙げられる。
フエノール系水素供与体化合物としては、フエノール、 4 クロ口フエノール、 3—メ チルフヱノール、 3 ヒドロキシ—2, 4, 6 トリョード安息香酸（HTIB)等が挙げられ る。
[0089] ァ-リン系水素供与体化合物としては、 N—（3 スルホプロピル）ァ-リン、 N ェ チル— N— (2—ヒドロキシ— 3—スルホプロピル）— 3—メチルァ-リン (TOOS)、 N —ェチルー N— (2—ヒドロキシ— 3—スルホプロピル） - 3, 5—ジメチルァ-リン（M AOS)、 N—ェチルー N— (2 ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） 3, 5 ジメトキシ ァ-リン（DAOS)、 N ェチル N— (3—スルホプロピル）—3—メチルァ-リン (T OPS)、 N— (2 ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） - 3, 5 ジメトキシァ-リン（HDA OS)、 N, N—ジメチル— 3—メチルァ-リン、 N, N—ジ（3—スルホプロピル）—3, 5 —ジメトキシァ-リン、 N ェチル N— (3—スルホプロピル） 3—メトキシァ-リン、 N ェチル N— (3—スルホプロピル）ァ-リン、 N ェチル N— (3—スルホプロ ピル）—3, 5—ジメトキシァ-リン、 N— (3—スルホプロピル） - 3, 5—ジメトキシァ- リン、 N ェチル N— (3—スルホプロピル） - 3, 5—ジメチルァ-リン、 N—ェチル -N- (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） 3—メトキシァ-リン、 N ェチル N - (2 ヒドロキシ一 3—スルホプロピル）ァ-リン、 N ェチル N— (3—メチルフエ -ル） N，—サクシ-ルエチレンジァミン（EMSE)、 N—ェチルー N— (3—メチル フエ-ル） N，一ァセチルエチレンジァミン、 N ェチル N— (2 ヒドロキシ一 3— スルホプロピル）—4—フルオロー 3, 5—ジメトキシァ-リン（F— DAOS)等が挙げら れる。 [0090] 過酸化水素除去試薬として、パーォキシダーゼ等の過酸ィヒ活性物質と、酸化カツ プリング型色原体の片方とを使用する場合、該酸ィ匕カップリング型色原体の片方の 濃度としては、生成した過酸ィ匕水素を除去し得る濃度であれば特に限定はされない 力 好ましくは 0. 05〜4gZL、より好ましくは 0. l〜2g/Lである。
本発明の工程 (ii)において、過酸ィ匕水素除去試薬としてカタラーゼを用いる場合は 、工程 (iv)においてカタラーゼ阻害剤を共存させることが好ましい。カタラーゼ阻害 剤としては、アジ化ナトリウム、 H S、 HCN、 NH OH、 3—ァミノ一 1, 2, 4—トリァゾ
2 2
ール等が挙げられ、使用する濃度としてはカタラーゼ活性を阻害し、工程 (iv)で生成 する過酸ィ匕水素の測定に影響を及ぼさな 、濃度であればとくに限定はされな 、が、 好ましくは 0. 5〜60mmolZL、より好ましくは l〜30mmol/Lである。
[0091] 本発明の工程 (iv)において生成した LDL中トリグリセリド由来の過酸ィ匕水素の測定 方法としては、例えば直接過酸化水素電極で測定する方法、過酸化水素測定試薬 により測定する方法が挙げられる。過酸化水素測定試薬は、生成した過酸化水素を 検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色 素、発光物質等が挙げられるが、色素が好ましい。検出可能な物質が色素の場合に は、過酸化水素測定試薬は、酸化発色型色原体及びパーォキシダーゼ等の過酸化 活性物質を含有する。酸化発色型色原体としては、例えば前述の酸化カップリング 型色原体や後述のロイコ型色原体が挙げられる。検出可能な物質が発光物質の場 合には、過酸化水素測定試薬は、発光物質を含有する。発光物質としては、例えば ルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アタリジ-ゥムエステル等が挙げられる。
[0092] 過酸化水素測定試薬として、酸化発色型色原体及びパーォキシダーゼ等の過酸 化活性物質を含有する試薬を用いる場合には、過酸化水素を、過酸化活性物質の 存在下に酸化発色型色原体と反応させ色素を生成し、生成した色素を測定すること により、過酸ィ匕水素を測定することができる。また、発光物質を含有する過酸化水素 測定試薬を用いる場合には、過酸化水素を、発光物質と反応させ、生じた光量子を 測定することにより、過酸ィ匕水素を測定することができる。
[0093] 酸化カップリング型色原体は、パーォキシダーゼ等の過酸ィヒ活性物質の存在下、 過酸化水素と反応し、酸化カップリング反応により色素を生成する色原体である。前 述のように、 4 AA等のカプラーとフエノール系又はァ-リン系水素供与体ィ匕合物と が酸化カップリング反応により色素を生成する。
ロイコ型色原体は、パーォキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、過酸化水素 と反応し、単独で色素を生成する色原体である。具体的には、 10— N—カルボキシメ チルカルバモイル— 3, 7 ビス（ジメチルァミノ）— 10H フエノチアジン（CCAP)、 10— N—メチルカルバモイルー 3, 7 ビス（ジメチルァミノ）— 10H フエノチアジン (MCDP)、 N- (カルボキシメチルァミノカルボ-ル）—4, 4， 一ビス（ジメチルァミノ） ジフエ-ルァミンナトリウム塩（DA— 64)、 4, 4， 一ビス（ジメチルァミノ）ジフエ-ルァ ミン、ビス〔3—ビス（4 -クロ口フエ-ル)メチル 4—ジメチルァミノフエ-ル〕ァミン（B CMA)等が挙げられる。
[0094] 工程 (ii)にお 、て、過酸化水素除去試薬として、パーォキシダーゼ等の過酸ィ匕活 性物質と、酸化カップリング型色原体の片方とを使用し、工程 (iv)において、過酸ィ匕 水素測定試薬として、酸ィヒカップリング型色原体およびパーォキシダーゼ等の過酸 化活性物質を使用する場合、工程 (ii)において使用する酸化カップリング型色原体 の別の片方を工程 (iv)における過酸ィ匕水素測定試薬として使用することができる。即 ち、工程 (ii)の過酸ィ匕水素の除去工程において、酸化カップリング色原体として 4 AA等のカプラーを用いた場合には、工程 (iv)において、フエノール系もしくはァ-リ ン系等の水素供与体ィ匕合物を添加すればよぐまた、過酸化水素の除去工程にお いて、フエノール系もしくはァ-リン系水素供与体ィ匕合物を用いた場合には、工程 (iv
)において、 4 AA等のカプラーを添加すればよい。
[0095] 過酸ィ匕水素の測定にぉ 、て、過酸ィ匕活性物質の濃度は、測定に適した濃度であ れば特に制限はな 、が、過酸ィ匕活性物質としてパーォキシダーゼを用いる場合は、
1〜： LOOUZmLが好ましぐ 2〜50UZmLがより好ましい。また、酸化発色型色原 体の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、 0. 01〜： LOgZLが好 ましく、 0. 02〜5g/L力より好まし!/ヽ。
[0096] 本発明の工程 (ii)における、反応液中に存在する遊離型グリセロールを除去する 工程と、工程 (iv)における遊離型グリセロールの測定方法との組み合わせは前述の 例に限定されない。 例えば、工程 (ii)で、生成する遊離型グリセロールにグリセロールキナーゼを作用さ せて、該遊離型グリセロールをグリセロール 3—リン酸に変換し、工程 (iv)で、グリセ口 ールキナーゼ不活性化剤等の存在下、グリセロールォキシダーゼを作用させて、生 成する過酸ィ匕水素を測定する方法等を例示することができる。
[0097] 本発明の LDL中トリグリセリドの測定用キットは、以下の第一試薬及び第二試薬か らなる 2試薬系が好ましいが、適宜 3試薬系等のキット形態をとることもできる。
[0098] 第一試薬：
POE— POA多環フエ-ルエーテル、 POP— POA多環フエ-ルエーテル、 POEァ ルキルフエ-ルエーテルホルムアルデヒド縮合物及び HLB値が 13. 0以上 17. 0以 下の POE多環フエニルエーテル力 なる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性 剤、リポプロテインリパーゼ及び遊離型グリセロール除去試薬を含有する試薬。
[0099] 第二試薬：
POE— POAアルキルエーテル、 POP— POAアルキルエーテル、 POE— POAァ ルキルフエ-ルエーテル、 POP— POAアルキルフエ-ルエーテル、 POE多環フエ二 ルエーテル縮合物、 POEアルキルフ -ルエーテル硫酸塩、 POE多環フ -ルェ 一テル硫酸塩、及び HLB値が 9. 0以上 13. 0未満の POE多環フエ-ルエーテルか らなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤及び遊離型グリセロール測定試薬 を含有する試薬。
[0100] 本発明の LDL中トリグリセリドの測定用キットに用いられる、リポプロテインリパーゼ 、界面活性剤、遊離型グリセロール除去試薬、遊離型グリセロール測定試薬は、それ ぞれ、前述のものが挙げられる。
[0101] 第一試薬と第二試薬とからなる 2試薬系の LDL中トリグリセリド測定用キットにおい ては、トリグリセリドから過酸ィ匕水素を発生させる酵素群は第一試薬に含有されるが、 さらに第二試薬にも含有されていてもよい。
過酸化水素除去試薬は、第一試薬に含有される。過酸化水素除去試薬としてカタ ラーゼを使用する場合は、第二試薬はカタラーゼ活性阻害剤を含有するのが好まし い。該カタラーゼ活性阻害剤としては、前述のカタラーゼ活性阻害剤が挙げられる。 過酸化水素除去試薬としてパーォキシダーゼ等の過酸化活性物質と、酸化カツプリ ング型色原体の片方とを含有する試薬を使用する場合、該過酸化活性物質と該片 方の酸ィ匕カップリング型色原体は、過酸化水素測定試薬の構成成分も兼ねて ヽるの で、特に過酸ィ匕水素除試薬を除去又は不活性ィ匕する必要はなぐ第二試薬に、発色 に必要な別の片方の酸ィ匕カップリング型色原体を含有させればよい。また、過酸ィ匕 水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合においても、過酸ィ匕水素測定試薬中 の一部の構成成分、特に、酸化カップリング型色原体の片方は第一試薬に含有され てもよい。胆汁酸誘導体は、第一試薬、第二試薬のいずれか又は両方に含有されて も良いが、第二試薬に含有されることが好ましい。
[0102] 本発明の LDL中トリグリセリド測定用キットには、必要に応じて、反応液、安定化剤 、防腐剤、影響物質除去剤、反応促進剤、非特異反応抑制等が含有されてもよい。 反応液としては、例えば前述の反応液等が挙げられる。安定化剤としては、例えばェ チレンジァミン四酢酸（EDTA)、シユークロース、塩化カルシウム、アミノ酸類、アル ブミン等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等が挙げ られる。影響物質除去剤としては、例えばァスコルビン酸の影響を消去するためのァ スコルビン酸ォキシダーゼ等が挙げられる。反応促進剤としては、例えばコリパーゼ、 ホスホリパーゼ等の酵素、硫酸ナトリウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸マグネシウム等の塩 類等が挙げられる。非特異反応抑制剤としては、デキストラン硫酸等の高分子化合 物などが挙げられる。
[0103] 本発明の LDL中トリグリセリド測定用キットは、凍結乾燥された状態でも、反応液に 溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態のキットを用いて検体中の LDL中トリ グリセリドを測定する場合には、当該キットは前述の水性媒体または反応液に溶解し て使用することができる。
本発明の LDL中トリグリセリド測定用キットにおけるリポプロテインリパーゼの含量と しては、水性媒体で溶解された状態での濃度が 0. 01〜1200UZmLとなる含量が 好ましぐ 0. 02〜600UZmLとなる含量がより好ましい。本発明の LDL中トリグリセ リド測定用キットにおけるグリセロールキナーゼの含量としては、水性媒体で溶解され た状態での濃度が 0. l〜60UZmLとなる含量が好ましぐ 0. 2〜30UZmLとなる 含量がより好ましい。本発明の LDL中トリグリセリド測定用キットにおけるグリセロール 3—リン酸ォキシダーゼの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度力^〜 180U/mLとなる含量が好ましぐ 2〜90U/mLとなる含量がより好ましい。
[0104] 本発明の LDL中トリグリセリド測定用キットにおける界面活性剤の含量としては、水 性媒体で溶解された状態での濃度が 0. 01〜20%となる含量が好ましぐ 0. 02〜1 0%となる含量がより好ましい。
過酸ィ匕水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合の LDL中トリグリセリド測定 用キットにおけるカタラーゼの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が 0. 05-1. 2kU/mLとなる含量が好ましぐ 0. 1〜6. OkU/mLとなる含量がより 好ましい。また、過酸ィ匕水素除去試薬としてカタラーゼを使用する場合の LDL中トリ グリセリド測定用キットにおけるカタラーゼ活性阻害剤の含量としては、水性媒体で溶 解された状態での濃度が 0. 5〜180mmol/Lとなる含量が好ましぐ l〜90mmol /Lとなる含量がより好ま 、。
[0105] 過酸ィヒ水素除去試薬としてパーォキシダーゼ等の過酸ィヒ活性物質と、酸化カップ リング型色原体の片方とを含有する試薬を使用する場合の LDL中トリグリセリド測定 用キットにおけるパーォキシダーゼ及び該酸ィ匕カップリング型色原体の含量としては 、それぞれ、水性媒体で溶解された状態での濃度が l〜600UZmL、 0. 05〜8gZ Lとなる含量が好ましぐ 2〜150U/mL、 0. l〜4g/Lとなる含量がより好ましい。
[0106] 過酸ィ匕水素測定試薬としてパーォキシダーゼと酸ィ匕カップリング型色原体を含有 する試薬を使用する場合の LDL中トリグリセリド測定用キットにおけるバーオキシダ ーゼ及び該酸化カップリング型色原体の含量としては、それぞれ、水性媒体で溶解 された状態での濃度が l〜600UZmL、 0. 05〜8gZLとなる含量が好ましぐ 2〜1 50UZmL、 0. l〜4g/Lとなる含量がより好ましい。
[0107] 本発明の LDL中トリグリセリド測定用キットにおける胆汁酸誘導体の含量としては、 水性媒体で溶解された状態での濃度が 0. 01〜20%となる含量が好ましぐ 0. 02 〜10%となる含量がより好ましい。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら 限定するものではない。尚、本実施例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を 使用した。 [0108] PIPES (同仁ィ匕学社製）、 MES (同仁ィ匕学社製）、 EMSE (ダイトーケミックス社製） 、 4—ァミノアンチピリン (埼京化成社製）、 CEBP— M (リポプロテインリパーゼ活性を 有する酵素;旭化成社製)、 GYK— 301 (グリセロールキナーゼ;東洋紡績社製)、 G POM (グリセロール 3—リン酸ォキシダーゼ;旭化成社製）、カタラーゼ（シグマ社製） 、パーォキシダーゼ (東洋紡績社製)、アジィ匕ナトリウム（関東ィ匕学社製)、ェマルゲン B66 (花王社製）、ニューコール 610 (日本乳化剤社製）、ニューコール 2608F (日本 乳化剤社製）、ニューカルゲン GP120 (竹本油脂社製）、 -ッコール R1020 (日光ケ ミカルズ社製）、ェマルゲン A60 (花王社製）、 BLAUNON DSP12. 5 (青木油脂 社製）、ノ、ィテノール N08 (第一工業社製）、ェマルゲン L40 (花王社製）、二ユーコ一 ル 707SF (日本乳化剤社製）、ワンダサーフ S 1400 (青木油脂社製）、ニューカルゲ ン E150 (竹本油脂社製）、コール酸ナトリウム（ァクロス社製）、ェマルゲン 909 (POE ノ-ルフエ-ルエーテル HLB12. 4 :花王社製）、エマルミン NL70 (POEラウリルェ 一テル HLB12. 4 :三洋化成社製)。
実施例 1
[0109] 以下の第一試薬 (試薬 A)及び第二試薬 (試薬 a)力もなる LDL中トリグリセリド測定 用キットを調製した。
第一試薬 (試薬 A)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000031_0001
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
エマノレゲン B66 5 g/L
CEBP-M 2 kU/L
GYK- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬 (試薬 a)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L パーォキシダーゼ 20 kU/L
アジィ匕ナトリウム 0. 5 g/L
ェマルゲン A60 20 g/L
実施例 2
[0110] 以下の第一試薬 (試薬 B)及び第二試薬 (試薬 a)力もなる LDL中トリグリセリド測定 用キットを調製した。
第一試薬 (試薬 B)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000032_0001
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
ニューコール 610 5 g/L
CEBP-M 2 kU/L
GYK- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬 (試薬 a)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
アジィ匕ナトリウム 0. 5 g/L
ェマルゲン A60 20 g/L
実施例 3
[0111] 以下の第一試薬 (試薬 C)及び第二試薬 (試薬 a)力もなる LDL中トリグリセリド測定 用キットを調製した。
第一試薬 (試薬 C)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000032_0002
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L ニューコール 2608F 5 g,
CEBP-M 2 kU/L
GYK- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬 (試薬 a)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
アジィ匕ナトリウム 0. 5 g/L
ェマルゲン A60 20 g/L
実施例 4
以下の第一試薬 (試薬 D)及び第二試薬 (試薬 a)カゝらなる LDL中トリグリセリド測定 用キットを調製した。
第一試薬 (試薬 D)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000033_0001
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
ニッコール R1020 2 g/L
CEBP-M 2 kU/L
GYK- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬 (試薬 a)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
アジィ匕ナトリウム 0. 5 g/L ェマルゲン A60 20 g/L
実施例 5
[0113] 以下の第一試薬 (試薬 E)及び第二試薬 (試薬 a)カゝらなる LDL中トリグリセリド測定 用キットを調製した。
第一試薬 (試薬 E)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000034_0001
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
ニューカルゲン GP 120 5 g/L
CEBP-M 2 kU/L
GYK- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬 (試薬 a)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
アジィ匕ナトリウム 0. 5 g/L
ェマルゲン A60 20 g/L
実施例 6
[0114] 以下の第一試薬 (試薬 A)及び第二試薬 (試薬 b)からなる LDL中トリグリセリド測定 用キットを調製した。
第一試薬 (試薬 A)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000034_0002
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
エマノレゲン B66 5 g/L
CEBP-M 2 kU/L GYK- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬 (試薬 b)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
アジィ匕ナトリウム 0. 5 g/L
BLUNON DSP12. 5 10 g/L
実施例 7
以下の第一試薬 (試薬 A)及び第二試薬 (試薬 c)カゝらなる LDL中トリグリセリド測定 用キットを調製した。
第一試薬 (試薬 A)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000035_0001
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
エマノレゲン B66 5 g/L
CEBP-M 2 kU/L
GYK- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬 (試薬 c)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
アジィ匕ナトリウム 0. 5 g/L
エマルゲン L40 5 g,
実施例 8 [0116] 以下の第一試薬 (試薬 A)及び第二試薬 (試薬 d)力もなる LDL中トリグリセリド測定 用キットを調製した。
第一試薬 (試薬 A)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000036_0001
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
エマノレゲン B66 5 g/L
CEBP-M 2 kU/L
GYK- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬 (試薬 d)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
アジィ匕ナトリウム 0. 5 g/L
ハイテノール N08 6 g/L
実施例 9
[0117] 以下の第一試薬 (試薬 A)及び第二試薬 (試薬 e)カゝらなる LDL中トリグリセリド測定 用キットを調製した。
第一試薬 (試薬 A)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000036_0002
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
エマノレゲン B66 5 g/L
CEBP-M 2 kU/L
GYK- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬 (試薬 e)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
アジィ匕ナトリウム 0. 5 g/L
ニューコール 707SF 5 g,
実施例 10
[0118] 以下の第一試薬 (試薬 A)及び第二試薬 (試薬 f )カゝらなる LDL中トリグリセリド測定 用キットを調製した。
第一試薬 (試薬 A)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000037_0001
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
エマノレゲン B66 5 g/L
CEBP-M 2 kU/L
GYK- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬 (試薬 f)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
アジィ匕ナトリウム 0. 5 g/L
ワンダサーフ S 1400 6 g/L
実施例 11
[0119] 以下の第一試薬 (試薬 A)及び第二試薬 (試薬 g)からなる LDL中トリグリセリド測定 用キットを調製した。 第一試薬 (試薬 A)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000038_0001
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
エマノレゲン B66 5 g/L
CEBP-M 2 kU/L
GYK- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬 (試薬 g)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
アジィ匕ナトリウム 0. 5 g/L
ニューカルゲン E 150 6 g/L
比較例 1
以下の第一試薬 (試薬 F)及び第: ：試薬 (試薬 a)力もなる LDLトリグリセリド測定用 キットを調製した。
第一試薬 (試薬 F)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000038_0002
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
CEBP-M 2 kU/L
GYK- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬 (試薬 a)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L 4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
アジィ匕ナトリウム 0. 5 g/L
ェマルゲン A60 20 g/L
比較例 2
[0121] 以下の第一試薬 (試薬 A)及び第 ：試薬 (試薬 h)力もなる LDLトリグリセリド測定用 キットを調製した。
第一試薬 (試薬 A)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000039_0001
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
エマノレゲン B66 5 g/L
CEBP-M 2 kU/L
GYK- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬 (試薬 h)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
アジィ匕ナトリウム 0. 5 g/L
比較例 3
[0122] 以下の第一試薬 (試薬 A)及び第二試薬 (試薬 i)力もなる LDLトリグリセリド測定用 キットを調製した。
第一試薬 (試薬 A)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000039_0002
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L エマノレゲン B66 5 g,
CEBP-M 2 kU/L
GYK- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬 (試薬 i)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
アジィ匕ナトリウム 0. 5 g/L
ェマルゲン 909 10 g/L
比較例 4
以下の第一試薬 (試薬 A)及び第二試薬 (試菊）カゝらなる LDLトリグリセリド測定用 キットを調製した。
第一試薬 (試薬 A)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000040_0001
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
エマノレゲン B66 5 g/L
CEBP-M 2 kU/L
GYK- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬 (試菊）
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
アジィ匕ナトリウム 0. 5 g/L エマルミン NL70 6 g/L
実施例 12
[0124] 「新生化学実験講座 4」（東京化学同人）に記載の超遠心法に従! 、、ヒト血清より H DL (比重〉 1. 063)、狭義の LDL (比重 1. 019〜1. 063)、 IDL (比重 1. 006〜1 . 019)、 VLDL (比重 0. 96〜： L 006)及び CM (比重 < 0. 96)の 5つのリポ蛋白分 画をそれぞれ分取し、実施例 1〜： L 1並びに比較例 1〜4のキットを用いて、各リポ蛋 白分画中トリグリセリドの反応率を算出した。
( 1)各リポ蛋白分画中トリグリセリドとそれぞれ実施例 1〜 11並びに比較例 1〜4の キットとの反応による各リポ蛋白分画における「反応吸光度」の算出
日立 7170S形自動分析装置を用いて、以下の操作により「反応吸光度」を算出し た。
[0125] 各リポ蛋白分画を検体とし反応セルへ（2 L)添加し、次いでそれぞれ実施例 1〜 11並びに比較例 1及び 2のキットの第一試薬 (0. 15mL)を添加し反応 (第一反応） を開始させ、 37°Cで 5分間加温し、反応 5分後の反応液の吸光度 (E1)を主波長 60 0nm、副波長 700nmで測定した。次いで、この反応液にそれぞれ実施例 1〜： L 1並 びに比較例 1〜4のキットの第二試薬 (0. 05mL)を添カ卩しさらに 37°Cで 5分間加温 して反応 (第二反応)を行 、、第二反応 5分後の反応液の吸光度 (E2)を主波長 600 nm、副波長 700nmで測定し、 E2から E1を差し引いて、吸光度変化（ Δ Ε ) リポ蛋白分画 を算出した。また、各リポ蛋白分画の代わりに生理食塩水を検体として用いて、同様 の測定を行い、吸光度変化（Δ Ε )を算出した。最後に、下記式により、各リポ蛋 ブランク
白分画における「反応吸光度」を算出した。
[数 1] リポ蛋白分画における反応吸光度 = Δ Eリポ蛋白分画一 Δ Eプランク （式 1 )
[0126] (2)各リポ蛋白分画中トリグリセリドの反応率の算出
日立 7170S形自動分析装置を用いて、色原体として EMSEを使用したトリグリセリ ド測定用キットであるデタミナ一 C TG (協和メデッタス社製)を実施例 1のキットの代 わりに用いる以外は（1)の場合と同様の方法で、「反応吸光度」を算出し、以下の計 算式にて、それぞれ実施例 1〜： L 1並びに比較例 1〜4のキットにおける各リポ蛋白分 画中トリグリセリドとの反応率（％)を算出した。尚、デタミナ一 C TGを用いた測定に おいて算出した「反応吸光度」は、対象とするリポ蛋白中のトリグリセリドが全て反応し た際の「反応吸光度」を意味する。
[数 2]
実施例 1記載キットでの反応吸光度
反応率 （％) = X 1 0 0 デタミナ一 C T Gでの反応吸光度
[0127] 実施例 1〜： L 1並びに比較例 1〜4のキットにおける各リポ蛋白分画中トリグリセリドの 反応率について、それぞれ反応率が 0〜 10%を「一」、 10〜20%を「土」、 20-40 %を「 +」、 40〜60%を「+ +」、 60〜80%を「+ + +」、 80〜 100%を「+ + + +」 と表しまとめたものを第 1表に示す。
[0128] [表 1]
第 1表
Figure imgf000043_0001
第一試薬中に POE— POA多環フエ-ルエーテル、 POEアルキルフエ-ルエーテ ルホルムアルデヒド縮合物及び HLB値が 13. 0以上 17. 0以下の POE多環フエ-ル エーテルカゝらなる群より選ばれる一つの界面活性剤を含有し、かつ第二試薬中に P OE— POAアルキルエーテル、 POE— POAアルキルフエ-ルエーテル、 POE多環 フエ-ルエーテル縮合物、 POEアルキルフ -ルエーテル硫酸塩、 POE多環フエ- ルエーテル硫酸塩及び HLB値が 9. 0以上 13. 0未満の POE多環フエ-ルエーテ ルカもなる群より選ばれる一つの界面活性剤を含有したキットのみ LDL中トリグリセリ ドが優先的に反応することが判明した。
実施例 13 以下の第一試薬 (試薬 A)及び第二試薬 (試薬 k)からなる LDL中トリグリセリド測定用 キットを調製した。
第一試薬 (試薬 A)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000044_0001
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
エマノレゲン B66 5 g/L
CEBP-M 2 kU/L
GYK- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬 (試薬 k)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
アジィ匕ナトリウム 0. 5 g/L
ェマルゲン A60 20 g/L
コール酸ナトリウム 6 g/L
実施例 14
以下の第一試薬 (試薬 A)及び第二試薬 (試薬 1)からなる LDL中トリグリセリド測定用 キットを調製した。
第一試薬 (試薬 A)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000044_0002
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
エマノレゲン B66 5 g/L
CEBP-M 2 kU/L
GYK- 301 2 kU/L GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬 (試薬 1)
PIPES (pH7. 0) 20 mmolZし
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
アジィ匕ナトリウム 0. 5 g/L
ハイテノール N08 6 g/L
コール酸ナトリウム 6 g/L
実施例 15
以下の第一試薬 (試薬 A)及び第二試薬 (試薬 m)からなる LDL中トリグリセリド測定 用キットを調製した。
第一試薬 (試薬 A)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000045_0001
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
エマノレゲン B66 5 g/L
CEBP-M 2 kU/L
GYK- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
カタラーゼ 200 kU/L
第二試薬 (試薬 m)
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
アジィ匕ナトリウム 0. 5 g/L
ェマルゲン A60 20 g/L
ハイテノール N08 6 g/L コール酸ナトリウム 6 g/L
実施例 16
[0133] 実施例 実施例 8,実施例 13〜15及び比較例 2のキットを用いて、実施例 12の（
1)記載の測定方法と同様にして日立 7170S自動分析装置により、ヒト血清 30検体 中のトリグリセリドの反応吸光度を測定した。
次に、キドニー インターナショナル（Kidney International)、 Vol. 39, 755ぺー ジ（1991)に記載された超遠心法を基準法とし、該血清 30検体各々力も LDL (比重 1. 006-1. 063)を超遠心分離し、得られた LDL分画中のトリグリセリド量をデタミ ナー C TG (協和メデッタス社製)を用いて測定した。各実施例及び比較例のキットを 用いた測定と、基準法による測定との相関係数を第 2表に示す。
[0134] [表 2]
第 2表
Figure imgf000046_0001
[0135] 実施例 1又は実施例 8のキットを用いた測定と、比較例 2のキットを用いた測定との 比較より、 HLB値が 9. 0以上 13. 0未満の POE多環フエ-ルエーテル又は POEァ ルキルフエ-ルエーテル硫酸塩を含有する第二試薬を用いることにより、基準法との 相関係数が向上することが判明した。また、実施例 1と実施例 13のキットを用いた測 定、及び、実施例 8と実施例 14のキットを用いた測定との比較より、 HLB値が 9. 0以 上 13. 0未満の POE多環フエ-ルエーテル又は POEアルキルフエ-ルエーテル硫 酸塩を含有する第二試薬にさらに胆汁酸であるコール酸を加えることにより、基準法 に対する相関係数が向上することが判明した。また、実施例 15のキットを用いた測定 より、 HLB値が 9. 0以上 13. 0未満の POE多環フエ-ルエーテル、 POEアルキルフ ェニルエーテル硫酸塩及び胆汁酸を含有する第二試薬を用いた場合にぉ 、ても、 基準法に対し良好な相関係数が得られることが判明した。
実施例 17
[0136] 超遠心法並びに本発明の実施例 15のキットを用いて、新鮮ヒト血清 3検体につい て、各検体中の LDL中トリグリセリドを以下の方法により定量した。
(1)超遠心法を用いた LDL中トリグリセリドの定量
新鮮ヒト血清 3検体を用いてキド-一 インターナショナル（Kidney International)、 Vol. 39, 755ページ（1991)に記載された超遠心法にて該検体中の LDL (比重 1
. 006-1. 063)を遠心分離し、得られた LDL分画中のトリグリセリド量をデタミナ一
C TG (協和メデッタス社製)を用いて測定した。
(2)検量線の作成
超遠心法による測定より、 LDL中トリグリセリド濃度力 0. OmgZdLであることが判 明して!/ヽる新鮮ヒト血清を標準品として用いて、これを検量線作成用サンプルとした。 実施例 12の（1)記載の測定方法と同様にして日立 7170S自動分析装置により、検 量線作成用サンプル検体の反応吸光度を測定し、該反応吸光度と検量線作成用サ ンプル中の LDL中トリグリセリド濃度との関係カゝら検量線を作成した。
(3)ヒト血清 3検体中の LDL中トリグリセリドの定量
検量線作成用サンプルの代わりに新鮮ヒト血清 3検体を用いて、上記（2)と同様の 方法により、該 2検体各々について反応を行い、反応後の反応液の吸光度と上記（2 )で作成した検量線とから、各検体中の LDL中トリグリセリド濃度を定量した。
3検体について、上記（1)で測定した超遠心法を用いた測定値と、上記（3)で測定し た実施例 15のキットを用 、た測定値を表 3に示す。
[0137] [表 3] 第 3表
Figure imgf000048_0003
参考例 1
[0138] 以下の第一試薬および第二試薬力もなる測定用キット Aおよび測定用キット Bを調 製した。
測定用キット A
第一試薬
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000048_0001
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
CEBP-M 2 kU/L
GY- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
エマノレゲン B66 5 g,
第二試薬
PIPES (pH7. 0) 20mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
[0139] 測定用キット B
第一試薬
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000048_0002
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
GY- 301 2 kU/L GPOM 10 kU/L
エマノレゲン B66 5 g/L
第二試薬
PIPES (pH7. 0) 20mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
参考例 2
[0140] 以下の第一試薬および第 試薬力 なる測定用キット Aおよび測定用キット Bを調 製した。
測定用キット A
第一試薬
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000049_0001
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
CEBP-M 2 kU/L
GY- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
ニューコール 610 5 g/L
第二試薬
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
[0141] 測定用キット B
第一試薬
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000049_0002
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
GY- 301 2 kU/L GPOM 10 kU/L
ニューコール 610 5 g/L
第二試薬
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
参考例 3
[0142] 以下の第一試薬および第 試薬力もなる測定用キット Aおよび測定用キット Bを調製 した。
測定用キット A
第一試薬
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000050_0001
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
CEBP-M 2 kU/L
GY- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
ニューコール 2608F 5 g/L
第二試薬
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
[0143] 測定用キット B
第一試薬
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000050_0002
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
GY- 301 2 kU/L GPOM 10 kU/L
ニューコール 2608F 5 g/L
第二試薬
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
参考例 4
[0144] 以下の第一試薬および第 試薬力 なる測定用キット Aおよび測定用キット Bを調 製した。
測定用キット A
第一試薬
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000051_0001
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
CEBP-M 2 kU/L
GY- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
ニューカルゲン GP 120 5 g/L
第二試薬
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
[0145] 測定用キット B
第一試薬
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000051_0002
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
GY- 301 2 kU/L GPOM 10 kU/L
ニューカルゲン GP 120 5 g
第二試薬
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
参考例 5
[0146] 以下の第一試薬および第二試薬力もなる測定用キット Aおよび測定用キット Bを調 製した。
測定用キット A
第一試薬
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000052_0001
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
CEBP-M 2 kU/L
GY- 301 2 kU/L
GPOM 10 kU/L
ニッコール R1020 2 g/L
第二試薬
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
[0147] 測定用キット B
第一試薬
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
Figure imgf000052_0002
硫酸マグネシウム 0. 5 g/L
GY- 301 2 kU/L GPOM 10 kU/L
ニッコール R1020 2 g/L
第二試薬
PIPES (pH7. 0) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 3 g/L
パーォキシダーゼ 20 kU/L
参考例 6
[0148] 実施例 12に記載の方法と同様に、超遠心法により 5つのリポ蛋白分画を分取し、参 考例 1〜5の測定用キット Aおよび測定用キット Bをそれぞれ用いて、各リポ蛋白分画 中トリグリセリドの反応率を算出した。
(1)各リポ蛋白分画中トリグリセリドと各測定用キットとの反応による反応吸光度の算 出
日立 7170S形自動分析装置を用いて、以下の操作により反応吸光度を算出した。 各リポ蛋白分画を検体とし反応セルへ（2 L)添加し、次いで参考例 1〜5の測定用 キット Aまたは測定用キット Bの第一試薬 (0. 15mL)を添加し反応 (第一反応)を開 始させ、 37°Cで 5分間加温し、反応 5分後の反応液の吸光度 (E1)を主波長 600nm 、副波長 700nmで測定した。
次いで、この反応液に参考例 1〜5の測定用キット Aまたは測定用キット Bの第二試 薬 (0. 05mL)をそれぞれ添加しさらに 37°Cで 5分間加温して反応 (第二反応）を行 い、第二反応 5分後の反応液の吸光度 (E2)を主波長 600nm、副波長 700nmで測 定し、 E2から E1を差し引いて、吸光度変化（Δ Ε )を算出した。
リポ蛋白分画
また、各リポ蛋白分画の代わりに生理食塩水を検体として用いて、同様の測定を行 い、吸光度変化（Δ Ε )を算出した。各リポ蛋白分画における「反応吸光度」は、 ブランク
下記式 1により算出した。
[0149] [数 3] リポ蛋白分画における反応吸光度 = Δ Eリポ蛋白分画一 Δ Eブランク （式 1 ) 式 1より求めた参考例 1〜5の測定用キット Aおよび測定用キット Bのリポ蛋白分画に おける反応吸光度を用い、参考例 1〜5における各リポ蛋白分画中に存在する遊離 グリセロールの反応を差し引いた各リポ蛋白分画中トリグリセリドの反応吸光度を下記 式により算出した。
[0150] 画 各リポ蛋白中トリグリセリ ドの反応吸光度
=測定用キット Aの反応吸光度 測定用キット Bの反応吸光度
(2)各リポ蛋白分画中トリグリセリドの反応率の算出
実施例 12と同様、デタミナ一 C TG (協和メデッタス社製)を用い、リポ蛋白中トリグ リセリドが全て反応した際の「反応吸光度」を算出し、参考例 1〜5における各リポ蛋 白分画中トリグリセリドとの反応率 (％)を以下の計算式にて算出した。
[0151] [数 5] 参考例 1〜 5記載キットでの反応吸光度
反応率 （％) = X 1 0 0
デタミナ一 C T Gでの反応吸光度 参考例 1〜5における各リポ蛋白分画中トリグリセリドの反応率を第 3表に示す。な お、反応率力^)〜 10%を「一」、 10〜20%を「土」、 20〜40%を「 +」、 40〜60%を「 + +」、 60〜80%を「+ + +」、 80〜 100%を「+ + + +」とした。
[0152] [表 4]
第 4表
Figure imgf000054_0001
第 4表の通り、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フエ-ルエーテル（-ュ 一コール 2608F、ニューカルゲン GP 120)、ポリオキシエチレンアルキルフエ-ルェ 一テルホルムアルデヒド縮合物（-ッコール R1020)及び HLBが 13. 0以上 17. 0以 下のポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテル（ェマルゲン B66、ニューコール 610) カゝらなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤を含有する試薬において、 HD L中のトリグリセリドが優先的に反応することが判明した。
[0154] 従って、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フエ-ルエーテル、ポリオキシ エチレンアルキルフエ-ルエーテルホルムアルデヒド縮合物及び HLBが 13. 0以上 17. 0以下のポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテル力 なる群力 選ばれる界面 活性剤で処理した試料中には、 HDL以外、具体的には、 LDL、 IDL、 VLDL、 CM 中のトリグリセリドが残存し、この処理した試料をさらに、ポリオキシエチレンポリオキシ アルキレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンポリオキシアルキレンアルキルェ 一テル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフエニルエーテル、ポリオ キシプロピレンポリオキシアルキレンアルキルフエニルエーテル、ポリオキシエチレン 多環フエ-ルエーテル縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフエ-ルエーテル硫酸 塩、ポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテル硫酸塩、及び HLB値が 9. 0以上 13. 0未満のポリオキシエチレン多環フエニルエーテル力 なる群より選ばれる少なくとも 一つの界面活性剤で処理することにより特異的に LDL中のトリグリセリドが測定でき ることが示される。
産業上の利用可能性
[0155] 本発明により、動脈硬化などの冠動脈疾患の診断に有用な低密度リポ蛋白中トリグ リセリドの測定方法及び測定用キットが提供される。

Claims

請求の範囲
[1] 下記工程 (i)〜 (iv)を順次行うことを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中のトリグ リセリドの測定方法。
( 検体及びポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フエ-ルエーテル、ポリ ォキシプロピレンポリオキシアルキレン多環フエニルエーテル、ポリオキシエチレンァ ルキルフエ-ルエーテルホルムアルデヒド縮合物及び HLB値が 13. 0以上 17. 0以 下のポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテルからなる群より選ばれる少なくとも一つ の界面活性剤を含有する水性媒体中で、該検体にリポプロテインリパーゼを作用さ せ、遊離型グリセロールを生成させる工程；
(ii)前記工程 ( の反応液中に存在する遊離型グリセロールを除去する工程；
(iii)前記工程 (ii)で遊離型グリセロールを除去した後の反応液に、ポリオキシェチ レンポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンポリオキシアルキ レンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフエニルェ 一テル、ポリオキシプロピレンポリオキシアルキレンアルキルフエニルエーテル、ポリ ォキシエチレン多環フエ-ルエーテル縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフエ-ル エーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテル硫酸塩、及び HLB値が 9. 0以上 13. 0未満のポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテル力もなる群より選ば れる少なくとも一つの界面活性剤の存在下、リポプロテインリパーゼを作用させ、遊離 型グリセロールを生成させる工程；
(iv)前記工程 (iii)で生成する遊離型グリセロールを測定する工程。
[2] 工程 (i)で生成する遊離型グリセロールが、高密度リポ蛋白中のトリグリセリドから生成 するものである請求項 1記載の方法。
[3] 工程 (ii)の遊離型グリセロールの除去力 遊離型グリセロールを工程 (iv)の遊離型グ リセロールの測定に係る成分以外の成分に酵素的に変換することにより行われる請 求項 1又は 2記載の方法。
[4] 工程 (ii)の遊離型グリセロールの除去力 遊離型グリセロール力も過酸ィ匕水素を発生 させる試薬により過酸ィ匕水素を発生させ、次いで該過酸ィ匕水素を除去することにより 行われる請求項 1又は 2記載の測定方法。
[5] 過酸化水素の除去が、過酸ィ匕水素にカタラーゼを作用させる力、又は、酸ィ匕カツプリ ング色原体の片方の存在下に、過酸化水素に過酸化活性物質を作用させることによ り行われる請求項 4に記載の測定方法。
[6] 工程 (iv)の遊離型グリセロールの測定力 遊離型グリセロール力も過酸ィ匕水素を発 生させる試薬により過酸ィ匕水素を発生させ、次いで該過酸ィ匕水素を測定することによ り行われる請求項 1〜5のいずれかに記載の方法。
[7] 遊離型グリセロール力も過酸ィ匕水素を発生させる試薬力 グリセロールキナーゼとグ リセロール 3—リン酸ォキシダーゼとを含有する試薬又はグリセロールォキシダーゼを 含有する試薬である請求項 4〜6のいずれかに記載の測定方法。
[8] 過酸ィ匕水素の測定が、過酸ィ匕水素に過酸ィ匕活性物質と酸ィ匕発色型色原体とを作用 させて色素を生成させ、該色素の吸光度を測定することにより行われる請求項 6又は
7に記載の方法。
[9] 胆汁酸誘導体の存在下に、工程 (iii)のリポプロテインリパーゼを作用させる請求項 1 〜8の!、ずれかに記載の方法。
[10] 胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココ ール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デォキシコール酸もしくはその塩 、ケノデォキシコール酸もしくはその塩、ウルソデォキシコール酸もしくはその塩、 7— ォキソリトコール酸もしくはその塩、 12—ォキソリトコール酸もしくはその塩、 12—ォキ ソケノデォキシコール酸もしくはその塩、 7—ォキソデォキシコール酸もしくはその塩、 ヒォコール酸もしくはその塩、ヒォデォキシコール酸もしくはその塩、デヒドロコール酸 もしくはその塩、一般式 (I)
[化 8]
R1 - CH2 - CH(R2) - CH2 - S03 " ( 1 )
[式中、 R1は、 3— (3—コラミドプロピル)ジメチルアンモ-ォ基であり、 R2は、水素原 子又は水酸基である]で表される化合物、及び一般式 (II)
[化 9]
Figure imgf000058_0001
(Xは、水素原子又は水酸基を表し、 R3及び R4は、同一又は異なって、置換もしくは 非置換のアルキル基、又は、置換もしくは非置換のアルカノィル基を表す)で表され る化合物力 なる群より選ばれる少なくとも一つの物質である請求項 9に記載の方法
[11] (a)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フエ-ルエーテル、ポリオキシプロピ レンポリオキシアルキレン多環フエニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフエ二 ルエーテルホルムアルデヒド縮合物及び HLB値が 13. 0以上 17. 0以下のポリオキ シエチレン多環フエ-ルエーテル力 なる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性 剤、リポプロテインリパーゼ、及び遊離型グリセロール除去試薬を含有する第一試薬 と、 （b)ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピ レンポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレ ンアルキルフエ-ルエーテル、ポリオキシプロピレンポリオキシアルキレンアルキルフ ェ-ルエーテル、ポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテル縮合物、ポリオキシェチ レンアルキルフエ-ルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテル硫 酸塩及び HLB値が 9. 0以上 13. 0未満のポリオキシエチレン多環フエ-ルエーテル 力 なる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤、及び遊離型グリセロール測定 試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中の低密度リポ蛋白中 のトリグリセリド測定用キット。
[12] ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フエ-ルエーテル、ポリオキシプロピレ ンポリオキシアルキレン多環フエニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフエニル エーテルホルムアルデヒド縮合物及び HLB値が 13. 0以上 17. 0以下のポリオキシ エチレン多環フエニルエーテル力もなる群より選ばれる少なくとも一つの界面活性剤 力 高密度リポ蛋白中のトリグリセリドにリポプロテインリパーゼを作用させるものであ る請求項 11記載のキット。
[13] 遊離グリセロール除去試薬が、遊離グリセロールを遊離グリセロール測定試薬による 測定に係る成分以外の成分に変換する酵素である請求項 11又は 12記載のキット。
[14] 遊離グリセロール除去試薬が、グリセロール力 過酸ィ匕水素を生成させる試薬及び 過酸ィ匕水素除去試薬を含有する試薬である、請求項 11又は 12記載のキット。
[15] 過酸化水素除去試薬が、カタラーゼ、又は、酸化カップリング色原体の片方と過酸化 活性物質とを含有する試薬である請求項 14記載のキット。
[16] 遊離型グリセロール測定試薬が、遊離型グリセロール力も過酸ィ匕水素を生成させる 試薬及び過酸ィ匕水素測定試薬を含有する試薬である、請求項 11〜15のいずれか に記載のキット。
[17] 遊離型グリセロール力 過酸ィ匕水素を生成させる試薬力 グリセロールキナーゼとグ リセロール 3—リン酸ォキシダーゼとを含む試薬又はグリセロールォキシダーゼを含 む試薬である請求項 14〜16のいずれかに記載のキット。
[18] 過酸化水素測定試薬が、過酸化活性化物質と酸化発色型色原体とを含有する試薬 である請求項 16又は 17に記載のキット。
[19] 第二試薬が、さらに胆汁酸誘導体を含有する請求項 11〜18のいずれかに記載のキ ッ卜。
[20] 胆汁酸誘導体が、コール酸もしくはその塩、タウロコール酸もしくはその塩、グリココ ール酸もしくはその塩、リトコール酸もしくはその塩、デォキシコール酸もしくはその塩 、ケノデォキシコール酸もしくはその塩、ウルソデォキシコール酸もしくはその塩、 7— ォキソリトコール酸もしくはその塩、 12—ォキソリトコール酸もしくはその塩、 12—ォキ ソケノデォキシコール酸もしくはその塩、 7—ォキソデォキシコール酸もしくはその塩、 ヒォコール酸もしくはその塩、ヒォデォキシコール酸もしくはその塩、デヒドロコール酸 もしくはその塩、一般式 (I)
[化 10]
R1- CH2— CH(R2)— CH2— S03一 ( I )
[式中、 R1は、 3— (3—コラミドプロピル)ジメチルアンモ-ォ基であり、 R2は、水素原 子又は水酸基である]で表される化合物、及び一般式 (II)
[化 11]
Figure imgf000060_0001
(Xは、水素原子又は水酸基を表し、 R3及び R4は、同一又は異なって、置換もしくは 非置換のアルキル基、又は、置換もしくは非置換のアルカノィル基を表す)で表され る化合物力もなる群より選ばれる少なくとも一つの物質である請求項 19に記載のキッ ト。
PCT/JP2006/321730 2005-10-31 2006-10-31 低密度リポ蛋白中トリグリセリドの測定方法及び測定用キット WO2007052646A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/090,906 US9360432B2 (en) 2005-10-31 2006-10-31 Method for measuring triglyceride in low-density lipoprotein
EP06822659A EP1953240A4 (en) 2005-10-31 2006-10-31 PROCESS FOR MEASURING TRIGLYCERIDE IN LOW DENSITY LIPOPROTEIN AND MEASURING KIT
JP2007542753A JP5191236B2 (ja) 2005-10-31 2006-10-31 低密度リポ蛋白中トリグリセリドの測定方法及び測定用キット

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005-316476 2005-10-31
JP2005316476 2005-10-31
JP2006095151 2006-03-30
JP2006-095151 2006-03-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2007052646A1 true WO2007052646A1 (ja) 2007-05-10

Family

ID=38005799

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2006/321730 WO2007052646A1 (ja) 2005-10-31 2006-10-31 低密度リポ蛋白中トリグリセリドの測定方法及び測定用キット

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9360432B2 (ja)
EP (1) EP1953240A4 (ja)
JP (1) JP5191236B2 (ja)
WO (1) WO2007052646A1 (ja)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011136316A1 (ja) * 2010-04-30 2011-11-03 協和メデックス株式会社 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット
WO2012057333A1 (ja) * 2010-10-29 2012-05-03 アークレイ株式会社 低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法及び測定用キット
WO2013157642A1 (ja) * 2012-04-20 2013-10-24 デンカ生研株式会社 低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のトリグリセリドの消去方法
JP2018124219A (ja) * 2017-02-03 2018-08-09 デンカ生研株式会社 循環器疾患等のリスクの判断を補助する方法
JP2019148536A (ja) * 2018-02-28 2019-09-05 デンカ生研株式会社 検査測定値の正確性を向上させる方法及びそのための添加剤
WO2019175962A1 (ja) * 2018-03-13 2019-09-19 デンカ生研株式会社 循環器疾患等のリスクの判断を補助する方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010055916A1 (ja) * 2008-11-14 2010-05-20 協和メデックス株式会社 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット
EP2751575B1 (en) 2011-11-11 2018-09-12 Axis-Shield AS Blood sample assay method
JP6022165B2 (ja) * 2012-01-25 2016-11-09 デンカ生研株式会社 高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量方法
JP6182008B2 (ja) * 2013-07-24 2017-08-16 デンカ生研株式会社 高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量方法及び定量試薬
CN107064123A (zh) * 2017-01-03 2017-08-18 长沙中生众捷生物技术有限公司 甘油三酯的检测试剂及甘油三酯的检测试纸
JP7029139B2 (ja) * 2018-08-23 2022-03-03 デンカ株式会社 非アルコール性脂肪性肝炎の検出を補助する方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996028734A1 (fr) * 1995-03-16 1996-09-19 Kyowa Medex Co., Ltd. Procede pour l'evaluation quantitative du cholesterol dans une lipoproteine faible densite
WO1998047005A1 (fr) * 1997-04-14 1998-10-22 Denka Seiken Co., Ltd. Procede pour determiner le taux de cholesterol present dans des lipoproteines de basse densite
WO2000017388A1 (fr) * 1998-09-18 2000-03-30 Kyowa Medex Co., Ltd. Dosage du cholesterol dans les lipoproteines et reactifs de quantification
WO2000043537A1 (fr) 1999-01-20 2000-07-27 Kyowa Medex Co., Ltd. Methode pour mesurer un triglyceride dans une lipoproteine
WO2000060112A1 (fr) 1999-04-01 2000-10-12 Masahiko Okada Procede de quantification de triglycerides contenus dans des lipoproteines a tres faible densite et dans des lipoproteines a densite moyenne
JP2001231597A (ja) * 2000-02-28 2001-08-28 Kyowa Medex Co Ltd レムナント様リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および測定試薬
JP2002508519A (ja) 1997-12-17 2002-03-19 ハインリッヒ・ヴィーラント リポ蛋白質に含有されるトリグリセリドの測定のための手続および診断用製品
WO2004035817A1 (ja) * 2002-10-16 2004-04-29 Kyowa Medex Co., Ltd. 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬
WO2004087945A1 (ja) 2003-03-28 2004-10-14 Denka Seiken Co., Ltd. 低密度リポ蛋白中のトリグリセリドの定量方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179334A (en) * 1976-08-19 1979-12-18 Eastman Kodak Company Hydrolysis of protein-bound triglycerides
JP3058602B2 (ja) * 1996-04-15 2000-07-04 デンカ生研株式会社 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法
CA2502559C (en) * 2002-10-16 2014-12-16 Kyowa Medex Co., Ltd. Method and reagent for measuring cholesterol in high density lipoprotein

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996028734A1 (fr) * 1995-03-16 1996-09-19 Kyowa Medex Co., Ltd. Procede pour l'evaluation quantitative du cholesterol dans une lipoproteine faible densite
WO1998047005A1 (fr) * 1997-04-14 1998-10-22 Denka Seiken Co., Ltd. Procede pour determiner le taux de cholesterol present dans des lipoproteines de basse densite
JP2002508519A (ja) 1997-12-17 2002-03-19 ハインリッヒ・ヴィーラント リポ蛋白質に含有されるトリグリセリドの測定のための手続および診断用製品
WO2000017388A1 (fr) * 1998-09-18 2000-03-30 Kyowa Medex Co., Ltd. Dosage du cholesterol dans les lipoproteines et reactifs de quantification
WO2000043537A1 (fr) 1999-01-20 2000-07-27 Kyowa Medex Co., Ltd. Methode pour mesurer un triglyceride dans une lipoproteine
WO2000060112A1 (fr) 1999-04-01 2000-10-12 Masahiko Okada Procede de quantification de triglycerides contenus dans des lipoproteines a tres faible densite et dans des lipoproteines a densite moyenne
JP2001231597A (ja) * 2000-02-28 2001-08-28 Kyowa Medex Co Ltd レムナント様リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および測定試薬
WO2004035817A1 (ja) * 2002-10-16 2004-04-29 Kyowa Medex Co., Ltd. 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬
WO2004087945A1 (ja) 2003-03-28 2004-10-14 Denka Seiken Co., Ltd. 低密度リポ蛋白中のトリグリセリドの定量方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1953240A4 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011136316A1 (ja) * 2010-04-30 2011-11-03 協和メデックス株式会社 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット
JPWO2011136316A1 (ja) * 2010-04-30 2013-07-22 協和メデックス株式会社 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット
JP5832995B2 (ja) * 2010-04-30 2015-12-16 協和メデックス株式会社 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット
WO2012057333A1 (ja) * 2010-10-29 2012-05-03 アークレイ株式会社 低密度リポタンパク質中のコレステロールの測定方法及び測定用キット
WO2013157642A1 (ja) * 2012-04-20 2013-10-24 デンカ生研株式会社 低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のトリグリセリドの消去方法
JPWO2013157642A1 (ja) * 2012-04-20 2015-12-21 デンカ生研株式会社 低密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のトリグリセリドの消去方法
US10077286B2 (en) 2012-04-20 2018-09-18 Denka Seiken Co., Ltd. Method for removal of triglycerides in lipoproteins other than low-density lipoproteins
JP2018124219A (ja) * 2017-02-03 2018-08-09 デンカ生研株式会社 循環器疾患等のリスクの判断を補助する方法
JP2019148536A (ja) * 2018-02-28 2019-09-05 デンカ生研株式会社 検査測定値の正確性を向上させる方法及びそのための添加剤
JP7156807B2 (ja) 2018-02-28 2022-10-19 デンカ株式会社 検査測定値の正確性を向上させる方法及びそのための添加剤
WO2019175962A1 (ja) * 2018-03-13 2019-09-19 デンカ生研株式会社 循環器疾患等のリスクの判断を補助する方法

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2007052646A1 (ja) 2009-04-30
US9360432B2 (en) 2016-06-07
JP5191236B2 (ja) 2013-05-08
EP1953240A1 (en) 2008-08-06
US20090226944A1 (en) 2009-09-10
EP1953240A4 (en) 2009-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2007052646A1 (ja) 低密度リポ蛋白中トリグリセリドの測定方法及び測定用キット
JP5111389B2 (ja) 小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法
ES2335658T3 (es) Metodo y reactivo que permite medir el colesterol en la lipo proteina de alta densidad.
TWI379904B (en) A method for quantifying cholesterol of remnant-like particles lipoprotein, reagent and kit
TW480338B (en) A method for determinating the amount of cholesteroid in low density lipoprotein and the reagent composition thereof
JP5534644B2 (ja) レムナント様リポ蛋白中のコレステロール測定方法、試薬及びキット
JP4690200B2 (ja) 超低密度リポ蛋白レムナント（ｖｌｄｌレムナント）中のコレステロールの定量方法、試薬およびキット
CN111032880A (zh) 低密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法、测定用试剂和测定用试剂盒
JP4796489B2 (ja) 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法
JPWO2004035817A1 (ja) 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および試薬
JPWO2010055916A1 (ja) 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット
WO2000043537A1 (fr) Methode pour mesurer un triglyceride dans une lipoproteine
JP5534809B2 (ja) 低密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法及び測定用キット
WO2012124340A1 (ja) Ｈｄｌ亜分画中のコレステロールの測定方法、測定用試薬及び測定用キット
WO2003104486A1 (ja) トリグリセライドの選択的測定方法
JP2002202314A (ja) リポ蛋白中のコレステロールの定量方法
JP6372921B2 (ja) 高密度リポ蛋白中のコレステロールの測定方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2007542753

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006822659

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12090906

Country of ref document: US