JP2001231597A - レムナント様リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および測定試薬 - Google Patents
レムナント様リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および測定試薬Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 試料の分離操作が不要なレムナント様リポ蛋
白質中のコレステロールを簡便に感度良く測定する方法
および測定試薬を提供する。 【解決手段】 本発明により、生体試料にコレステロー
ルエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもし
くはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を
加水分解する酵素を作用させ、生成する過酸化水素また
は還元型補酵素を測定することによりレムナント様リポ
蛋白質中のコレステロールを測定することを特徴とす
る、生体試料中のレムナント様リポ蛋白質中のコレステ
ロールの測定方法、並びにコレステロールエステラーゼ
およびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロ
ールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵
素からなるレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール
の測定試薬が提供される。
白質中のコレステロールを簡便に感度良く測定する方法
および測定試薬を提供する。 【解決手段】 本発明により、生体試料にコレステロー
ルエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもし
くはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を
加水分解する酵素を作用させ、生成する過酸化水素また
は還元型補酵素を測定することによりレムナント様リポ
蛋白質中のコレステロールを測定することを特徴とす
る、生体試料中のレムナント様リポ蛋白質中のコレステ
ロールの測定方法、並びにコレステロールエステラーゼ
およびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロ
ールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵
素からなるレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール
の測定試薬が提供される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査において
動脈硬化症等の危険因子とされるレムナント様リポ蛋白
質中のコレステロールの測定方法と測定試薬に関する。
動脈硬化症等の危険因子とされるレムナント様リポ蛋白
質中のコレステロールの測定方法と測定試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】臨床検査において、高密度リポ蛋白質
（ＨＤＬ）中のコレステロールは動脈硬化症の危険因子
として負の因子、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）中のコレ
ステロールは動脈硬化症の危険因子として正の因子とさ
れており、臨床検査の分野で頻繁に測定されている。近
年、脂質の代謝等に起因して生成するリポ蛋白質中のコ
レステロールが動脈硬化症の危険因子としてＬＤＬ中の
コレステロールより密接な指標となることが示されてき
ている。該リポ蛋白質としては、例えばレムナント様リ
ポ蛋白質があげられており、レムナント様リポ蛋白質中
のコレステロール測定に対しては厚生省により保険点数
がつけられている。
（ＨＤＬ）中のコレステロールは動脈硬化症の危険因子
として負の因子、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）中のコレ
ステロールは動脈硬化症の危険因子として正の因子とさ
れており、臨床検査の分野で頻繁に測定されている。近
年、脂質の代謝等に起因して生成するリポ蛋白質中のコ
レステロールが動脈硬化症の危険因子としてＬＤＬ中の
コレステロールより密接な指標となることが示されてき
ている。該リポ蛋白質としては、例えばレムナント様リ
ポ蛋白質があげられており、レムナント様リポ蛋白質中
のコレステロール測定に対しては厚生省により保険点数
がつけられている。
【０００３】レムナント様リポ蛋白質中のコレステロー
ルの測定方法としては、抗アポＢ−１００抗体と抗アポ
Ａ１抗体を用いて試料からレムナント様リポ蛋白質を分
離し、分離したレムナント様リポ蛋白質中のコレステロ
ールを測定する方法が知られている［動脈硬化，25(9,1
0), 371（1998）］。しかしながら本方法は抗体を使用
したアフィニティークロマトグラフィー方法を使用する
もので、試料の分離操作を必要とする等操作が煩雑で時
間がかかる。
ルの測定方法としては、抗アポＢ−１００抗体と抗アポ
Ａ１抗体を用いて試料からレムナント様リポ蛋白質を分
離し、分離したレムナント様リポ蛋白質中のコレステロ
ールを測定する方法が知られている［動脈硬化，25(9,1
0), 371（1998）］。しかしながら本方法は抗体を使用
したアフィニティークロマトグラフィー方法を使用する
もので、試料の分離操作を必要とする等操作が煩雑で時
間がかかる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、試料
の分離操作が不要なレムナント様リポ蛋白質中のコレス
テロールを簡便に感度良く測定する方法および測定試薬
を提供することにある。
の分離操作が不要なレムナント様リポ蛋白質中のコレス
テロールを簡便に感度良く測定する方法および測定試薬
を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決する手段】本発明者らは、高密度リポ蛋白
質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、カイロミ
クロン（ＣＭ）、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、Ｃ
Ｍレムナント、ＶＬＤＬレムナント、中密度リポ蛋白質
（ＩＤＬ）レムナント等のリポ蛋白質を含有する生体試
料中のコレステロールをコレステロールエステラーゼお
よびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロー
ルデヒドロゲナーゼを使用して測定するに際し、リン脂
質を加水分解する酵素を作用させることにより、ＣＭレ
ムナント、ＶＬＤＬレムナントおよびＩＤＬレムナント
等のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを特異
的に測定することができることを見いだし本発明を完成
させた。
質（ＨＤＬ）、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、カイロミ
クロン（ＣＭ）、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、Ｃ
Ｍレムナント、ＶＬＤＬレムナント、中密度リポ蛋白質
（ＩＤＬ）レムナント等のリポ蛋白質を含有する生体試
料中のコレステロールをコレステロールエステラーゼお
よびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロー
ルデヒドロゲナーゼを使用して測定するに際し、リン脂
質を加水分解する酵素を作用させることにより、ＣＭレ
ムナント、ＶＬＤＬレムナントおよびＩＤＬレムナント
等のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを特異
的に測定することができることを見いだし本発明を完成
させた。
【０００６】すなわち本発明は、下記（１）〜（１８）
に関する。
に関する。
【０００７】（１） 生体試料にコレステロールエステ
ラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレ
ステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解
する酵素を作用させ、生成する過酸化水素または還元型
補酵素を測定することによりレムナント様リポ蛋白質中
のコレステロールを測定することを特徴とする、生体試
料中のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測
定方法。
ラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレ
ステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解
する酵素を作用させ、生成する過酸化水素または還元型
補酵素を測定することによりレムナント様リポ蛋白質中
のコレステロールを測定することを特徴とする、生体試
料中のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測
定方法。
【０００８】（２） コレステロールエステラーゼおよ
びコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロール
デヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を
作用させるに際し、界面活性剤を添加する（１）記載の
測定方法。
びコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロール
デヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を
作用させるに際し、界面活性剤を添加する（１）記載の
測定方法。
【０００９】（３） 生体試料が、コレステロールエス
テラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコ
レステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分
解する酵素を作用させる前に界面活性剤が添加されたも
のである（１）記載の方法。
テラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコ
レステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分
解する酵素を作用させる前に界面活性剤が添加されたも
のである（１）記載の方法。
【００１０】（４） 界面活性剤が、レムナント様リポ
蛋白質以外のリポ蛋白質に対するコレステロールエステ
ラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレ
ステロールデヒドロゲナーゼの作用を抑制する界面活性
剤である（２）または（３）記載の方法。
蛋白質以外のリポ蛋白質に対するコレステロールエステ
ラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレ
ステロールデヒドロゲナーゼの作用を抑制する界面活性
剤である（２）または（３）記載の方法。
【００１１】（５） 界面活性剤が、ポリオキシアルキ
レン誘導体またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロ
ピレン共重合体もしくはその誘導体である（２）〜
（４）のいずれかに記載の方法。
レン誘導体またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロ
ピレン共重合体もしくはその誘導体である（２）〜
（４）のいずれかに記載の方法。
【００１２】（６） 生体試料が、コレステロールエス
テラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコ
レステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分
解する酵素を作用させる前にポリオキシエチレン−ポリ
オキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体が添加さ
れたものであり、コレステロールエステラーゼおよびコ
レステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒ
ドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を作用
させるに際しポリオキシアルキレン誘導体を添加する
（１）記載の方法。
テラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコ
レステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分
解する酵素を作用させる前にポリオキシエチレン−ポリ
オキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体が添加さ
れたものであり、コレステロールエステラーゼおよびコ
レステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒ
ドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を作用
させるに際しポリオキシアルキレン誘導体を添加する
（１）記載の方法。
【００１３】（７） ポリオキシアルキレン誘導体が、
ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチ
レンスチレン化フェニルエーテルまたはポリオキシエチ
レン長鎖分岐アルキルエーテルである（５）または
（６）記載の方法。
ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチ
レンスチレン化フェニルエーテルまたはポリオキシエチ
レン長鎖分岐アルキルエーテルである（５）または
（６）記載の方法。
【００１４】（８） ポリオキシエチレン−ポリオキシ
プロピレン共重合体もしくはその誘導体が一般式（Ｉ）
プロピレン共重合体もしくはその誘導体が一般式（Ｉ）
【００１５】
【化３】
【００１６】［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異な
って１〜２００の整数を表し、Ｒは直鎖または分岐のア
ルキルを表す。]で表される化合物である（５）または
（６）記載の方法。
って１〜２００の整数を表し、Ｒは直鎖または分岐のア
ルキルを表す。]で表される化合物である（５）または
（６）記載の方法。
【００１７】（９） リン脂質を加水分解する酵素がホ
スホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ
２である（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
スホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ
２である（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
【００１８】（１０） コレステロールエステラーゼお
よびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロー
ルデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素
からなるレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの
測定試薬。
よびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロー
ルデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素
からなるレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの
測定試薬。
【００１９】（１１） 界面活性剤を含有する（１０）
記載の測定試薬。
記載の測定試薬。
【００２０】（１２） 界面活性剤を含有する第１試薬
およびコレステロールエステラーゼおよびコレステロー
ルオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナー
ゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を含有する第２試
薬からなる（１０）記載の測定試薬。
およびコレステロールエステラーゼおよびコレステロー
ルオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナー
ゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を含有する第２試
薬からなる（１０）記載の測定試薬。
【００２１】（１３） 界面活性剤が、レムナント様リ
ポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対するコレステロールエス
テラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコ
レステロールデヒドロゲナーゼの作用を抑制する界面活
性剤である（１１）または（１２）記載の測定試薬。
ポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対するコレステロールエス
テラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコ
レステロールデヒドロゲナーゼの作用を抑制する界面活
性剤である（１１）または（１２）記載の測定試薬。
【００２２】（１４） 界面活性剤が、ポリオキシアル
キレン誘導体またはポリオキシエチレン−ポリオキシプ
ロピレン共重合体もしくはその誘導体である（１１）ま
たは（１２）記載の測定試薬。
キレン誘導体またはポリオキシエチレン−ポリオキシプ
ロピレン共重合体もしくはその誘導体である（１１）ま
たは（１２）記載の測定試薬。
【００２３】（１５） 第１試薬の界面活性剤が、ポリ
オキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体であ
り、第２試薬にポリオキシアルキレン誘導体を含有する
（１２）記載の測定試薬。
オキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体であ
り、第２試薬にポリオキシアルキレン誘導体を含有する
（１２）記載の測定試薬。
【００２４】（１６） ポリオキシアルキレン誘導体
が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシ
エチレンスチレン化フェニルエーテルまたはポリオキシ
エチレン長鎖分岐アルキルエーテルである（１４）また
は（１５）記載の測定試薬。
が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシ
エチレンスチレン化フェニルエーテルまたはポリオキシ
エチレン長鎖分岐アルキルエーテルである（１４）また
は（１５）記載の測定試薬。
【００２５】（１７） ポリオキシエチレン−ポリオキ
シプロピレン共重合体もしくはその誘導体が一般式
（Ｉ）
シプロピレン共重合体もしくはその誘導体が一般式
（Ｉ）
【００２６】
【化４】
【００２７】［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異な
って１〜２００の整数を表し、Ｒは直鎖または分岐のア
ルキルを表す。]で表される化合物である（１４）また
は（１５）記載の測定試薬。
って１〜２００の整数を表し、Ｒは直鎖または分岐のア
ルキルを表す。]で表される化合物である（１４）また
は（１５）記載の測定試薬。
【００２８】（１８） リン脂質を加水分解する酵素が
ホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼ
Ａ２である（１０）〜（１７）のいずれかに記載の測定
試薬。
ホスホリパーゼＤ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼ
Ａ２である（１０）〜（１７）のいずれかに記載の測定
試薬。
【００２９】
【発明の実施の形態】本発明のレムナント様リポ蛋白質
中のコレステロールを定量するための反応は水性媒体
中、好ましくは緩衝液中で行われる。
中のコレステロールを定量するための反応は水性媒体
中、好ましくは緩衝液中で行われる。
【００３０】緩衝液に使用する緩衝剤としては、例えば
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、リン酸緩衝
剤、ホウ酸緩衝剤およびグッドの緩衝剤等があげられ
る。グッドの緩衝剤としては、Ｎ−（２−アセタミド）
−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−（２
−アセタミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス
（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン
酸（ＢＥＳ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエ
チル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸
（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラ
ジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２
−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３
−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（以下、ＭＯ
ＰＳという）、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキ
シプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥ
Ｓ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプ
ロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）等があげられ
る。
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、リン酸緩衝
剤、ホウ酸緩衝剤およびグッドの緩衝剤等があげられ
る。グッドの緩衝剤としては、Ｎ−（２−アセタミド）
−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−（２
−アセタミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス
（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン
酸（ＢＥＳ）、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエ
チル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸
（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラ
ジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２
−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３
−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（以下、ＭＯ
ＰＳという）、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキ
シプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−
Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥ
Ｓ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプ
ロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）等があげられ
る。
【００３１】緩衝液のｐＨは４〜１０、好ましくは５〜
９である。緩衝液の使用濃度は、５〜５００ｍＭが好ま
しく、１０〜２００ｍＭがより好ましく、２０〜１００
ｍＭが特に好ましい。
９である。緩衝液の使用濃度は、５〜５００ｍＭが好ま
しく、１０〜２００ｍＭがより好ましく、２０〜１００
ｍＭが特に好ましい。
【００３２】本発明に用いるコレステロールエステラー
ゼとしては、コレステロールエステルを加水分解する能
力を有する酵素であれば特に限定されず、例えば微生物
または動物由来のコレステロールエステラーゼやリポプ
ロテインリパーゼ等があげられる。
ゼとしては、コレステロールエステルを加水分解する能
力を有する酵素であれば特に限定されず、例えば微生物
または動物由来のコレステロールエステラーゼやリポプ
ロテインリパーゼ等があげられる。
【００３３】コレステロールオキシダーゼとしては、コ
レステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有
する酵素であれば特に限定されず、例えば微生物または
動物由来のコレステロールオキシダーゼがあげられる。
レステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有
する酵素であれば特に限定されず、例えば微生物または
動物由来のコレステロールオキシダーゼがあげられる。
【００３４】コレステロールデヒドロゲナーゼとして
は、コレステロールを酸化して酸化型補酵素を還元する
能力を有する酵素であれば特に限定されず、例えば微生
物または動物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼが
あげられる。
は、コレステロールを酸化して酸化型補酵素を還元する
能力を有する酵素であれば特に限定されず、例えば微生
物または動物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼが
あげられる。
【００３５】これら酵素の特異性、安定性をさらに向上
させるためにポリエチレングリコールを主成分とする
基、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで該
酵素を化学的に修飾したものも用いられる。また、遺伝
子操作により得られる酵素も用いられる。
させるためにポリエチレングリコールを主成分とする
基、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで該
酵素を化学的に修飾したものも用いられる。また、遺伝
子操作により得られる酵素も用いられる。
【００３６】本発明におけるコレステロールエステラー
ゼ、コレステロールオキシダーゼおよびコレステロール
デヒドロゲナーゼの使用量は、反応液中、それぞれ０．
０１〜２００Ｕ／ｍｌが好ましく０．１〜１００Ｕ／ｍ
ｌがより好ましい。
ゼ、コレステロールオキシダーゼおよびコレステロール
デヒドロゲナーゼの使用量は、反応液中、それぞれ０．
０１〜２００Ｕ／ｍｌが好ましく０．１〜１００Ｕ／ｍ
ｌがより好ましい。
【００３７】本発明のレムナント様リポ蛋白質中のコレ
ステロールを定量する反応には、反応の特異性に影響を
及ぼさない範囲でコレステロールエステラーゼおよびコ
レステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒ
ドロゲナーゼを活性化するためによく使用される界面活
性剤あるいはコール酸類も使用することができる。ま
た、生体試料中のグロブリンなどの蛋白質を可溶化する
ための種々の塩類を使用することもできる。
ステロールを定量する反応には、反応の特異性に影響を
及ぼさない範囲でコレステロールエステラーゼおよびコ
レステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒ
ドロゲナーゼを活性化するためによく使用される界面活
性剤あるいはコール酸類も使用することができる。ま
た、生体試料中のグロブリンなどの蛋白質を可溶化する
ための種々の塩類を使用することもできる。
【００３８】コレステロールエステラーゼおよびコレス
テロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロ
ゲナーゼを活性化するための界面活性剤としては、例え
ばアニオン界面活性剤があげられる。アニオン界面活性
剤としては１−ペンタスルホン酸塩、１−ヘキサスルホ
ン酸塩、１−ヘプタスルホン酸塩、１−オクタスルホン
酸塩などのアルキルスルホン酸塩があげられ０〜５％の
範囲で使用される。コール酸類としては、コール酸、デ
オキシコール酸、タウロコール酸、ケノデオキシコール
酸などが０〜５％の範囲で使用される。
テロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロ
ゲナーゼを活性化するための界面活性剤としては、例え
ばアニオン界面活性剤があげられる。アニオン界面活性
剤としては１−ペンタスルホン酸塩、１−ヘキサスルホ
ン酸塩、１−ヘプタスルホン酸塩、１−オクタスルホン
酸塩などのアルキルスルホン酸塩があげられ０〜５％の
範囲で使用される。コール酸類としては、コール酸、デ
オキシコール酸、タウロコール酸、ケノデオキシコール
酸などが０〜５％の範囲で使用される。
【００３９】塩類としては、塩化ナトリウム、硫酸ナト
リウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウ
ム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化リチウ
ム、硫酸リチウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウムなどが０〜１０
０ｍＭの範囲で使用される。
リウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、塩化マグネシウ
ム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化リチウ
ム、硫酸リチウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウムなどが０〜１０
０ｍＭの範囲で使用される。
【００４０】リン脂質を分解する酵素としては、リン脂
質を分解する能力を有する酵素であれば特に制限されな
い。例えば動物、植物および微生物由来のリン脂質を分
解する酵素があげられる。具体的なリン脂質を分解する
酵素としては、例えばホスホリパーゼＤ、ホスホリパー
ゼＣ、ホスホリパーゼＡ２、リゾホスホリパーゼ等があ
げられる。
質を分解する能力を有する酵素であれば特に制限されな
い。例えば動物、植物および微生物由来のリン脂質を分
解する酵素があげられる。具体的なリン脂質を分解する
酵素としては、例えばホスホリパーゼＤ、ホスホリパー
ゼＣ、ホスホリパーゼＡ２、リゾホスホリパーゼ等があ
げられる。
【００４１】リン脂質を分解する酵素の使用濃度として
は、反応液中、それぞれ０．０１〜２００Ｕ／ｍｌが好
ましく、０．１〜１００Ｕ／ｍｌがより好ましい。
は、反応液中、それぞれ０．０１〜２００Ｕ／ｍｌが好
ましく、０．１〜１００Ｕ／ｍｌがより好ましい。
【００４２】コレステロールエステラーゼおよびコレス
テロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロ
ゲナーゼとしてコレステロールエステラーゼとコレステ
ロールオキシダーゼとを用いるときは、コレステロール
の反応により酸素から過酸化水素が発生する。発生した
過酸化水素は、例えばパーオキシダーゼの存在下、４−
アミノアンチピリンとフェノール類、４−アミノアンチ
ピリンとトリンダー試薬または高感度の色素源を用いて
定量することができる。
テロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロ
ゲナーゼとしてコレステロールエステラーゼとコレステ
ロールオキシダーゼとを用いるときは、コレステロール
の反応により酸素から過酸化水素が発生する。発生した
過酸化水素は、例えばパーオキシダーゼの存在下、４−
アミノアンチピリンとフェノール類、４−アミノアンチ
ピリンとトリンダー試薬または高感度の色素源を用いて
定量することができる。
【００４３】フェノール類としては、例えばフェノー
ル、４−クロロフェノール、ｍ−クレゾール、３−ヒド
ロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）
等があげられる。
ル、４−クロロフェノール、ｍ−クレゾール、３−ヒド
ロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）
等があげられる。
【００４４】トリンダー試薬（同仁化学研究所第１９版
総合カタログ、１９９４年）としては、Ｎ−スルホプロ
ピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エ
チル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル
−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＴＯＰＳ）、
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５
−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジスルホプロピル−３，
５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロ
ピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピ
ルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５
−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−
ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル
−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン等の
アニリン類あるいはＮ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェ
ニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳ
Ｅ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’
−アセチルエチレンジアミン等があげられる。
総合カタログ、１９９４年）としては、Ｎ−スルホプロ
ピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エ
チル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル
−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン（ＴＯＰＳ）、
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５
−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ル−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジスルホプロピル−３，
５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロ
ピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピ
ルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５
−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−
ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル
−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン等の
アニリン類あるいはＮ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェ
ニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳ
Ｅ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’
−アセチルエチレンジアミン等があげられる。
【００４５】高感度の色素源としては、特公昭６０−３
３４７９号で示される１０−（Ｎ−メチルカルバモイ
ル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン
（ＭＣＤＰ）、特公平４−２７８３９で示されるビス
［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチ
ルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）、特開昭６２−
２９６号で示される化合物等があげられる。
３４７９号で示される１０−（Ｎ−メチルカルバモイ
ル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン
（ＭＣＤＰ）、特公平４−２７８３９で示されるビス
［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチ
ルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）、特開昭６２−
２９６号で示される化合物等があげられる。
【００４６】これら色素源の濃度としては、０．０１〜
10ｍｇ／ｍｌが好ましい。
10ｍｇ／ｍｌが好ましい。
【００４７】コレステロールエステラーゼおよびコレス
テロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロ
ゲナーゼとしてコレステロールエステラーゼとコレステ
ロールデヒドロゲナーゼとを用いるときは、コレステロ
ールの反応により酸化型補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）から
還元型補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈが発生する。ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈは、３００〜５００ｎｍ、好ましくは３３０〜
４００ｎｍ、特に好ましくは約３４０ｎｍでの反応液の
吸光度を測定することにより定量することができる。な
お、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの定量は、ジアホラーゼ、テトラゾ
リウム塩を添加してホルマザン色素を生成させ、ホルマ
ザン色素を比色して行うこともできる。
テロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロ
ゲナーゼとしてコレステロールエステラーゼとコレステ
ロールデヒドロゲナーゼとを用いるときは、コレステロ
ールの反応により酸化型補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）から
還元型補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈが発生する。ＮＡＤ
（Ｐ）Ｈは、３００〜５００ｎｍ、好ましくは３３０〜
４００ｎｍ、特に好ましくは約３４０ｎｍでの反応液の
吸光度を測定することにより定量することができる。な
お、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの定量は、ジアホラーゼ、テトラゾ
リウム塩を添加してホルマザン色素を生成させ、ホルマ
ザン色素を比色して行うこともできる。
【００４８】反応は、１０〜５０℃、好ましくは３０〜
４０℃、通常３７℃で、１〜３０分間、好ましくは２〜
１０分間行う。
４０℃、通常３７℃で、１〜３０分間、好ましくは２〜
１０分間行う。
【００４９】本発明を適用する生体試料は、特に限定さ
れず、具体的には血液自体または血漿、血清等の血液画
分を使用することができる。
れず、具体的には血液自体または血漿、血清等の血液画
分を使用することができる。
【００５０】本発明では、レムナント様リポ蛋白質中の
コレステロールの測定の精度を高めるために前述のコレ
ステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダ
ーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼの活性を
高める界面活性剤と共にまたは単独で、レムナント様リ
ポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対するコレステロールエス
テラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコ
レステロールデヒドロゲナーゼの作用を抑制する界面活
性剤を添加することが好ましい。該界面活性剤は、コレ
ステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダ
ーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリ
ン脂質を加水分解する酵素を作用させるに際して該酵素
と同時に添加することができるが、コレステロールエス
テラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコ
レステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分
解する酵素を作用させる前の生体試料に添加することが
好ましい。
コレステロールの測定の精度を高めるために前述のコレ
ステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダ
ーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼの活性を
高める界面活性剤と共にまたは単独で、レムナント様リ
ポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対するコレステロールエス
テラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコ
レステロールデヒドロゲナーゼの作用を抑制する界面活
性剤を添加することが好ましい。該界面活性剤は、コレ
ステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダ
ーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並びにリ
ン脂質を加水分解する酵素を作用させるに際して該酵素
と同時に添加することができるが、コレステロールエス
テラーゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコ
レステロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分
解する酵素を作用させる前の生体試料に添加することが
好ましい。
【００５１】レムナント様リポ蛋白質以外のリポ蛋白質
に対するコレステロールエステラーゼおよびコレステロ
ールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナ
ーゼの作用を抑制する界面活性剤としては、コレステロ
ールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼも
しくはコレステロールデヒドロゲナーゼのレムナント様
リポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対する作用を低減させる
界面活性剤であれば特に制限がないが、例えばポリオキ
シアルキレン誘導体およびポリオキシエチレン−ポリオ
キシプロピレン共重合体もしくはその誘導体等があげら
れる。
に対するコレステロールエステラーゼおよびコレステロ
ールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナ
ーゼの作用を抑制する界面活性剤としては、コレステロ
ールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼも
しくはコレステロールデヒドロゲナーゼのレムナント様
リポ蛋白質以外のリポ蛋白質に対する作用を低減させる
界面活性剤であれば特に制限がないが、例えばポリオキ
シアルキレン誘導体およびポリオキシエチレン−ポリオ
キシプロピレン共重合体もしくはその誘導体等があげら
れる。
【００５２】ポリオキシアルキレン誘導体としては、ポ
リオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレ
ンスチレン化フェニルエーテルまたはポリオキシエチレ
ン長鎖分岐アルキルエーテル等があげられ、該アルキル
としては、炭素数８以上の、例えばオクチル、ノニル等
があげられ、該アリールとしては、フェニル等があげら
れる。
リオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレ
ンスチレン化フェニルエーテルまたはポリオキシエチレ
ン長鎖分岐アルキルエーテル等があげられ、該アルキル
としては、炭素数８以上の、例えばオクチル、ノニル等
があげられ、該アリールとしては、フェニル等があげら
れる。
【００５３】具体的なポリオキシアルキレン誘導体とし
ては、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとして例え
ばノニオンＨＳ−２１０、ノニオンＨＳ−２１５、ノニ
オンＮＳ−２０８．５、ノニオンＨＳ−２０８（以上、
日本油脂社製）、エマルゲンＬ−４０、エマルゲン９１
１、エマルゲン８１０（以上、花王社製）、ポリオキシ
エチレンスチレン化フェニルエーテルとして例えばブロ
ウオン（ＢＬＡＵＯＮ）ＴＳＰ−５０（青木油脂社製）
等の市販品があげられる。
ては、ポリオキシエチレンアルキルエーテルとして例え
ばノニオンＨＳ−２１０、ノニオンＨＳ−２１５、ノニ
オンＮＳ−２０８．５、ノニオンＨＳ−２０８（以上、
日本油脂社製）、エマルゲンＬ−４０、エマルゲン９１
１、エマルゲン８１０（以上、花王社製）、ポリオキシ
エチレンスチレン化フェニルエーテルとして例えばブロ
ウオン（ＢＬＡＵＯＮ）ＴＳＰ−５０（青木油脂社製）
等の市販品があげられる。
【００５４】ポリオキシアルキレン誘導体の親水性・親
油性バランス（以下、ＨＬＢという）は、９〜２０が好
ましい。
油性バランス（以下、ＨＬＢという）は、９〜２０が好
ましい。
【００５５】ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレ
ン共重合体としては、ポリオキシエチレンとポリオキシ
プロピレンのランダム共重合体でもブロック共重合体で
もよく、例えば一般式（Ｉ）
ン共重合体としては、ポリオキシエチレンとポリオキシ
プロピレンのランダム共重合体でもブロック共重合体で
もよく、例えば一般式（Ｉ）
【００５６】
【化５】
【００５７】［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異な
って１〜２００の整数を表し、Ｒは直鎖または分岐のア
ルキルを表す。]で表される化合物があげられる。
って１〜２００の整数を表し、Ｒは直鎖または分岐のア
ルキルを表す。]で表される化合物があげられる。
【００５８】直鎖または分岐のアルキルとしては、好ま
しくは炭素数１〜３０のアルキル、より好ましくは炭素
数２〜２４のアルキルがあげられる。
しくは炭素数１〜３０のアルキル、より好ましくは炭素
数２〜２４のアルキルがあげられる。
【００５９】一般式（Ｉ）で表される化合物としては、
例えば、プロニックＬ−１２１、プルロニックＬ−１２
２、プルロニックＬ−１０１、プルロニックＰ−１０
３、プルロニックＦ−１０８等の市販品（いずれも旭電
化社製）、ポリオキシアルキレン長鎖分岐アルキルエー
テルとして例えばユニルーブＭＴ０６２０Ｂ（日本油脂
社製）があげられる。また、一般式（Ｉ）で表される化
合物中のポリプロピレングリコール基の分子量として
は、２，０５０以上が好ましく、２，７５０以上がより
好ましく、３，２５０以上が特に好ましい。ポリオキシ
エチレン−ポリオキシプロピレン共重合体のＨＬＢは、
１〜６が好ましい。
例えば、プロニックＬ−１２１、プルロニックＬ−１２
２、プルロニックＬ−１０１、プルロニックＰ−１０
３、プルロニックＦ−１０８等の市販品（いずれも旭電
化社製）、ポリオキシアルキレン長鎖分岐アルキルエー
テルとして例えばユニルーブＭＴ０６２０Ｂ（日本油脂
社製）があげられる。また、一般式（Ｉ）で表される化
合物中のポリプロピレングリコール基の分子量として
は、２，０５０以上が好ましく、２，７５０以上がより
好ましく、３，２５０以上が特に好ましい。ポリオキシ
エチレン−ポリオキシプロピレン共重合体のＨＬＢは、
１〜６が好ましい。
【００６０】レムナント様リポ蛋白質以外のリポ蛋白質
に対するコレステロールエステラーゼおよびコレステロ
ールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナ
ーゼの作用を抑制する界面活性剤の使用濃度は特に限定
されないが、０．００１〜１０％が好ましく、０．０１
〜５％がより好ましく、０．０５〜１％が特に好まし
い。
に対するコレステロールエステラーゼおよびコレステロ
ールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナ
ーゼの作用を抑制する界面活性剤の使用濃度は特に限定
されないが、０．００１〜１０％が好ましく、０．０１
〜５％がより好ましく、０．０５〜１％が特に好まし
い。
【００６１】反応液には、必要によりリポ蛋白質凝集
剤、他の酵素等を含有させることができる。
剤、他の酵素等を含有させることができる。
【００６２】リポ蛋白質凝集剤としてはリンタングステ
ン酸塩、デキストラン硫酸塩、ヘパリンなどのポリアニ
オンが、マグネシウム、カルシウム、コバルト等の２価
の金属塩があげられる。他の酵素としてはアルコルビン
酸オキシダーゼ等があげられる。以下に本発明の実施例
を示す。
ン酸塩、デキストラン硫酸塩、ヘパリンなどのポリアニ
オンが、マグネシウム、カルシウム、コバルト等の２価
の金属塩があげられる。他の酵素としてはアルコルビン
酸オキシダーゼ等があげられる。以下に本発明の実施例
を示す。
【００６３】
【実施例１】実施例１ 下記のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定
試薬を作成した。 試薬１ グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．３ｇ／Ｌ 硫酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ プルロニックＦ−１０８（旭電化社製） １ｇ／Ｌ パ−オキシダーゼ（ＰＯＤ、東洋紡社製） １０単位／ｍｌ アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ、旭化成社製） ２単位／ｍｌ
試薬を作成した。 試薬１ グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．３ｇ／Ｌ 硫酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ プルロニックＦ−１０８（旭電化社製） １ｇ／Ｌ パ−オキシダーゼ（ＰＯＤ、東洋紡社製） １０単位／ｍｌ アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ、旭化成社製） ２単位／ｍｌ
【００６４】試薬２ グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ ４−アミノアンチピリン（半井化学社製） ０．５ｇ／Ｌ エマルゲンＬ−４０（花王社製） ２ｇ／Ｌ パーオキシダーゼ（東洋紡社製） １０単位／ｍｌ コレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ、旭化成社製） １単位／ｍｌ コレステロールオキシダーゼ（協和発酵工業社製） ２単位／ｍｌ ホスホリパーゼ Ｄ（旭化成社製） ５単位／ｍｌ
【００６５】実施例２ 下記のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定
試薬を作成した。 試薬１ グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．３ｇ／Ｌ 硫酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５０（青木油脂社製） ２ｇ／Ｌ パ−オキシダーゼ（ＰＯＤ、東洋紡社製） １０単位／ｍｌ アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ、旭化成社製） ２単位／ｍｌ
試薬を作成した。 試薬１ グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．３ｇ／Ｌ 硫酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５０（青木油脂社製） ２ｇ／Ｌ パ−オキシダーゼ（ＰＯＤ、東洋紡社製） １０単位／ｍｌ アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ、旭化成社製） ２単位／ｍｌ
【００６６】 試薬２ グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ ４−アミノアンチピリン（半井化学社製） ０．５ｇ／Ｌ エマルゲンＬ−４０（花王社製） ２ｇ／Ｌ パーオキシダーゼ（東洋紡社製） １０単位／ｍｌ コレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ、旭化成社製） １単位／ｍｌ コレステロールオキシダーゼ（協和発酵工業社製） ２単位／ｍｌ ホスホリパーゼ Ｄ（旭化成社製） ５単位／ｍｌ
【００６７】実施例３ 下記のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定
試薬を作成した。 試薬１ グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．３ｇ／Ｌ 硫酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ ユニルーブＭＴ−０６２０Ｂ（日本油脂社製） ０．５ｇ／Ｌ パ−オキシダーゼ（ＰＯＤ、東洋紡社製） １０単位／ｍｌ アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ、旭化成社製） ２単位／ｍｌ
試薬を作成した。 試薬１ グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．３ｇ／Ｌ 硫酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ ユニルーブＭＴ−０６２０Ｂ（日本油脂社製） ０．５ｇ／Ｌ パ−オキシダーゼ（ＰＯＤ、東洋紡社製） １０単位／ｍｌ アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ、旭化成社製） ２単位／ｍｌ
【００６８】 試薬２ グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ ４−アミノアンチピリン（半井化学社製） ０．５ｇ／Ｌ エマルゲンＬ−４０（花王社製） ２ｇ／Ｌ パーオキシダーゼ（東洋紡社製） １０単位／ｍｌ コレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ、旭化成社製） １単位／ｍｌ コレステロールオキシダーゼ（協和発酵工業社製） ２単位／ｍｌ ホスホリパーゼ Ｄ（旭化成社製） ５単位／ｍｌ
【００６９】実施例４ 下記のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定
試薬を作成した。 グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．３ｇ／Ｌ 硫酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５０（青木油脂社製） ２ｇ／Ｌ パ−オキシダーゼ（ＰＯＤ、東洋紡社製） １０単位／ｍｌ アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ、旭化成社製） ２単位／ｍｌ
試薬を作成した。 グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．３ｇ／Ｌ 硫酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５０（青木油脂社製） ２ｇ／Ｌ パ−オキシダーゼ（ＰＯＤ、東洋紡社製） １０単位／ｍｌ アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ、旭化成社製） ２単位／ｍｌ
【００７０】 試薬２ グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ ４−アミノアンチピリン（半井化学社製） ０．５ｇ／Ｌ エマルゲンＬ−４０（花王社製） ２ｇ／Ｌ パーオキシダーゼ（東洋紡社社製） １０単位／ｍｌ コレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ、旭化成社製） １単位／ｍｌ コレステロールオキシダーゼ（協和発酵工業社製） ２単位／ｍｌ ホスホリパーゼ Ｃ（旭化成社製） ２０単位／ｍｌ
【００７１】実施例５ 下記のレムナント様リポ蛋白質中のコレステロール測定
試薬を作成した。 グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．３ｇ／Ｌ 硫酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５０（青木油脂社製） ２ｇ／Ｌ パ−オキシダーゼ（ＰＯＤ、東洋紡社製） １０単位／ｍｌ アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ、旭化成社製） ２単位／ｍｌ
試薬を作成した。 グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ ＴＯＯＳ（同仁化学社製） ０．３ｇ／Ｌ 硫酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ ＢＬＡＵＮＯＮ ＴＳＰ−５０（青木油脂社製） ２ｇ／Ｌ パ−オキシダーゼ（ＰＯＤ、東洋紡社製） １０単位／ｍｌ アスコルビン酸オキシダーゼ（ＡＯＤ、旭化成社製） ２単位／ｍｌ
【００７２】 試薬２ グッド緩衝剤ｐＨ６．８（ＭＯＰＳ、同仁化学社製） ２０ｍＭ ４−アミノアンチピリン（半井化学社製） ０．５ｇ／Ｌ エマルゲンＬ−４０（花王社製） ２ｇ／Ｌ パーオキシダーゼ（東洋紡社製） １０単位／ｍｌ コレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ、旭化成社製） １単位／ｍｌ コレステロールオキシダーゼ（協和発酵工業社製） ２単位／ｍｌ ホスホリパーゼ Ａ２（旭化成社製） ５０単位／ｍｌ
【００７３】実施例６ 新鮮な血清検体７０検体を下記の操作により測定した。
【００７４】実施例１の試薬１を２．２５ｍｌ分光光度
計のセルに入れ、血清３０μｌを添加して攪拌し、３７
℃で５分間加温した。ついで３７℃に予備加温された実
施例１の試薬２を０．７５ｍｌ添加して攪拌し、５分間
加温した後、５５５ｎｍにて吸光度の変化を測定した。
日本抗体研究所社製ＲＬＰ−Ｃ測定キットでレムナント
様リポ蛋白質中のコレステロール値が４９．６ｍｇ／ｄ
Ｌである血清標準液を用いて同様に操作し検量線を作成
し、上記吸光度の変化から検体中のコレステロール値を
求めた。
計のセルに入れ、血清３０μｌを添加して攪拌し、３７
℃で５分間加温した。ついで３７℃に予備加温された実
施例１の試薬２を０．７５ｍｌ添加して攪拌し、５分間
加温した後、５５５ｎｍにて吸光度の変化を測定した。
日本抗体研究所社製ＲＬＰ−Ｃ測定キットでレムナント
様リポ蛋白質中のコレステロール値が４９．６ｍｇ／ｄ
Ｌである血清標準液を用いて同様に操作し検量線を作成
し、上記吸光度の変化から検体中のコレステロール値を
求めた。
【００７５】一方、前述の新鮮な血液検体７０検体を、
日本抗体研究所社製のＲＬＰ−Ｃ測定キットを用いてレ
ムナント様リポ蛋白質中のコレステロール値を測定し、
得られるコレステロール値との相関性を調べた。
日本抗体研究所社製のＲＬＰ−Ｃ測定キットを用いてレ
ムナント様リポ蛋白質中のコレステロール値を測定し、
得られるコレステロール値との相関性を調べた。
【００７６】結果を図１に示す。実施例１の試薬を用い
て得られるコレステロール値とレムナント様リポ蛋白質
中のコレステロール測定試薬である日本抗体研究所社製
ＲＬＰ−Ｃ測定キットで得られるコレステロール値とに
は良好な相関が認められ、相関係数は０．９４５であっ
た。このことから、実施例１の試薬により、レムナント
様リポ蛋白質中のコレステロール値を簡便に測定できる
ことが示される。
て得られるコレステロール値とレムナント様リポ蛋白質
中のコレステロール測定試薬である日本抗体研究所社製
ＲＬＰ−Ｃ測定キットで得られるコレステロール値とに
は良好な相関が認められ、相関係数は０．９４５であっ
た。このことから、実施例１の試薬により、レムナント
様リポ蛋白質中のコレステロール値を簡便に測定できる
ことが示される。
【００７７】実施例７ 実施例２の試薬を用いて実施例６と同様に測定した結
果、相関係数は０．８４であった。このことから、実施
例２の試薬により、レムナント様リポ蛋白質中のコレス
テロール値を簡便に測定できることが示される。
果、相関係数は０．８４であった。このことから、実施
例２の試薬により、レムナント様リポ蛋白質中のコレス
テロール値を簡便に測定できることが示される。
【００７８】実施例８ 実施例３の試薬を用いて実施例６と同様に試験した結
果、相関係数は０．９３であった。このことから、実施
例３の試薬により、レムナント様リポ蛋白質中のコレス
テロール値を簡便に測定できることが示される。
果、相関係数は０．９３であった。このことから、実施
例３の試薬により、レムナント様リポ蛋白質中のコレス
テロール値を簡便に測定できることが示される。
【００７９】実施例９ 実施例４の試薬を用いて実施例６と同様に試験した結
果、相関係数は０．８７であった。このことから、実施
例４の試薬により、レムナント様リポ蛋白質中のコレス
テロール値を簡便に測定できることが示される。
果、相関係数は０．８７であった。このことから、実施
例４の試薬により、レムナント様リポ蛋白質中のコレス
テロール値を簡便に測定できることが示される。
【００８０】実施例１０ 実施例５の試薬を用いて実施例６と同様に試験した結
果、相関係数は０．８５であった。このことから、実施
例５の試薬により、レムナント様リポ蛋白質中のコレス
テロール値を簡便に測定できることが示される。
果、相関係数は０．８５であった。このことから、実施
例５の試薬により、レムナント様リポ蛋白質中のコレス
テロール値を簡便に測定できることが示される。
【００８１】
【発明の効果】本発明により、試料の分離操作が不要な
レムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを簡便に感
度良く測定する方法および測定試薬が提供される。
レムナント様リポ蛋白質中のコレステロールを簡便に感
度良く測定する方法および測定試薬が提供される。
【図１】 実施例１の試薬を用いて得られるコレステ
ロール値（縦軸）と日本抗体研究所社製ＲＬＰ−Ｃ測定
キットを用いて得られるコレステロール値（横軸）との
相関図を示す。
ロール値（縦軸）と日本抗体研究所社製ＲＬＰ−Ｃ測定
キットを用いて得られるコレステロール値（横軸）との
相関図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/92 Ｇ０１Ｎ 33/92 Ｂ
Claims (18)
- 【請求項１】 生体試料にコレステロールエステラーゼ
およびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロ
ールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵
素を作用させ、生成する過酸化水素または還元型補酵素
を測定することによりレムナント様リポ蛋白質中のコレ
ステロールを測定することを特徴とする、生体試料中の
レムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定方
法。 - 【請求項２】 コレステロールエステラーゼおよびコレ
ステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒド
ロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を作用さ
せるに際し、界面活性剤を添加する請求項１記載の測定
方法。 - 【請求項３】 生体試料が、コレステロールエステラー
ゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステ
ロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する
酵素を作用させる前に界面活性剤が添加されたものであ
る請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 界面活性剤が、レムナント様リポ蛋白質
以外のリポ蛋白質に対するコレステロールエステラーゼ
およびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロ
ールデヒドロゲナーゼの作用を抑制する界面活性剤であ
る請求項２または３記載の方法。 - 【請求項５】 界面活性剤が、ポリオキシアルキレン誘
導体またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン
共重合体もしくはその誘導体である請求項２〜４のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項６】 生体試料が、コレステロールエステラー
ゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステ
ロールデヒドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する
酵素を作用させる前にポリオキシエチレン−ポリオキシ
プロピレン共重合体もしくはその誘導体が添加されたも
のであり、コレステロールエステラーゼおよびコレステ
ロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲ
ナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素を作用させる
に際しポリオキシアルキレン誘導体を添加する請求項１
記載の方法。 - 【請求項７】 ポリオキシアルキレン誘導体が、ポリオ
キシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンス
チレン化フェニルエーテルまたはポリオキシエチレン長
鎖分岐アルキルエーテルである請求項５または６記載の
方法。 - 【請求項８】 ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピ
レン共重合体もしくはその誘導体が一般式（Ｉ） 【化１】 ［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異なって１〜２０
０の整数を表し、Ｒは直鎖または分岐のアルキルを表
す。]で表される化合物である請求項５または６記載の
方法。 - 【請求項９】 リン脂質を加水分解する酵素がホスホリ
パーゼＤ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ２であ
る請求項１〜８のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】 コレステロールエステラーゼおよびコ
レステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒ
ドロゲナーゼ並びにリン脂質を加水分解する酵素からな
るレムナント様リポ蛋白質中のコレステロールの測定試
薬。 - 【請求項１１】 界面活性剤を含有する請求項１０記載
の測定試薬。 - 【請求項１２】 界面活性剤を含有する第１試薬、およ
びコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオ
キシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ並
びにリン脂質を加水分解する酵素を含有する第２試薬か
らなる請求項１０記載の測定試薬。 - 【請求項１３】 界面活性剤が、レムナント様リポ蛋白
質以外のリポ蛋白質に対するコレステロールエステラー
ゼおよびコレステロールオキシダーゼもしくはコレステ
ロールデヒドロゲナーゼの作用を抑制する界面活性剤で
ある請求項１１または１２記載の測定試薬。 - 【請求項１４】 界面活性剤が、ポリオキシアルキレン
誘導体またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレ
ン共重合体もしくはその誘導体である請求項１１または
１２記載の測定試薬。 - 【請求項１５】 第１試薬の界面活性剤が、ポリオキシ
エチレン−ポリオキシプロピレン共重合体であり、第２
試薬にポリオキシアルキレン誘導体を含有する請求項１
２記載の測定試薬。 - 【請求項１６】 ポリオキシアルキレン誘導体が、ポリ
オキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン
スチレン化フェニルエーテルまたはポリオキシエチレン
長鎖分岐アルキルエーテルである請求項１４または１５
記載の測定試薬。 - 【請求項１７】 ポリオキシエチレン−ポリオキシプロ
ピレン共重合体もしくはその導体が一般式（Ｉ） 【化２】 ［式中、ａ、ｂおよびｃは同一または異なって１〜２０
０の整数を表し、Ｒは直鎖または分岐のアルキルを表
す。]で表される化合物である請求項１４または１５記
載の測定試薬。 - 【請求項１８】 リン脂質を加水分解する酵素がホスホ
リパーゼＤ、ホスホリパーゼＣ、ホスホリパーゼＡ２で
ある請求項１０〜１７のいずれかに記載の測定試薬。
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