JPH08105875A - リポタンパク質分離用充填剤、その充填剤を充填してなる抗体カラム及びそのカラムを用いたレムナント様リポタンパク質の分析方法 - Google Patents
リポタンパク質分離用充填剤、その充填剤を充填してなる抗体カラム及びそのカラムを用いたレムナント様リポタンパク質の分析方法Info
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- JPH08105875A JPH08105875A JP6215767A JP21576794A JPH08105875A JP H08105875 A JPH08105875 A JP H08105875A JP 6215767 A JP6215767 A JP 6215767A JP 21576794 A JP21576794 A JP 21576794A JP H08105875 A JPH08105875 A JP H08105875A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】試料中のリポタンパク質分離用充填剤、該充填
剤を充填したリポタンパク質分離用の抗体カラム及び該
カラムを使用した、操作の繁雑さが改良され、迅速性、
操作性かつ分析の自動化が容易な血清中のレムナント様
リポタンパク質の分析方法を提供する。 【構成】非多孔性不溶性支持体に、アポＢ−４８を認識
しない抗ヒトアポＡ−Ｉモノクロ−ナル抗体及びアポＢ
−４８を認識しない抗ヒトアポＢ−１００モノクロ−ナ
ル抗体を固定化してなる、リポタンパク質分離用充填
剤、該充填剤を充填したカラム及び該カラムを使用する
レムナント様リポタンパク質の分析方法により前記目的
を達成する。
剤を充填したリポタンパク質分離用の抗体カラム及び該
カラムを使用した、操作の繁雑さが改良され、迅速性、
操作性かつ分析の自動化が容易な血清中のレムナント様
リポタンパク質の分析方法を提供する。 【構成】非多孔性不溶性支持体に、アポＢ−４８を認識
しない抗ヒトアポＡ−Ｉモノクロ−ナル抗体及びアポＢ
−４８を認識しない抗ヒトアポＢ−１００モノクロ−ナ
ル抗体を固定化してなる、リポタンパク質分離用充填
剤、該充填剤を充填したカラム及び該カラムを使用する
レムナント様リポタンパク質の分析方法により前記目的
を達成する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、リポタンパク質分離用
充填剤、該充填剤を充填してなるリポタンパク質分離用
抗体カラム、そして該カラムを用いる血清試料中のレム
ナント様リポタンパク質の分析方法に関するものであ
る。
充填剤、該充填剤を充填してなるリポタンパク質分離用
抗体カラム、そして該カラムを用いる血清試料中のレム
ナント様リポタンパク質の分析方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】レムナント様リポタンパク質（ＲＬＰ）
は、カイロミクロン（ＣＭ）や超低比重リポタンパク質
（ＶＬＤＬ）などがリポタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）に
よって分解された異常リポタンパク質で、動脈硬化性疾
患と関連性が高く、心筋梗塞患者の脂質代謝異常の診断
やＩＩＩ型高脂血症の臨床診断に応用されている。
は、カイロミクロン（ＣＭ）や超低比重リポタンパク質
（ＶＬＤＬ）などがリポタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）に
よって分解された異常リポタンパク質で、動脈硬化性疾
患と関連性が高く、心筋梗塞患者の脂質代謝異常の診断
やＩＩＩ型高脂血症の臨床診断に応用されている。
【０００３】通常のリポタンパク質は、アポリポタンパ
ク質成分としてアポＡ−ＩまたはアポＢ−１００のいず
れかを有し、アポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＡ−
Ｉモノクローナル抗体又は抗ヒトアポＢ−１００モノク
ローナル抗体のいずれかに反応するが、ＲＬＰはこれら
のどちらの抗体にも反応しないリポタンパク質で、異常
リポタンパク質と考えられている。
ク質成分としてアポＡ−ＩまたはアポＢ−１００のいず
れかを有し、アポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＡ−
Ｉモノクローナル抗体又は抗ヒトアポＢ−１００モノク
ローナル抗体のいずれかに反応するが、ＲＬＰはこれら
のどちらの抗体にも反応しないリポタンパク質で、異常
リポタンパク質と考えられている。
【０００４】従来、ＲＬＰの分析法としては、ＲＬＰに
含まれるコレステロ−ル量を分析することにより実施さ
れている。詳しくは、抗ヒトアポＡ−Ｉ及びＢ−１００
モノクローナル抗体を固定化した不溶性支持体と緩衝液
の懸濁液に、試料を添加しゆっくり振とう混和し、静置
後、抗体と反応しなかったＲＬＰを含む上清液にＲＬＰ
のコレステロール部分に反応する酵素試薬を加え、上清
液中のコレステロールを測定するなどの、抗体を利用し
た分析方法（免疫吸着法）がある。
含まれるコレステロ−ル量を分析することにより実施さ
れている。詳しくは、抗ヒトアポＡ−Ｉ及びＢ−１００
モノクローナル抗体を固定化した不溶性支持体と緩衝液
の懸濁液に、試料を添加しゆっくり振とう混和し、静置
後、抗体と反応しなかったＲＬＰを含む上清液にＲＬＰ
のコレステロール部分に反応する酵素試薬を加え、上清
液中のコレステロールを測定するなどの、抗体を利用し
た分析方法（免疫吸着法）がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従来の免疫吸着法で
は、試料と抗体との抗原抗体反応を不足なく行なうた
め、抗体を固定化した不溶性支持体の懸濁液と試料との
振とう混和に長時間を要するうえ、ＲＬＰを含む上清液
の採取操作や反応試薬を加える操作が繁雑である。この
ため、検体数が多く、かつ、検査に迅速性が要求される
ような臨床検査の現場などでは、ルーチン分析として用
いるのには実用的ではないという課題がある。
は、試料と抗体との抗原抗体反応を不足なく行なうた
め、抗体を固定化した不溶性支持体の懸濁液と試料との
振とう混和に長時間を要するうえ、ＲＬＰを含む上清液
の採取操作や反応試薬を加える操作が繁雑である。この
ため、検体数が多く、かつ、検査に迅速性が要求される
ような臨床検査の現場などでは、ルーチン分析として用
いるのには実用的ではないという課題がある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前述の課
題点を解決するために鋭意研究を重ねた結果、本発明を
完成した。
題点を解決するために鋭意研究を重ねた結果、本発明を
完成した。
【０００７】即ち本発明は、非多孔性不溶性支持体に、
アポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＡ−Ｉモノクロ−
ナル抗体及びアポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＢ−
１００モノクロ−ナル抗体を固定化してなる、リポタン
パク質分離用充填剤である。また本発明は、非多孔性不
溶性支持体に、アポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＡ
−Ｉモノクロ−ナル抗体及びアポＢ−４８を認識しない
抗ヒトアポＢ−１００モノクロ−ナル抗体を固定化した
リポタンパク質分離用充填剤を充填してなる、リポタン
パク質分離用抗体カラムである。そして本発明は、ヒト
血清試料中のＲＬＰ以外のリポタンパク質を、非多孔性
不溶性支持体にアポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＡ
−Ｉモノクロ−ナル抗体及びアポＢ−４８を認識しない
抗ヒトアポＢ−１００モノクロ−ナル抗体を固定化した
リポタンパク質分離用充填剤を充填してなるリポタンパ
ク質分離用抗体カラムで分離し、分離されなかったＲＬ
Ｐのコレステロ−ル量を分析することからなる、当該血
清試料中のＲＬＰの分析方法である。以下本発明を詳細
に説明する。
アポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＡ−Ｉモノクロ−
ナル抗体及びアポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＢ−
１００モノクロ−ナル抗体を固定化してなる、リポタン
パク質分離用充填剤である。また本発明は、非多孔性不
溶性支持体に、アポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＡ
−Ｉモノクロ−ナル抗体及びアポＢ−４８を認識しない
抗ヒトアポＢ−１００モノクロ−ナル抗体を固定化した
リポタンパク質分離用充填剤を充填してなる、リポタン
パク質分離用抗体カラムである。そして本発明は、ヒト
血清試料中のＲＬＰ以外のリポタンパク質を、非多孔性
不溶性支持体にアポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＡ
−Ｉモノクロ−ナル抗体及びアポＢ−４８を認識しない
抗ヒトアポＢ−１００モノクロ−ナル抗体を固定化した
リポタンパク質分離用充填剤を充填してなるリポタンパ
ク質分離用抗体カラムで分離し、分離されなかったＲＬ
Ｐのコレステロ−ル量を分析することからなる、当該血
清試料中のＲＬＰの分析方法である。以下本発明を詳細
に説明する。
【０００８】本発明のリポタンパク質分離用充填剤は、
ＲＬＰ以外のリポタンパク質を結合することのできる充
填剤である。充填剤に使用する不溶性支持体には、例え
ば高速液体クロマトグラフィ−等に使用されている、シ
リカ、ポリビニルアルコ−ル又はポリヒドロキシメタク
リレ−ト等に代表される、親水性樹脂等の非多孔性でか
つ不溶性の支持体を使用することができる。これら支持
体以外にも、本発明を実施しようとする条件に合致する
ものであれば、特に制限はなく、例えば機械的強度や実
施の際のｐＨ等を考慮して適宜選択することができる。
特にポリビニルアルコ−ルやポリヒドロキシメタクリレ
−トの支持体は、機械的強度に優れ、かつ、広範囲のｐ
Ｈ条件下で安定であり、本発明の支持体として好まし
い。
ＲＬＰ以外のリポタンパク質を結合することのできる充
填剤である。充填剤に使用する不溶性支持体には、例え
ば高速液体クロマトグラフィ−等に使用されている、シ
リカ、ポリビニルアルコ−ル又はポリヒドロキシメタク
リレ−ト等に代表される、親水性樹脂等の非多孔性でか
つ不溶性の支持体を使用することができる。これら支持
体以外にも、本発明を実施しようとする条件に合致する
ものであれば、特に制限はなく、例えば機械的強度や実
施の際のｐＨ等を考慮して適宜選択することができる。
特にポリビニルアルコ−ルやポリヒドロキシメタクリレ
−トの支持体は、機械的強度に優れ、かつ、広範囲のｐ
Ｈ条件下で安定であり、本発明の支持体として好まし
い。
【０００９】非多孔性不溶性支持体に固定化する、アポ
Ｂ−４８を認識しない抗ヒトアポＡ−Ｉモノクロ−ナル
抗体やアポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＢ−１００
モノクロ−ナル抗体は、例えば実施例に示したような市
販のものを使用することが可能であるが、また例えばモ
ノクロ−ナル抗体（Ａ．Ｍ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ著、大沢
利昭監訳、東京化学同人）等の記載に従って調製するこ
ともできる。またそれらの固定化については、例えばＭ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．
ＸＸＸＩＶ、ｓｅｃｔｉｏｎ２の記載等、従来知られた
方法に従えば良い。
Ｂ−４８を認識しない抗ヒトアポＡ−Ｉモノクロ−ナル
抗体やアポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＢ−１００
モノクロ−ナル抗体は、例えば実施例に示したような市
販のものを使用することが可能であるが、また例えばモ
ノクロ−ナル抗体（Ａ．Ｍ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ著、大沢
利昭監訳、東京化学同人）等の記載に従って調製するこ
ともできる。またそれらの固定化については、例えばＭ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．
ＸＸＸＩＶ、ｓｅｃｔｉｏｎ２の記載等、従来知られた
方法に従えば良い。
【００１０】本発明のリポタンパク質分離用抗体カラム
は、前述した本発明の充填剤を、適当なカラムに充填し
たものである。カラムの材質としてはガラスやステンレ
ス等を例示できるが、迅速なＲＬＰの分離を目的として
高速液体クロマトグラフィ−操作を実施する場合には、
耐圧性に優れたステンレス等の金属製カラムに充填剤を
充填することが好ましい。
は、前述した本発明の充填剤を、適当なカラムに充填し
たものである。カラムの材質としてはガラスやステンレ
ス等を例示できるが、迅速なＲＬＰの分離を目的として
高速液体クロマトグラフィ−操作を実施する場合には、
耐圧性に優れたステンレス等の金属製カラムに充填剤を
充填することが好ましい。
【００１１】本発明のリポタンパク質分離用充填剤にお
いては、非多孔性不溶性支持体を使用し、抗体を支持体
の表面にのみ固定化するため、種々の利点を有してい
る。例えば、多孔性支持体においては、その孔内部にも
抗体を固定化することが可能であるが、分子サイズの大
きいリポタンパク質は孔内部を速やかに移動することが
できないため、そこに固定化された抗体との結合に時間
がかかり、結局ＲＬＰと他のリポタンパク質との分離に
長時間を要するが、非多孔性支持体を用いた場合には、
分子サイズとは無関係にＲＬＰ以外のリポタンパク質は
抗体と結合し、結局ＲＬＰと他のリポタンパク質との分
離を迅速に行うことが可能になる。
いては、非多孔性不溶性支持体を使用し、抗体を支持体
の表面にのみ固定化するため、種々の利点を有してい
る。例えば、多孔性支持体においては、その孔内部にも
抗体を固定化することが可能であるが、分子サイズの大
きいリポタンパク質は孔内部を速やかに移動することが
できないため、そこに固定化された抗体との結合に時間
がかかり、結局ＲＬＰと他のリポタンパク質との分離に
長時間を要するが、非多孔性支持体を用いた場合には、
分子サイズとは無関係にＲＬＰ以外のリポタンパク質は
抗体と結合し、結局ＲＬＰと他のリポタンパク質との分
離を迅速に行うことが可能になる。
【００１２】本発明のＲＬＰの分析方法は、前述のよう
なリポタンパク質分離用抗体カラムを使用することによ
り、簡便かつ迅速にＲＬＰを分析する方法である。本発
明の分析方法においては、まず試料中のＲＬＰ以外のリ
ポタンパク質を、リポタンパク質分離用抗体カラムを用
いて分離する。試料としては、ヒト血清試料を使用する
が、これは例えば、ヒトの血液から血球成分等を除去し
たもので良く、特別の前処理などは不要である。
なリポタンパク質分離用抗体カラムを使用することによ
り、簡便かつ迅速にＲＬＰを分析する方法である。本発
明の分析方法においては、まず試料中のＲＬＰ以外のリ
ポタンパク質を、リポタンパク質分離用抗体カラムを用
いて分離する。試料としては、ヒト血清試料を使用する
が、これは例えば、ヒトの血液から血球成分等を除去し
たもので良く、特別の前処理などは不要である。
【００１３】リポタンパク質分離用抗体カラムを用いる
ＲＬＰ以外のリポタンパク質の分離は、操作性や迅速性
の向上という観点から、高速液体クロマトグラフィ−操
作によることが特に好ましい。このため、分析に用いる
抗体カラムに充填する充填剤としては、前記したような
機械的強度等に優れた支持体を用いたものであることが
好ましい。
ＲＬＰ以外のリポタンパク質の分離は、操作性や迅速性
の向上という観点から、高速液体クロマトグラフィ−操
作によることが特に好ましい。このため、分析に用いる
抗体カラムに充填する充填剤としては、前記したような
機械的強度等に優れた支持体を用いたものであることが
好ましい。
【００１４】ＲＬＰの分析に際し、ヒト血清試料中のＲ
ＬＰとＲＬＰ以外のリポタンパク質の分離に使用する溶
離液としては、充填剤に含まれるモノクロ−ナル抗体と
試料中のリポタンパク質の結合を妨害せず、かつＲＬＰ
を支持体表面等に非特異的に吸着させない性質のもので
あれば特に制限はなく、例えばビス−トリス、ビス−ト
リスプロパン、トリスエタノ−ルアミン、リン酸等の緩
衝液を例示することができる。これら緩衝液は、２０ｍ
Ｍ濃度以上の使用により緩衝能を十分大きくすることが
でき、一方、２００ｍＭ濃度程度までは、後の操作でコ
レステロ−ルと反応して光学的に測定可能な信号を発す
る酵素と色素の組み合わせを用いた場合にも酵素反応を
阻害することがないため、本発明においては２０〜２０
０ｍＭの範囲、より好ましくは５０〜１００ｍＭの範囲
で使用すると良い。またそのｐＨとしては、ｐＨ５〜
９、より好ましくは７〜８とすることで後の操作で酵素
等を使用する場合にも良好な結果を得ることができる。
なお、以上の溶離液には、充填剤へのリポタンパク質の
非特異的吸着をより抑制するために緩衝液以外の塩を添
加することが好ましい。一例として、例えば１０〜１０
０ｍＭ濃度、より好ましくは５０〜１００ｍＭ濃度とな
るように、塩化ナトリウムや硫酸ナトリウム等を添加す
ることが例示できる。
ＬＰとＲＬＰ以外のリポタンパク質の分離に使用する溶
離液としては、充填剤に含まれるモノクロ−ナル抗体と
試料中のリポタンパク質の結合を妨害せず、かつＲＬＰ
を支持体表面等に非特異的に吸着させない性質のもので
あれば特に制限はなく、例えばビス−トリス、ビス−ト
リスプロパン、トリスエタノ−ルアミン、リン酸等の緩
衝液を例示することができる。これら緩衝液は、２０ｍ
Ｍ濃度以上の使用により緩衝能を十分大きくすることが
でき、一方、２００ｍＭ濃度程度までは、後の操作でコ
レステロ−ルと反応して光学的に測定可能な信号を発す
る酵素と色素の組み合わせを用いた場合にも酵素反応を
阻害することがないため、本発明においては２０〜２０
０ｍＭの範囲、より好ましくは５０〜１００ｍＭの範囲
で使用すると良い。またそのｐＨとしては、ｐＨ５〜
９、より好ましくは７〜８とすることで後の操作で酵素
等を使用する場合にも良好な結果を得ることができる。
なお、以上の溶離液には、充填剤へのリポタンパク質の
非特異的吸着をより抑制するために緩衝液以外の塩を添
加することが好ましい。一例として、例えば１０〜１０
０ｍＭ濃度、より好ましくは５０〜１００ｍＭ濃度とな
るように、塩化ナトリウムや硫酸ナトリウム等を添加す
ることが例示できる。
【００１５】ＲＬＰの分析をリポタンパク質分離用カラ
ムを用いて分析操作を実施した後、該カラム中の抗体に
結合したＲＬＰ以外のリポタンパク質を溶出させる（い
わゆるカラム洗浄作業）という一連の操作を繰り返し実
施することで、多数の検体について、いわゆるル−チン
分析を実現することができる。むろん、カラム中の抗体
のリポタンパク質結合量（バインディングキャパシテ
ィ）が大きい場合、２回以上の操作をカラムを洗浄する
ことなしに実施することも可能である。
ムを用いて分析操作を実施した後、該カラム中の抗体に
結合したＲＬＰ以外のリポタンパク質を溶出させる（い
わゆるカラム洗浄作業）という一連の操作を繰り返し実
施することで、多数の検体について、いわゆるル−チン
分析を実現することができる。むろん、カラム中の抗体
のリポタンパク質結合量（バインディングキャパシテ
ィ）が大きい場合、２回以上の操作をカラムを洗浄する
ことなしに実施することも可能である。
【００１６】上記のような目的でリポタンパク質分離用
カラムを洗浄する場合には、溶離液として例えばぎ酸や
クエン酸等の緩衝液を使用することが例示できるが、こ
れら以外のものであっても前述の性質を有するものであ
れば特に制限はない。これら溶離液は、カラムからリポ
タンパク質を溶出させるのに十分で、かつ、洗浄操作後
の分析操作に先立って、カラムの平衡化が容易に行える
程度の濃度範囲で使用することが好ましいが、このよう
な濃度範囲として５０〜２００ｍＭ、より好ましくは１
００〜１５０ｍＭを例示できる。またそのｐＨは、カラ
ム中の抗体が安定で、かつ、カラムからリポタンパク質
が溶出しやすい範囲とすれば良いが、このようなｐＨ範
囲としてｐＨ２〜３が好ましい。
カラムを洗浄する場合には、溶離液として例えばぎ酸や
クエン酸等の緩衝液を使用することが例示できるが、こ
れら以外のものであっても前述の性質を有するものであ
れば特に制限はない。これら溶離液は、カラムからリポ
タンパク質を溶出させるのに十分で、かつ、洗浄操作後
の分析操作に先立って、カラムの平衡化が容易に行える
程度の濃度範囲で使用することが好ましいが、このよう
な濃度範囲として５０〜２００ｍＭ、より好ましくは１
００〜１５０ｍＭを例示できる。またそのｐＨは、カラ
ム中の抗体が安定で、かつ、カラムからリポタンパク質
が溶出しやすい範囲とすれば良いが、このようなｐＨ範
囲としてｐＨ２〜３が好ましい。
【００１７】以上のような二種類の緩衝液を交互にステ
ップワイズに切り替えて使用することにより、前述のよ
うなル−チン分析を実現することができる。
ップワイズに切り替えて使用することにより、前述のよ
うなル−チン分析を実現することができる。
【００１８】このようにしてリポタンパク質分離用カラ
ムにより分離されなかった画分、すなわち該カラムを素
通りした画分について、続いてＲＬＰのコレステロ−ル
量を分析する。ＲＬＰのコレステロ−ル量の分析は、例
えばコレステロ−ルと反応して光学的に測定可能な信号
を発する酵素と色素の組み合わせを用いて行うことがで
きる。ここでいう光学的に測定可能な信号とは、例えば
蛍光検出器や紫外可視検出器などで測定し得る信号を意
味する。
ムにより分離されなかった画分、すなわち該カラムを素
通りした画分について、続いてＲＬＰのコレステロ−ル
量を分析する。ＲＬＰのコレステロ−ル量の分析は、例
えばコレステロ−ルと反応して光学的に測定可能な信号
を発する酵素と色素の組み合わせを用いて行うことがで
きる。ここでいう光学的に測定可能な信号とは、例えば
蛍光検出器や紫外可視検出器などで測定し得る信号を意
味する。
【００１９】本発明で使用するＲＬＰのコレステロール
と反応する試薬としては、、酵素では、例えばコレステ
ロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及び
パーオキシダーゼを、これら酵素と組み合わせる色素で
は、例えばキノン系色素が挙げられる。キノン系色素と
しては、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−
Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン、４−アミノアンチ
ピリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ
−アニシジン等があげられる。より具体的には、市販の
デタミナ−ＬＴＣ（商品名、協和メデックス（株）製）
や、コレスカラー・リキッド（商品名、東洋紡（株）
製）等が挙げられる。
と反応する試薬としては、、酵素では、例えばコレステ
ロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ及び
パーオキシダーゼを、これら酵素と組み合わせる色素で
は、例えばキノン系色素が挙げられる。キノン系色素と
しては、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−
Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン、４−アミノアンチ
ピリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ
−アニシジン等があげられる。より具体的には、市販の
デタミナ−ＬＴＣ（商品名、協和メデックス（株）製）
や、コレスカラー・リキッド（商品名、東洋紡（株）
製）等が挙げられる。
【００２０】これらの試薬とＲＬＰのコレステロールと
の反応温度は、両者が十分に反応しかつ反応中に酵素が
劣化しない程度の温度で実施することが好ましく、具体
的には３５−５０℃、より好ましくは４５−５０℃とす
ると良い。
の反応温度は、両者が十分に反応しかつ反応中に酵素が
劣化しない程度の温度で実施することが好ましく、具体
的には３５−５０℃、より好ましくは４５−５０℃とす
ると良い。
【００２１】コレステロールの量は、例えば紫外可視検
出器を用いた吸光度測定の場合、コレステロール濃度が
既知の標準血清について同様の操作（測定）を実施した
時の反応生成物の吸光度とコレステロール濃度の関係、
すなわち検量線、と実際に測定された吸光度を比較する
ことで分析できる。なお、キノン系色素の試薬を用いた
場合の紫外可視検出器の測定波長は、５４５−５５５ｎ
ｍとすれば良い。
出器を用いた吸光度測定の場合、コレステロール濃度が
既知の標準血清について同様の操作（測定）を実施した
時の反応生成物の吸光度とコレステロール濃度の関係、
すなわち検量線、と実際に測定された吸光度を比較する
ことで分析できる。なお、キノン系色素の試薬を用いた
場合の紫外可視検出器の測定波長は、５４５−５５５ｎ
ｍとすれば良い。
【００２２】本発明を実施するための装置について、図
１で示した分析装置の一例に基づき具体的に説明する。
１で示した分析装置の一例に基づき具体的に説明する。
【００２３】ヒト血清試料は、一度に多数の検体がセッ
トできる試料注入装置６にセットされる。６から注入さ
れた試料は、高速液体クロマトグラフイー用送液ポンプ
４によつて送液される溶離液槽１の溶離液Ａと共に抗体
カラム７に導入される。抗体カラム７に導入された試料
は、約５分程度でＲＬＰとＲＬＰ以外のリポタンパク質
に分離される。抗体カラム中の抗体と結合しなかったＲ
ＬＰは、送液ポンプ５で送液されるコレステロールとの
反応試薬３と抗体カラム７の出口で混合され、反応オー
ブン８の中の反応コイル９に導入されコイル内で約１分
間反応される。反応生成物の吸光度は紫外可視検出器１
０で測定され、標準血清の検量線からＲＬＰのコレステ
ロール量が算出される。次に、抗体カラム７の充填剤に
結合したＲＬＰ以外のリポタンパク質は、送液ポンプ４
によって送液される溶離液槽２の溶離液Ｂによって溶出
され、抗体カラム７は洗浄される。洗浄終了後、抗体カ
ラム７は溶離液槽１の溶離液Ａで再平衡化され、次の分
析が可能となる。
トできる試料注入装置６にセットされる。６から注入さ
れた試料は、高速液体クロマトグラフイー用送液ポンプ
４によつて送液される溶離液槽１の溶離液Ａと共に抗体
カラム７に導入される。抗体カラム７に導入された試料
は、約５分程度でＲＬＰとＲＬＰ以外のリポタンパク質
に分離される。抗体カラム中の抗体と結合しなかったＲ
ＬＰは、送液ポンプ５で送液されるコレステロールとの
反応試薬３と抗体カラム７の出口で混合され、反応オー
ブン８の中の反応コイル９に導入されコイル内で約１分
間反応される。反応生成物の吸光度は紫外可視検出器１
０で測定され、標準血清の検量線からＲＬＰのコレステ
ロール量が算出される。次に、抗体カラム７の充填剤に
結合したＲＬＰ以外のリポタンパク質は、送液ポンプ４
によって送液される溶離液槽２の溶離液Ｂによって溶出
され、抗体カラム７は洗浄される。洗浄終了後、抗体カ
ラム７は溶離液槽１の溶離液Ａで再平衡化され、次の分
析が可能となる。
【００２４】多量の試料を自動分析する場合は、送液ポ
ンプ４、５の流速、送液ポンプ４の溶離液Ａ、Ｂの切り
替え時間、試料注入装置６の試料注入量及び試料注入順
序、反応オーブン８の反応温度、及び紫外可視検出器１
０の検出波長及び吸光度の測定等の各機器の制御にシス
テム制御装置１１が使用される。さらに、データ処理及
び測定結果の出力もシステム制御装置１１によって行な
われる。
ンプ４、５の流速、送液ポンプ４の溶離液Ａ、Ｂの切り
替え時間、試料注入装置６の試料注入量及び試料注入順
序、反応オーブン８の反応温度、及び紫外可視検出器１
０の検出波長及び吸光度の測定等の各機器の制御にシス
テム制御装置１１が使用される。さらに、データ処理及
び測定結果の出力もシステム制御装置１１によって行な
われる。
【００２５】
【発明の効果】本発明によれば、リポタンパク質分離用
充填剤、該充填剤を充填したリポタンパク質分離用抗体
カラム及び該抗体カラムを使用するＲＬＰの分析方法が
提供される。ＲＬＰ自体は液体クロマトグラフィ−で分
離することができず、このため従来は多数の検体を処理
するのには迅速性等に課題があり、またル−チン分析を
行うには操作性に課題があったにもかかわらず免疫吸着
法で実施されていたＲＬＰ分析が、本発明により、容易
に実施可能となる。
充填剤、該充填剤を充填したリポタンパク質分離用抗体
カラム及び該抗体カラムを使用するＲＬＰの分析方法が
提供される。ＲＬＰ自体は液体クロマトグラフィ−で分
離することができず、このため従来は多数の検体を処理
するのには迅速性等に課題があり、またル−チン分析を
行うには操作性に課題があったにもかかわらず免疫吸着
法で実施されていたＲＬＰ分析が、本発明により、容易
に実施可能となる。
【００２６】特に本発明のＲＬＰの分析方法を液体クロ
マトグラフィ−、より好ましくは高速液体クロマトグラ
フィ−で実施した場合には、迅速性や操作性を大幅に向
上でき、かつ、ル−チン分析も容易に実現できる。
マトグラフィ−、より好ましくは高速液体クロマトグラ
フィ−で実施した場合には、迅速性や操作性を大幅に向
上でき、かつ、ル−チン分析も容易に実現できる。
【００２７】具体的に本発明の分析法では、抗体を固定
化した非多孔性不溶性支持体からなるリポタンパク質分
離用充填剤を充填した抗体カラムにヒト血清試料を付加
してＲＬＰ以外のリポタンパク質を分離し、その後コレ
ステロ−ルの定量作業を行うのみであるから、従来の免
疫吸着法等で必要であった抗体を固定化した不溶性支持
体の懸濁液と試料との振とう混和、上清液の採取等の繁
雑な操作を全く必要とせず、特に好ましく高速液体クロ
マトグラフィ−により実施した場合、１回の分析時間は
約５分、抗体カラムの洗浄、再平衡化のために要する時
間を含めても約１０分程度と、免疫吸着法の約５分の１
で、操作性、迅速性ともに優れている。更に本発明は、
分析システムの各構成機器の使用設定条件を制御できる
システムコントローラ−を使用することにより、分析の
自動化も容易である。
化した非多孔性不溶性支持体からなるリポタンパク質分
離用充填剤を充填した抗体カラムにヒト血清試料を付加
してＲＬＰ以外のリポタンパク質を分離し、その後コレ
ステロ−ルの定量作業を行うのみであるから、従来の免
疫吸着法等で必要であった抗体を固定化した不溶性支持
体の懸濁液と試料との振とう混和、上清液の採取等の繁
雑な操作を全く必要とせず、特に好ましく高速液体クロ
マトグラフィ−により実施した場合、１回の分析時間は
約５分、抗体カラムの洗浄、再平衡化のために要する時
間を含めても約１０分程度と、免疫吸着法の約５分の１
で、操作性、迅速性ともに優れている。更に本発明は、
分析システムの各構成機器の使用設定条件を制御できる
システムコントローラ−を使用することにより、分析の
自動化も容易である。
【００２８】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に詳細に説明
するが、本発明は実施例に必ずしも限定されるものでは
ない。
するが、本発明は実施例に必ずしも限定されるものでは
ない。
【００２９】実施例１ リポタンパク質分離用充填剤の
製造 非多孔性不溶性支持体の合成をモノマ−油滴型重合反応
で実施した。ヒドロキシエチルメタクリレ−ト３００
ｇ、エチレングリコ−ルジメタクリレ−ト６０ｇ、メチ
ルメタクリレ−ト２５ｇ及びｔｅｒｔ−ブチルパ−ピバ
レ−ト８ｇの混合溶液を、Ｎａ2ＳＯ4３０ｇとポリビニ
ルアルコ−ル１７０ｇを溶解した６０℃の水４Ｌ中に攪
拌しながら加えて油滴の粒子が１〜６μｍとなるように
攪拌速度を調節し、６０℃で１２時間重合反応を行っ
た。得られた粒子をガラスフィルタ−上で温水洗浄した
後、分級を行って粒子径３〜４μｍの球状の非多孔性親
水性樹脂約８５ｇを得た。
製造 非多孔性不溶性支持体の合成をモノマ−油滴型重合反応
で実施した。ヒドロキシエチルメタクリレ−ト３００
ｇ、エチレングリコ−ルジメタクリレ−ト６０ｇ、メチ
ルメタクリレ−ト２５ｇ及びｔｅｒｔ−ブチルパ−ピバ
レ−ト８ｇの混合溶液を、Ｎａ2ＳＯ4３０ｇとポリビニ
ルアルコ−ル１７０ｇを溶解した６０℃の水４Ｌ中に攪
拌しながら加えて油滴の粒子が１〜６μｍとなるように
攪拌速度を調節し、６０℃で１２時間重合反応を行っ
た。得られた粒子をガラスフィルタ−上で温水洗浄した
後、分級を行って粒子径３〜４μｍの球状の非多孔性親
水性樹脂約８５ｇを得た。
【００３０】次にこの粒子の８０ｇを２０ｇのＮａＯＨ
を溶解した水１００ｍｌ中によく分散させた後、室温で
エピクロルヒドリン３５ｇを滴下させながら４時間反応
させた。このようにして得られたエポキシ化粒子１ｇ
と、市販の抗ヒトアポＡ−１モノクロ−ナル抗体（ケミ
コン社製、商品名；アポＡ−１モノクロ−ナル抗体）及
び市販の抗ヒトアポＢ−１００モノクロ−ナル抗体（ケ
ミコン社製、商品名；アポＢ−１００モノクロ−ナル抗
体）のそれぞれ１ｍｇを、１Ｍリン酸カルシウム緩衝液
（ｐＨ７）中によく分散させて室温で６時間放置し、抗
体固定化反応（抗体を粒子に吸着させる反応）を行っ
た。反応終了後、反応液中の残存モノクロ−ナル抗体の
吸光度を紫外可視分光光度計で測定した結果、吸光度は
０であった。このことは、モノクロ−ナル抗体の固定化
収率が１００％であったことを示している。
を溶解した水１００ｍｌ中によく分散させた後、室温で
エピクロルヒドリン３５ｇを滴下させながら４時間反応
させた。このようにして得られたエポキシ化粒子１ｇ
と、市販の抗ヒトアポＡ−１モノクロ−ナル抗体（ケミ
コン社製、商品名；アポＡ−１モノクロ−ナル抗体）及
び市販の抗ヒトアポＢ−１００モノクロ−ナル抗体（ケ
ミコン社製、商品名；アポＢ−１００モノクロ−ナル抗
体）のそれぞれ１ｍｇを、１Ｍリン酸カルシウム緩衝液
（ｐＨ７）中によく分散させて室温で６時間放置し、抗
体固定化反応（抗体を粒子に吸着させる反応）を行っ
た。反応終了後、反応液中の残存モノクロ−ナル抗体の
吸光度を紫外可視分光光度計で測定した結果、吸光度は
０であった。このことは、モノクロ−ナル抗体の固定化
収率が１００％であったことを示している。
【００３１】実施例２ リポタンパク質分離用抗体カラ
ムの製造 実施例１のようにして製造したリポタンパク質分離用充
填剤を、内径６ｍｍ、長さ１ｃｍのステンレスカラムに
充填し、リポタンパク質分離用抗体カラムとした。
ムの製造 実施例１のようにして製造したリポタンパク質分離用充
填剤を、内径６ｍｍ、長さ１ｃｍのステンレスカラムに
充填し、リポタンパク質分離用抗体カラムとした。
【００３２】実施例３ ＲＬＰの分析 図１に示した装置により、ＲＬＰの分析を実施した。抗
体カラムは実施例２において製造したものを使用した。
試料注入装置６はＡＳ−８０２０（商品名、東ソー
（株）製）を、紫外可視検出器１０としてはＵＶ−８０
２０（商品名、東ソー（株）製）を用い、検出波長は５
５０ｎｍに設定した。
体カラムは実施例２において製造したものを使用した。
試料注入装置６はＡＳ−８０２０（商品名、東ソー
（株）製）を、紫外可視検出器１０としてはＵＶ−８０
２０（商品名、東ソー（株）製）を用い、検出波長は５
５０ｎｍに設定した。
【００３３】反応オーブン８としてはＣＯ−８０２０
（商品名、東ソー（株）製）を、反応コイル９としては
反応コイルＫ（商品名、東ソー（株）製、内径０. ４ｍ
ｍ、長さ７. ５ｍ）を用い、反応温度は４５℃とした。
（商品名、東ソー（株）製）を、反応コイル９としては
反応コイルＫ（商品名、東ソー（株）製、内径０. ４ｍ
ｍ、長さ７. ５ｍ）を用い、反応温度は４５℃とした。
【００３４】また送液ポンプ５としてはＣＣＰＳ（商品
名、東ソー（株）製）を、送液ポンプ４としてはＣＣＰ
Ｍ−ＩＩ（商品名、東ソー（株）製）を用い、各送液ポ
ンプの流速は送液ポンプ４は溶離液Ａ、Ｂとも０. ８ｍ
ｌ／ｍｉｎ、送液ポンプ５は０. ３ｍｌ／ｍｉｎに設定
した。
名、東ソー（株）製）を、送液ポンプ４としてはＣＣＰ
Ｍ−ＩＩ（商品名、東ソー（株）製）を用い、各送液ポ
ンプの流速は送液ポンプ４は溶離液Ａ、Ｂとも０. ８ｍ
ｌ／ｍｉｎ、送液ポンプ５は０. ３ｍｌ／ｍｉｎに設定
した。
【００３５】溶離液Ａとしては５０ｍＭの硫酸ナトリウ
ムを含むｐＨ７．５の１０ｍＭリン酸緩衝液を、溶離液
Ｂとしては１００ｍＭの硫酸ナトリウムを含むｐＨ２．
０の１００ｍＭクエン酸緩衝液をそれぞれ用いた。コレ
ステロール反応試薬３としては、デタミナ−ＬＴＣ（商
品名、協和メデックス（株）製）を用いた。
ムを含むｐＨ７．５の１０ｍＭリン酸緩衝液を、溶離液
Ｂとしては１００ｍＭの硫酸ナトリウムを含むｐＨ２．
０の１００ｍＭクエン酸緩衝液をそれぞれ用いた。コレ
ステロール反応試薬３としては、デタミナ−ＬＴＣ（商
品名、協和メデックス（株）製）を用いた。
【００３６】試料としては総コレステロールが１８２ｍ
ｇ／ｄｌの血清を５μｌ注入した。図２は、血清中のＲ
ＬＰ以外のリポタンパク質を抗体カラムによって分離し
た後、分離されなかったＲＬＰについてコレステロ−ル
測定を実施して得られたクロマトグラムである。クロマ
トグラムからわかるように、ＲＬＰは約５分で分析され
る。そして、検量線からＲＬＰのコレステロール量を算
出した結果、本発明による方法で得られたＲＬＰのコレ
ステロール値は２６ｍｇ／ｄｌであった。
ｇ／ｄｌの血清を５μｌ注入した。図２は、血清中のＲ
ＬＰ以外のリポタンパク質を抗体カラムによって分離し
た後、分離されなかったＲＬＰについてコレステロ−ル
測定を実施して得られたクロマトグラムである。クロマ
トグラムからわかるように、ＲＬＰは約５分で分析され
る。そして、検量線からＲＬＰのコレステロール量を算
出した結果、本発明による方法で得られたＲＬＰのコレ
ステロール値は２６ｍｇ／ｄｌであった。
【００３７】一方、市販のレムナント用リポ蛋白−コレ
ステロール測定キット、ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩ
ＭＲＯ」（商品名、大塚製薬（株）製）を用いて同一試
料を測定した。
ステロール測定キット、ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩ
ＭＲＯ」（商品名、大塚製薬（株）製）を用いて同一試
料を測定した。
【００３８】まず、キットのＲＬＰ−分画試薬を静かに
よく転倒混和し、均一状態の懸濁液３００μｌを試験管
に採取し、血清５μｌ加えて常温、６０分間振とう混和
反応させた後、静置し、分画した上清を採取した。次
に、上清液の所定量と用時調整したキットのコレステロ
ール反応試薬及びコレステロール標準液を共に市販の自
動分析装置（日立製、生化学自動分析装置７０７０）に
セットし、装置のマニュアルに従ってＲＬＰのコレステ
ロールを測定した。分析時間は約８０分であり、その結
果ＲＬＰのコレステロール値は２７. ２ｍｇ／ｄｌであ
った。
よく転倒混和し、均一状態の懸濁液３００μｌを試験管
に採取し、血清５μｌ加えて常温、６０分間振とう混和
反応させた後、静置し、分画した上清を採取した。次
に、上清液の所定量と用時調整したキットのコレステロ
ール反応試薬及びコレステロール標準液を共に市販の自
動分析装置（日立製、生化学自動分析装置７０７０）に
セットし、装置のマニュアルに従ってＲＬＰのコレステ
ロールを測定した。分析時間は約８０分であり、その結
果ＲＬＰのコレステロール値は２７. ２ｍｇ／ｄｌであ
った。
【図１】図１は、本発明方法を用いた装置の一例を示す
概略図である。
概略図である。
【図２】図２は、実施例３の結果を示すクロマトグラム
である。
である。
１、２ 溶離液槽 ３ コレステロール反応液 ４、５ 送液ポンプ ６ 試料注入装置 ７ 抗体カラム ８ 反応オーブン ９ 反応コイル １０ 紫外可視検出器 １１ システムコントローラー Ａ 溶離液Ａ Ｂ 溶離液Ｂ
Claims (8)
- 【請求項１】非多孔性不溶性支持体に、アポＢ−４８を
認識しない抗ヒトアポＡ−Ｉモノクロ−ナル抗体及びア
ポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＢ−１００モノクロ
−ナル抗体を固定化してなる、リポタンパク質分離用充
填剤。 - 【請求項２】非多孔性不溶性支持体に、アポＢ−４８を
認識しない抗ヒトアポＡ−Ｉモノクロ−ナル抗体及びア
ポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＢ−１００モノクロ
−ナル抗体を固定化したレムナント様リポタンパク質分
離用充填剤を充填してなる、リポタンパク質分離用抗体
カラム。 - 【請求項３】ヒト血清試料中のレムナント様リポタンパ
ク質以外のリポタンパク質を、非多孔性不溶性支持体に
アポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＡ−Ｉモノクロ−
ナル抗体及びアポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＢ−
１００モノクロ−ナル抗体を固定化したリポタンパク質
分離用充填剤を充填してなるリポタンパク質分離用抗体
カラムで分離し、分離されなかったレムナント様リポタ
ンパク質のコレステロ−ル量を分析することからなる、
当該血清試料中のレムナント様リポタンパク質の分析方
法。 - 【請求項４】レムナント様リポタンパク質のコレステロ
−ル量の測定を、コレステロ−ルと反応して光学的に測
定可能な信号を発する酵素と色素の組み合わせを用いて
行うことを特徴とする請求項３のレムナント様リポタン
パク質の分析方法。 - 【請求項５】酵素と色素の組み合わせが、コレステロ−
ルエステラ−ゼ、コレステロ−ルオキシダ−ゼ及びパ−
オキシダ−ゼを含む群から選ばれる酵素の一種以上とキ
ノン系色素の組み合わせであることを特徴とする請求項
４のレムナント様リポタンパク質の分析方法。 - 【請求項６】キノン系色素が、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−
メチルフェニル）−Ｎ´−サクシニルエチレンジアミ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ−ア
ニシジン又は４−アミノアンチピリンである請求項５の
レムナント様リポタンパク質の分析方法。 - 【請求項７】酵素及び色素を、３５〜５０℃の温度条件
下でレムナント様リポタンパク質のコレステロ−ルと反
応させることを特徴とする請求項４のレナント様リポタ
ンパク質の分析方法。 - 【請求項８】酵素及び色素を、４５〜５０℃の温度条件
下でレムナント様リポタンパク質のコレステロ−ルと反
応させることを特徴とする請求項４のレナント様リポタ
ンパク質の分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6215767A JPH08105875A (ja) | 1994-08-12 | 1994-09-09 | リポタンパク質分離用充填剤、その充填剤を充填してなる抗体カラム及びそのカラムを用いたレムナント様リポタンパク質の分析方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6-190510 | 1994-08-12 | ||
| JP19051094 | 1994-08-12 | ||
| JP6215767A JPH08105875A (ja) | 1994-08-12 | 1994-09-09 | リポタンパク質分離用充填剤、その充填剤を充填してなる抗体カラム及びそのカラムを用いたレムナント様リポタンパク質の分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08105875A true JPH08105875A (ja) | 1996-04-23 |
Family
ID=26506137
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6215767A Pending JPH08105875A (ja) | 1994-08-12 | 1994-09-09 | リポタンパク質分離用充填剤、その充填剤を充填してなる抗体カラム及びそのカラムを用いたレムナント様リポタンパク質の分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08105875A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1132482A2 (en) * | 2000-02-28 | 2001-09-12 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method and reagent for determination of cholesterol in remnant-like lipoprotein particles |
| EP1744159A1 (en) * | 2004-03-29 | 2007-01-17 | Shibayagi Co., Ltd. | Method of assaying apolipoprotein b-48 and use thereof |
| CN109187997A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-01-11 | 苏州普瑞斯生物科技有限公司 | 一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒及制备方法 |
-
1994
- 1994-09-09 JP JP6215767A patent/JPH08105875A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1132482A2 (en) * | 2000-02-28 | 2001-09-12 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method and reagent for determination of cholesterol in remnant-like lipoprotein particles |
| EP1132482A3 (en) * | 2000-02-28 | 2001-09-26 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method and reagent for determination of cholesterol in remnant-like lipoprotein particles |
| US7202047B2 (en) | 2000-02-28 | 2007-04-10 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Aqueous method for determining cholesterol in remnant-like particles using cholesterol esterase, phospholipase, surfactant and cholesterol oxidase or dehydrogenase |
| EP1744159A1 (en) * | 2004-03-29 | 2007-01-17 | Shibayagi Co., Ltd. | Method of assaying apolipoprotein b-48 and use thereof |
| EP1744159A4 (en) * | 2004-03-29 | 2007-08-15 | Shibayagi Co Ltd | PROCESS FOR TESTING APOLIPROTEIN B-48 AND USE THEREOF |
| CN109187997A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-01-11 | 苏州普瑞斯生物科技有限公司 | 一种测定脂蛋白残粒胆固醇的浓度的试剂盒及制备方法 |
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