JPH0551396A

JPH0551396A - 糖化アルブミンを分離する方法

Info

Publication number: JPH0551396A
Application number: JP3231045A
Authority: JP
Inventors: Keiko Yasukawa; 恵子安川; Takateru Uchida; 高照内田
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1991-08-20
Filing date: 1991-08-20
Publication date: 1993-03-02

Abstract

(57)【要約】【目的】迅速性、操作性、再現性に優れ、さらには、
自動化が容易で装置が簡素になる糖化アルブミンと非糖
化アルブミンの分離方法を提供する。【構成】液体クロマトグラフィーを用いて血清、血漿
または尿から選ばれたアルブミンを含有する体液中の糖
化アルブミンを分離する方法において、体液中のアルブ
ミン以外の成分中の少なくとも免疫グロブリンＧを固定
相に止め、非糖化アルブミンと糖化アルブミンを溶出し
分離する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、液体クロマトグラフィ
ーを用いて体液中の糖化アルブミンと非糖化アルブミン
を分離する方法に関する。糖尿病のような長期間血糖値
が高値を示す疾患では、さまざまな生体中の蛋白質が非
酵素的に糖化反応を受ける。血清アルブミンもそれらの
蛋白質の一つである。従来、糖尿病の診断には、血糖、
尿糖、インスリン、グルカゴンの測定、経口ブドウ糖負
荷試験等が用いられているが、生理条件あるいは測定方
法により結果が影響され易いとか、被験者にも負担がか
かる等の問題点がある。それに対して生体中の糖化蛋白
質の濃度は、一時的な生理条件の影響が少なく、過去数
週間〜数か月間の血中の平均的糖濃度の指標となるた
め、近年注目されている。例えば、糖化ヘモグロビン
は、過去１〜３か月の血糖値の平均的指標となり、糖尿
病患者の重症度と正の相関があることから、糖尿病の診
断指標、血糖コントロールの指標としてすでに臨床応用
されている。

【０００２】ところが、臨床上は数週間〜一か月程度前
の血糖状態の情報が有用であり、糖化アルブミンはその
半減期が１７日であることから、この要求に最も答え得
る指標として、最近各方面から注目を浴びている。すな
わち、糖化アルブミンは糖化ヘモグロビンと比較する
と、血糖状態に速やかに応答するし、また、血糖値のよ
うに一時的な生理条件の影響を受けて大きく変動するこ
ともない。

【０００３】例えば、糖化アルブミンは現行の、または
新たに変更した食餌療法が、その患者に適当か否かを早
期に判定するのに有効である等、その有用性が示唆され
ている。〔ケイ・エフ・マクファーランド，ダイアベッ
ツ（ Kay F. Mcfarland, DIABETS), 28, 1011, 1979 、
シー・アール・ガスロウ，プロク・ナタル・アカド・サ
イ，ユー・エス・エー（ C. Earl Guthrow et al., Nat
l.Acad. Sci. USA ), 76,No.9, 4258, 1979〕

【０００４】

【従来の技術】従来、糖化アルブミンの分離方法および
検出方法としては、カルボキシメチル型セルロースを固
定相として用いるイオン交換クロマトグラフィー〔ジェ
ームス・エフ・ディ，ジェー・バイオケム ( James F.D
ay, J.Biochem.) 254, No.3, 595, 1979〕、セルロース
等の軟質ゲルにジヒドロキシボロニル基を導入し、この
官能基とグルコースとの相互作用を利用するアフィニテ
ィクロマトグラフィー〔エイ・ケイ・マリア，アナリテ
ィカル・レターズ（ A.K.Mallia, et al., Analytical
Letters ), 14 ( B 8 ), 649, 1981〕等が試みられてい
る。

【０００５】血清、血漿など体液中の糖化アルブミン、
非糖化アルブミンを分離、定量するには、アルブミンと
血清、血漿中のその他の成分、例えば、免疫グロブリン
類（ＩｇＧ、ＩｇＭ等）、ハプトグロビン、トランスフ
ェリン等を分離する必要がある。

【０００６】上記の従来技術は、糖化アルブミンと非糖
化アルブミンの分離は可能であるが、それらと血清、血
漿など体液中のその他の成分との分離はできず、実質的
に体液中の糖化アルブミンと非糖化アルブミンを定量す
ることはできない。イオン交換クロマトグラフィーの場
合には、体液中にプレアルブミン、アルファグロブリン
の一部等アルブミンの等電点に近い物質が多数あるため
であり、アフィニティクロマトグラフィーの場合には、
体液中のアルブミンを除くタンパク質のほとんどが糖タ
ンパク質であるからである。

【０００７】したがって、例えば、アルブミンと親和性
の高い色素チバクロン・ブルー（ Cibacron Blue )Ｆ３
ＧＡ等を結合させたゲルを用いて、体液中からアルブミ
ンのみを単離する前処理が行なわれる〔中山，糖尿病，
25, 963, 1982 〕。しかし、従来の方法は、試料中から
アルブミンを単離した後、一旦クロマトグラフィーの系
外に出し、濃縮後、改めて糖化アルブミンと非糖化アル
ブミンを分離できるカラムに導くという方法がとられて
いたが、煩雑で長時間を要していた。

【０００８】また、アルブミン分離用の第一段カラム
と、糖化アルブミンと非糖化アルブミン分離用の第二段
カラムを切り替えバルブを介して連結し、第一段のカラ
ムで分離したアルブミン分画を流路系外に出すことなく
連続的に第二段カラムに導入し、糖化アルブミンと非糖
化アルブミンを分離する方法も挙げられる〔特開昭６２
−２２６９９９〕。この方法は、分離されたアルブミン
を系外に取り出す必要がなく、簡便で迅速であるが、第
一のカラムでアルブミンとその他の血清タンパク質を分
離した後、アルブミンのみを第二のカラムに導き、その
他の成分は系外に排出するための切り替えバルブが設け
られており、装置が煩雑である。さらに、試料を装置に
注入するだけで自動的に分析するには、バルブの自動切
り替えのためのコントロールシステムも必要になり、高
価になる。また、二本のカラムが必要なので、その点で
もコストがかかる。

【０００９】また、別の方法として、下記のＡ群および
Ｂ群から選ばれた官能基を有する充填剤を用いて、糖化
アルブミンと非糖化アルブミンを分離する方法を挙げる
ことができる（特開昭６４−７８１５４）。Ａ群：ジヒドロキシボロニル基、カルボキシル基、スル
ホン酸基Ｂ群：アミノ基、チバクロンブルーＦ３Ｇ−Ａこの方法は必ずしも切り替えバルブを必要とせず、前述
の方法よりも装置は簡便になるが、糖化アルブミン、非
糖化アルブミンとそれ以外の血清タンパク質を相互に分
離する必要があり、時間がかかる。

【００１０】また、ジヒドロキシボロニル基を結合した
ゲルを用いて糖化タンパク質と非糖化タンパク質を分離
し、それぞれの分画に、例えば、ブロムクレゾールパー
プル、ブロムクレゾールグリーン等のアルブミン発色用
の試薬を添加して、各分画中のアルブミン量を定量する
方法が知られている〔レンデル、クリニ・ケム，（ Ren
dell, Clin. Chem.,) 31, 229, 1985 〕。この方法は、
あらかじめアルブミンとその他のタンパク質を分離する
必要はないが、糖化タンパク質と非糖化タンパク質を分
離した後、試薬を添加する必要があり、煩雑である。ま
た、発色の再現性が不十分で、したがって、再現性が損
なわれる恐れがある。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】前記の従来の技術は、
２つ以上の工程を伴うため煩雑であったり、装置が複雑
で高価であったり、あるいは血清中のタンパク質をお互
いに高度に分離する必要があり、したがって、時間がか
かる等の問題点があった。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の課
題を解決するため鋭意研究の結果、迅速性、操作性、再
現性に優れ、さらには、自動化が容易で装置が簡素にな
る糖化アルブミンと非糖化アルブミンの分離方法を見出
し、本発明を完成するに至った。

【００１３】すなわち、本発明は、液体クロマトグラフ
ィーを用いて血清、血漿または尿から選ばれたアルブミ
ンを含有する体液中の糖化アルブミンを分離する方法に
おいて、少なくとも該体液中に含まれる免疫グロブリン
Ｇ（以下、ＩｇＧと称する）を固定相に止め、非糖化ア
ルブミンと糖化アルブミンを溶出し分離することを特徴
とする、糖化アルブミンの分離方法に関する。本発明に
おいて、糖化アルブミンとはグルコースと共有結合した
アルブミン、非糖化アルブミンとはグルコースと結合し
ていないアルブミンを言う。また、本発明で言うアルブ
ミンとは、糖化アルブミンと非糖化アルブミンの両方を
指す。

【００１４】本発明で言う試料とは、少なくとも糖化ア
ルブミンと非糖化アルブミンのどちらか、もしくはその
両方を含有するもので、例えば、血清、血漿、尿を挙げ
ることができる。

【００１５】本発明においては、糖化アルブミンに対し
て親和性のあるゲル、および少なくともＩｇＧに対して
親和性のあるゲルをカラムに充填して用いる。糖化アル
ブミンに対して親和性のあるゲルとしては、ジヒドロキ
シボロニル基を結合したゲルを挙げることができる。ジ
ヒドロキシボロニル基は糖化アルブミンと非糖化アルブ
ミンの分離に有効である。ジヒドロキシボロニル基の量
は、ゲル重量当たり０．０５〜５．０meq/ｇであり、好
ましくは０．０５〜３．０meq/ｇであり、さらに好まし
くは０．１〜２．０meq/ｇである。ゲルに結合したジヒ
ドロキシボロニル基の量を求める方法としては、例え
ば、特開昭６２−１９２４０５号公報に記載の方法を挙
げることができる。

【００１６】ＩｇＧに対して親和性のあるゲルとして
は、例えば、ＩｇＧに対する抗体あるいはプロテイン
Ｇ、プロテインＡを固定化したゲルを挙げることができ
る。ＩｇＧに対して親和性のある官能基の量は、ゲル重
量当たり０．０５〜１０mg／ｇである。ＩｇＧに対して
親和性のある基の固定化量は、例えば、固定化時に使用
した親和性のある基を有する化合物の量と、固定化後に
反応液に残った該化合物の量の差より求めることができ
る。

【００１７】ジヒドロキシボロニル基とＩｇＧに対して
親和性のある基は、別々のゲルに固定化されていてもよ
いし、同一のゲルに固定化されていもよい。別々のゲル
に固定化されている場合は、ジヒドロキシボロニル基が
固定化されたゲルとＩｇＧに対して親和性のある基を結
合したゲルを混合して、同一のカラムに充填して用いる
方法を挙げることができる。また、それぞれ別々のカラ
ムに充填して連結して用いてもよい。

【００１８】ＩｇＧはアルブミンに次いで血清、血漿中
の含有量が多く、糖化アルブミンの測定において妨害に
なり得るので、なんらかの方法で除くのが望ましい。上
記のゲルを用いることによって、試料の糖化アルブミン
と非糖化アルブミンを溶出し分離することができるが、
さらに好ましくはＩｇＧ以外の免疫グロブリン類、例え
ば、ＩｇＡ、ＩｇＭも分離の妨害になり得るので、それ
ぞれに親和性のあるゲルを同時に用いて、これらの免疫
グロブリン類も同時に固定相に止めるようにするのが好
ましい。また、より好ましくはハプトグロビン、アルフ
ァ２マクログロブリン、アルファ１アンチトリプシン、
トランスェリン、フィブリノーゲンも固定相に止めるよ
うにするのが好ましい。

【００１９】それぞれのタンパク質に親和性のあるゲル
を用いることにより、これらの血中タンパク質を固定相
に止めることができる。それぞれのタンパク質に親和性
のあるゲルとしては、それぞれのタンパク質の抗体を固
定化したゲルを挙げることができる。その場合、それぞ
れの抗体は同一のゲルに固定化されていてもよいし、ま
た、別々のゲルに固定化されていてもよい。これらのア
ルブミン以外のタンパク質に親和性のあるそれぞれの基
の固定化量は、対象とするそれぞれの血中タンパク質の
量によって異なるが、ゲル重量当たり０．０５〜１０mg
／ｇの範囲にあるのが好ましい。

【００２０】ジヒドロキシボロニル基およびアルブミン
以外の試料中タンパク質に対して親和性のある基を導入
する担体としては、例えば、従来、液体クロマトグラフ
ィーに用いられる担体を用いることができるが、機械的
強度、化学的安定性に優れ、本発明の分離に用いる溶離
液になじみやすいという点で、例えば、架橋共重合体重
量当たりアルコール性水酸基０．５〜１０．０meq/ｇ、
比表面積５〜１０００meq/ｇ、保持し得る水の量が０．
５〜８．０meq/ｇである硬質の親水性架橋共重合体（以
下、共重合体と称する）を好ましい例として挙げること
ができる。アルコール性水酸基の量は、さらに好ましく
は１．５〜７．０meq/ｇである。アルコール性水酸基の
量がこの範囲にあることにより、ゲルの適度な親水性を
保つことができる。

【００２１】水酸基の量は、例えば、特開昭５７−３０
９４５号公報に記載の方法で求めることができる。本発
明で用いる共重合体の比表面積（以下、ＳＡと称する）
は、１０００ｍ²／ｇの範囲にある。セファデックス等
の軟質ゲルは、乾燥時にポアが失われるため、１ｍ²／
ｇ以下のＳＡしか示さないが、本発明の共重合体は硬質
で、パーマネントポアを有するため、乾燥時も膨潤時の
状態をほとんど維持する。比表面積は、例えば、特開昭
５７−３０９４５号公報に記載の方法で求めることがで
きる。

【００２２】また、保持し得る水の量（以下、ＷＲと称
する）は、好ましくは０．５〜３．０meq/ｇであり、さ
らに好ましくは１．０〜２．５meq/ｇである。ＷＲは共
重合体内の孔量の目安となる。ＷＲが大きくなると、水
中において共重合体の骨格を形成する部分、すなわち、
共重合体そのものの重量が相対的に低下する。そのため
ＷＲが大きすぎると、水中において共重合体の機械的強
度が低下する。ＷＲが小さすぎると、分離に有効な孔量
が少なくなり好ましくない。ＷＲは、例えば、特開昭５
７−３０９４５号公報に記載の方法で求めることができ
る。

【００２３】本発明で用いる共重合体を形成する全単量
体単位は、下記数１式におけるＸが０．２≦Ｘ≦０．７
の範囲にあるのが好ましい。

【００２４】

【数１】

【００２５】（式中、ａは共重合体中の架橋性単量体単
位を除く単量体単位のモル分率、ｂは架橋性単量体単位
のモル分率、ｎは架橋性単量体１分子が有する重合可能
なビニル基等の官能基の数を表す。）

【００２６】Ｘがこの範囲の共重合体は、高い機械的強
度を示すことができ、例えば、高速液体クロマトグラフ
ィーによって糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離
するのに適している。本発明で用いる共重合体の骨格と
して特に好ましいものとしては、ビニルアルコール単位
がトリアリルイソシアヌレート単位で架橋された重合体
を挙げることができる。

【００２７】該架橋単位で架橋された重合体を、試料中
のＩｇＧ等アルブミン以外のタンパク質を吸着するため
のゲルの担体として用いる場合は、Ｘが０．４０≦Ｘ≦
０．６５の範囲の重合体を好ましい範囲として挙げるこ
とができる。この範囲のゲルは、そのままで免疫グロブ
リン、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭに対する親和性
を示し、これらを吸着することができると同時に、アル
ブミンを溶出することができる。また、Ｘがこの範囲に
ある共重合体は、同様にハプトグロビン、アルファ２マ
クログロブリン、アルファ１アンチトリプシン、フィブ
リノーゲンも同様に吸着することができる。

【００２８】本発明で用いる共重合体は、例えば、特開
昭５７−３０９４５号公報の方法で得ることができる。
上記の担体にジヒドロキシボロニル基を結合する方法と
しては、次の方法を挙げることができる。すなわち、上
記の共重合体とエピハロヒドリン、ビスエポキシド等を
反応させ、エポキシ基含有共重合体を得、ついでメタア
ミノフェニルボロン酸を反応させることによって得るこ
とができる。また、上記の担体にＩｇＧ等に対して親和
性のある基を結合する方法としても、同様の方法を挙げ
ることができる。

【００２９】本発明において用いられるゲルの形状は、
球状、破砕状等種々挙げることができるが、好ましくは
球状である。その場合、重量平均粒径は１〜５００μｍ
であり、好ましくは１〜２０μｍ、さらに好ましくは１
〜１０μｍである。本発明で用いるカラムの形状は特に
限定されないが、好ましくは内径１０mm以下、長さ３０
cmであり、内径２〜８mm、長さ１〜１０cmが特に好まし
い。

【００３０】次に、本発明で用いる移動相について述べ
る。本発明においては、試料中のアルブミン以外のタン
パク質を固定相に止め、アルブミンのみを糖化アルブミ
ンと非糖化アルブミンに分離する。したがって、両方の
目的が同時に達成できる移動相を選択することが重要で
ある。本発明の目的を達成するために、例えば、２種類
の移動相（Ａ液とＢ液）を用意し、途中でＡ液からＢ液
に切り替える方法を好ましい方法として挙げることがで
きる。Ａ液からＢ液への切り替えは、ステップワイズに
行なうこともできるし、連続的に両液の比率を変える、
いわゆるグラジエント法で行なうこともできる。

【００３１】ここで言うＡ液は、試料中のアルブミン以
外のタンパク質を固定相に止め、かつ、糖化アルブミン
と非糖化アルブミンを効果的に分離する機能を有してい
る必要があり、そのようなものとしては、１０〜５００
ｍＭの緩衝用基剤を有し、１，２シスジオールを有する
物質を含有しないｐＨ７．０〜９．５の水溶液を挙げる
ことができる。緩衝用基剤としては、ｐＨ７．０〜９．
５において緩衝能を有する基剤が好ましく、例えば、酢
酸アンモニウム等のアンモニウム塩、モルフォリン、Ｎ
−２エタンスルホン酸、グリシン等を挙げることができ
る。これらの緩衝用基剤は、試料中のアルブミン以外の
タンパク質を固定相に止め、かつ、ジヒドロキシボロニ
ル基と糖化アルブミンなどの糖化タンパク質の糖の部分
の結合を強めることができるため、糖化アルブミン等の
糖化タンパク質と、非糖化タンパク質を高度に分離する
のに有利である。ｐＨが７より低いと、アルブミン以外
のタンパク質を固定相に止めることがうまくいかなくな
る場合があり、また、ジヒドロキシボロニル基とアルブ
ミンの糖鎖との結合が弱くなる。また、ｐＨが９．５よ
り高くなると、アルブミン等のタンパク質が変成し、沈
殿が生ずる恐れがあり、好ましくない。Ａ液のｐＨは好
ましくは７．５〜９．５の範囲である。

【００３２】また、Ａ液は緩衝用基剤以外の塩を含むこ
とができる。特に、二価金属イオンの塩、例えば、塩化
マグネシウム等の塩を含むことにより、アルブミン以外
のタンパク質を固定相に止め、また、糖化アルブミンの
糖鎖とジヒドロキシボロニル基の結合を強め、固定相に
止め、かつ、非糖化アルブミンを溶出させることができ
る。二価金属イオンの塩の濃度は３０ｍＭ〜３００ｍＭ
であり、好ましくは５０ｍＭ〜２５０ｍＭである。一価
金属イオンの塩、例えば、塩化ナトリウム等も含むこと
ができ、その濃度は好ましくは５００ｍＭ以下である。

【００３３】一方、Ｂ液は１０〜５００ｍＭの緩衝用基
剤を有するｐＨ７〜９．５の水溶液が好ましい。その場
合、Ｂ液は１，２シスジオールを有する物質を含んでい
る。緩衝用基剤としては、使用ｐＨで緩衝能を有する緩
衝用基剤が好ましく、例えば、トリスヒドロキシメチル
アミノメタン、トリエタノールアミン等を挙げることが
できる。これらの緩衝用基剤は、ジヒドロキシボロニル
基と糖鎖の結合を弱めることができ、ジヒドロキシボロ
ニル基と結合した糖化タンパク質の溶出を容易にする。
また、グリシン等の緩衝用基剤を用いることもできる。
１，２シスジオールを有する物質としては、例えば、ソ
ルビトール、マニトール等の糖類を挙げることができ
る。１，２シスジオールを有する物質の濃度は、２０〜
１０００ｍＭが好ましい。この条件を用いると、アルブ
ミン以外のタンパク質を固定相に止めたまま、糖化アル
ブミンを溶出させることができる。

【００３４】さらに、Ａ液が二価イオンの塩を含有する
場合は、Ｂ液にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等
の金属キレート剤を添加するのが好ましい。その場合、
金属キレート剤の濃度は５〜１００ｍＭが好ましい。
Ａ，Ｂ両液共に、例えば、エタノール、メタノール、ア
セトニトリルおよびエチレングリコール等の水溶性の有
機溶媒を少量含有していたほうが好ましい場合がある。
その場合、有機溶媒の濃度は特に限定されないが、１０
％以下が好ましい。

【００３５】移動相の通液方法としては、重力を利用し
て移動相を自然落下させる、いわゆるオープンカラム法
を挙げることができるが、迅速性、再現性の点から移動
相をポンプを用いて送液する、いわゆるＨＰＬＣ法を好
ましい方法として挙げることができる。

【００３６】移動相の流量は、０．１〜１０ml／min で
あり、特に好ましくは０．３〜５ml／min である。本発
明においては、カラムから溶出した各フラクションのア
ルブミン濃度を、例えば、紫外吸光光度検出器、蛍光検
出器等を用いて測定することができる。その場合、上記
の光度計を用いて、カラムから溶出した各フラクション
中のアルブミン量をそれぞれ測定することもできるが、
カラムの出口に上記の検出器を連結してカラムからの溶
出液を直接検出器に導入し、各フラクション中のアルブ
ミン量を求める方法を好ましい方法として挙げることが
できる。

【００３７】

【発明の効果】本発明の糖化アルブミンと非糖化アルブ
ミンの分離方法は、液体クロマトグラフィーにおいて、
アルブミンを含有する試料溶液を固定相に接触させ、Ｉ
ｇＧ等のタンパク質を固定相に止め、糖化アルブミンと
非糖化アルブミンを溶出し、分離することを特徴とす
る。従来、アルブミン以外の成分を含む試料から糖化ア
ルブミンと非糖化アルブミンを分離する方法としては、
２本のカラムを用い、前段のカラムでアルブミンと他の
タンパク質を分離し、ついでアルブミンのみを後段のカ
ラムに導入し、糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分
離する方法が挙げられる。しかし、この方法はカラムが
２本必要で、かつ２本のカラムの間に流路切替バルブを
設置する必要があり、システムが煩雑でコストがかか
る。また、別の方法としては、アルブミンと他のタンパ
ク質を分離する官能基と糖化アルブミンと非糖化アルブ
ミンを分離する官能基を有する固定相を用いて、試料中
の糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離する方法が
挙げられる。この方法は、切替バルブが不要であり、上
述の方法よりコストが安いが、多数の成分を分離、溶出
させる必要があるため時間がかかる。

【００３８】一方、本発明の方法によれば、アルブミン
以外のタンパク質は固定相内に止まるため、切替バルブ
を用いてアルブミン以外の成分を系外に排出する必要が
ない。また、アルブミン以外の成分を溶出しないので、
アルブミン以外の成分と糖化アルブミン、非糖化アルブ
ミンを相互に分離する必要がない。したがって、糖化ア
ルブミン、非糖化アルブミンの分離、分析が容易で、か
つ、迅速化が可能である。

【００３９】本発明の方法によれば、一般の臨床検査室
で簡便かつ迅速に、再現性良く、糖化アルブミンと非糖
化アルブミンの分離、分析ができ、また、自動化も可能
であり、その場合は、従来の方法に比べて装置が簡便で
安価になる。したがって、本発明は、糖化アルブミンの
分析の普及に寄与するところ大である。

【００４０】

【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、本発明の範
囲は、これらの実施例に限定されるものではない。実施例１ＩｇＧ等吸着カラムの作成特開昭５７−３０９４５号公報の実施例１に記載のビニ
ルアルコールコポリマーゲル（Ｘ；０．３、水酸基量；
７．８eq／ｇ、ＷＲ；１．７８ｇ／ｇ、ＳＡ；７８ｍ²
／ｇ）１００ｇに、エピクロルヒドリン４７０ｇ、ジメ
チルスルホキシド１０００ml、１０ＮＮａＯＨ５０
mlを加え、３０℃で２０時間反応させた。エポキシの導
入量は１．０meq/ｇであった。

【００４１】次に、上記のエポキシ基含有ゲルを１０等
分し、その一つを０．５ＭＮａ₂ＣＯ₃水溶液１０ml
中に分散し、ついで少量のＮａ₂ＣＯ₃水溶液に溶解し
たプロテインＧを添加し、攪拌しつつ室温で５０時間固
定化反応を行ない、プロテインＧ固定化ゲル（固定化量
３．２mg／ｇ）を得た。同様に残りのエポキシ基含有ゲ
ルを用いて、それぞれＩｇＡ抗体固定化ゲル（同２．４
mg／ｇ）、ＩｇＭ抗体固定化ゲル（同２．０mg／ｇ）、
トランスフェリン抗体固定化ゲル（同２．８mg／ｇ）、
ハプトグロビン抗体固定化ゲル（同１．８mg／ｇ）、ア
ルファ２マクログロブリン抗体固定化ゲル（同１．７mg
／ｇ）、アルファ１アンチトリプシン抗体固定化ゲル
（同３．４mg／ｇ）、アルファ１アシッドグリコプロテ
ィン抗体固定化ゲル（同３．７mg／ｇ）、フィブリノー
ゲン抗体固定化ゲル（同１．９mg／ｇ）を得た。

【００４２】次に、これらのゲルを同量ずつ混合して、
内径７．６mm、長さ５０mmのステンレス製カラムに充填
して、ＩｇＧ等吸着カラムを作成した。

【００４３】ボロニル基固定化カラムの作成アミノフェニルボロニル基固定化ゲルの合成は、特開昭
６２−１９２４０５号公報と同様の方法で行ない、ボロ
ニル基固定化量が０．２８meq/ｇのゲルを得た。このゲ
ルを内径４．６mm、長さ５０mmのステンレス製カラムに
充填した。

【００４４】ＩｇＧ等吸着カラムの試験先に作成したＩｇＧ等吸着カラムを用いて、血清中のタ
ンパク質の吸着試験を実施した。試験の条件を以下に示
す。試料：アルブミン（負荷量３６μｇ）、ＩｇＧ（同１
４μｇ）、ＩｇＡ（同４μｇ）、ＩｇＭ（同２μｇ）、
トランスフェリン（同４μｇ）、ハプトグロビン（同３
μｇ）、アルファ２マクログロブリン（同３μｇ）、ア
ルファ１アンチトリプシン（同４μｇ）、アルファ１ア
シッドグリコプロティン（同２μｇ）以上はいずれもシ
グマ社製移動相：（Ａ液）５０ｍＭ酢酸アンモニウム＋１００ｍ
Ｍ塩化マグネシウム（ｐＨ８．５）（Ｂ液）１００ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタ
ン＋１５０ｍＭソルビトール＋１００ｍＭ塩化ナトリウ
ム＋５０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）システムコントローラ：日本分光工業（株）商品名８
０１−ＳＣポンプ：日本分光工業（株）商品名８８０−ＰＵ（２
台）流量：２．０ml／min 検出器：蛍光検出器日本分光工業（株）商品名８２
０−ＦＰ励起波長：２８０nm 蛍光波長：３４０nm 温度：３５℃

【００４５】上記の装置を用いて、まずＡ液を移動相と
して各試料の吸着試験を実施したところ、アルブミンは
１００％回収された。アルブミン以外のタンパク質はゲ
ルに吸着され、溶出しなかった。また、同様にＢ液を移
動相として各試料の吸着試験を実施したところ、アルブ
ミンは１００％回収された。アルブミン以外のタンパク
質はゲルに吸着され、溶出しなかった。

【００４６】血清中の糖化アルブミンと非糖化アルブミ
ンの分離試験上記のＩｇＧ等吸着カラムとボロニル基固定化カラムを
図１のように連結し、血清中の糖化アルブミンと非糖化
アルブミンの分離試験を行なった。クロマトグラフィー
の条件は、下記の条件を用いた他は実施例１の条件を適
用した。試料：健常人血清および糖尿病患者血清（１μｌ）移動相：（Ａ液）５０ｍＭグリシン＋１００ｍＭ塩化マ
グネシウム（ｐＨ８．５）（Ｂ液）１００ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタ
ン＋１５０ｍＭソルビトール＋１００ｍＭ塩化ナトリウ
ム＋５０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）（注）試料を注入した後、２分後にＡ液からＢ液に切り
替えた。

【００４７】上記の装置および条件を用いて、健常人血
清中の糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離し、得
られたクロマトグラムを図２に示す。また、糖尿病患者
血清中の糖化アルブミンと非糖化アルブミンを分離し、
得られたクロマトグラムを図３に示す。健常人血清に比
べて糖化アルブミンのピークが大きくなっている。

【００４８】なお、健常人を試料とした試験において、
ピークＡ，ピークＢのフラクションをそれぞれ分取し、
二次元電気泳動で調べたところ、いずれのフラクション
においてもアルブミンのみが確認された。また、Ａ，Ｂ
それぞれのピークのフラクションについて、チオバルビ
ツール酸法によって糖の特異発色を行ない、Ｂが糖と結
合したアルブミン、Ａが糖と結合しないアルブミンであ
ることを確認した。

【００４９】実施例２ＩｇＧ等吸着カラムの作成酢酸ビニル１００ｇ、トリアリルイソシアヌレート１４
５ｇ（Ｘ＝０．６）、酢酸ｎブチル１４５ｇ、ｎデカン
２５ｇおよび２，２アゾビスイソブチロニトリル７ｇよ
りなる均一混合液と、少量のポリビニルアルコールおよ
びリン酸ナトリウムを溶解した水１４００mlとを、還流
冷却器、窒素導入管および攪拌器を備えた５Ｌの三つ口
フラスコに入れ、十分攪拌した。次いで、窒素気流下で
攪拌しつつ、６０℃で１６時間重合を行ない、粒状コポ
リマーを得た。該コポリマーを洗浄し、乾燥した。つい
で該コポリマーをカセイソーダ６０ｇを溶解した水３Ｌ
と共に、還流冷却器、窒素導入管および攪拌器を備えた
５Ｌの三つ口フラスコに入れ、窒素気流下１５℃で２０
時間攪拌して、該コポリマーのケン化反応を行なった
後、濾過、水洗、乾燥した。該共重合体の水酸基密度は
２．２meq/ｇ、比表面積は６５ｍ²／ｇであった。つい
で、該コポリマーに実施例１と同様の方法でエポキシ基
を導入した。エポキシ基の量は０．４meq/ｇであった。

【００５０】このエポキシ基含有ゲルに、実施例１と同
様の方法を用いてトランスフェリン抗体を固定化した
（固定化量２．２ｍＭ／ｇ）。ついで該ゲルを内径７．
６mm、長さ５０mmのステンレスカラムに充填してＩｇＧ
等吸着カラムを作成した。

【００５１】血清中の糖化アルブミンと非糖化アルブミ
ンの分離試験上記のＩｇＧ等吸着カラムと実施例１のボロニル基固定
化カラムを図１のように連結し、実施例１と同様の方法
で血清中の糖化アルブミンと非糖化アルブミンの分離試
験を行なった。その結果、得られた健常人血清の糖化ア
ルブミンと非糖化アルブミンの分離クロマトグラムを示
すと、図４のとおりである。

【００５２】なお、ピークＡ、ピークＢのフラクション
をそれぞれ分取し、二次元電気泳動で調べたところ、い
ずれのフラクションにおいてもアルブミンのみが確認さ
れた。また、Ａ、Ｂそれぞれのフラクションについてチ
オバルビツール酸法によって糖の特異発色を行ない、Ｂ
が糖と結合したアルブミン、Ａが糖と結合しないアルブ
ミンであることを確認した。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に用いる高速液体クロマトグラフの説明
図である。

【図２】実施例１において健常人血清から糖化アルブミ
ンと非糖化アルブミンを分離したクロマトグラムであ
る。

【図３】実施例１において糖尿病患者血清から糖化アル
ブミンと非糖化アルブミンを分離したクロマトグラムで
ある。

【図４】実施例２において健常人血清から糖化アルブミ
ンと非糖化アルブミンを分離したクロマトグラムであ
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】液体クロマトグラフィーを用いて血清、
血漿または尿から選ばれたアルブミンを含有する体液中
の糖化アルブミンを分離する方法において、体液中のア
ルブミン以外の成分中少なくとも免疫グロブリンＧを固
定相に止め、非糖化アルブミンと糖化アルブミンを溶出
し分離することを特徴とする、糖化アルブミンを分離す
る方法。