JPH08105876A - レムナント様リポタンパク質の分析方法 - Google Patents
レムナント様リポタンパク質の分析方法Info
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- JPH08105876A JPH08105876A JP21576894A JP21576894A JPH08105876A JP H08105876 A JPH08105876 A JP H08105876A JP 21576894 A JP21576894 A JP 21576894A JP 21576894 A JP21576894 A JP 21576894A JP H08105876 A JPH08105876 A JP H08105876A
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- analyzing
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- lipoprotein
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Abstract
(57)【要約】
【目的】測定操作の繁雑さを改良し、迅速性、操作性か
つ分析の自動化が容易な血清中のレムナント様リポタン
パク質の分析方法を提供する。 【構成】血清試料中のカイロミクロン及び超低比重リポ
タンパク質を液体クロマトグラフィ−で分離し、分離さ
れたカイロミクロンのコレステロ−ル量及び分離された
超低比重リポタンパク質のコレステロ−ル量を分析する
ことからなる、当該血清試料中のレムナント様リポタン
パク質の分析方法により前記目的を達成する。
つ分析の自動化が容易な血清中のレムナント様リポタン
パク質の分析方法を提供する。 【構成】血清試料中のカイロミクロン及び超低比重リポ
タンパク質を液体クロマトグラフィ−で分離し、分離さ
れたカイロミクロンのコレステロ−ル量及び分離された
超低比重リポタンパク質のコレステロ−ル量を分析する
ことからなる、当該血清試料中のレムナント様リポタン
パク質の分析方法により前記目的を達成する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血清試料中のレムナン
ト様リポタンパク質の分析方法に関するものである。
ト様リポタンパク質の分析方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】レムナント様リポタンパク質（ＲＬＰ）
は、カイロミクロン（ＣＭ）や超低比重リポタンパク質
（ＶＬＤＬ）などがリポタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）に
よって分解された異常リポタンパク質で、動脈硬化性疾
患と関連性が高く、心筋梗塞患者の脂質代謝異常の診断
やＩＩＩ型高脂血症の臨床診断に応用されている。
は、カイロミクロン（ＣＭ）や超低比重リポタンパク質
（ＶＬＤＬ）などがリポタンパクリパーゼ（ＬＰＬ）に
よって分解された異常リポタンパク質で、動脈硬化性疾
患と関連性が高く、心筋梗塞患者の脂質代謝異常の診断
やＩＩＩ型高脂血症の臨床診断に応用されている。
【０００３】通常のリポタンパク質は、アポリポタンパ
ク質成分としてアポＡ−ＩまたはアポＢ−１００のいず
れかを有し、アポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＡ−
Ｉモノクローナル抗体又は抗ヒトアポＢ−１００モノク
ローナル抗体のいずれかに反応するが、ＲＬＰはこれら
のどちらの抗体にも反応しないリポタンパク質で、異常
リポタンパク質と考えられている。
ク質成分としてアポＡ−ＩまたはアポＢ−１００のいず
れかを有し、アポＢ−４８を認識しない抗ヒトアポＡ−
Ｉモノクローナル抗体又は抗ヒトアポＢ−１００モノク
ローナル抗体のいずれかに反応するが、ＲＬＰはこれら
のどちらの抗体にも反応しないリポタンパク質で、異常
リポタンパク質と考えられている。
【０００４】従来、ＲＬＰの分析法としては、ＲＬＰに
含まれるコレステロ−ル量を分析することにより実施さ
れている。詳しくは、抗ヒトアポＡ−Ｉ及びＢ−１００
モノクローナル抗体を固定化した不溶性支持体と緩衝液
の懸濁液に、試料を添加しゆっくり振とう混和し、静置
後、抗体と反応しなかったＲＬＰを含む上清液にＲＬＰ
のコレステロール部分に反応する酵素試薬を加え、上清
液中のコレステロールを測定するなどの、抗体を利用し
た分析方法（免疫吸着法）がある。
含まれるコレステロ−ル量を分析することにより実施さ
れている。詳しくは、抗ヒトアポＡ−Ｉ及びＢ−１００
モノクローナル抗体を固定化した不溶性支持体と緩衝液
の懸濁液に、試料を添加しゆっくり振とう混和し、静置
後、抗体と反応しなかったＲＬＰを含む上清液にＲＬＰ
のコレステロール部分に反応する酵素試薬を加え、上清
液中のコレステロールを測定するなどの、抗体を利用し
た分析方法（免疫吸着法）がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従来の免疫吸着法で
は、試料と抗体との抗原抗体反応を不足なく行なうた
め、抗体を固定化した不溶性支持体の懸濁液と試料との
振とう混和に長時間を要するうえ、ＲＬＰを含む上清液
の採取操作や反応試薬を加える操作が繁雑である。この
ため、検体数が多く、かつ、検査に迅速性が要求される
ような臨床検査の現場などでは、ルーチン分析として用
いるのには実用的ではないという課題がある。
は、試料と抗体との抗原抗体反応を不足なく行なうた
め、抗体を固定化した不溶性支持体の懸濁液と試料との
振とう混和に長時間を要するうえ、ＲＬＰを含む上清液
の採取操作や反応試薬を加える操作が繁雑である。この
ため、検体数が多く、かつ、検査に迅速性が要求される
ような臨床検査の現場などでは、ルーチン分析として用
いるのには実用的ではないという課題がある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前述の課
題点を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＣＭのコ
レステロ−ル量とＶＬＤＬのコレステロール量の和が、
免疫吸着法によって測定されるＲＬＰの総コレステロー
ル量と高い相関関係にあることを見出し、本発明を完成
した。
題点を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＣＭのコ
レステロ−ル量とＶＬＤＬのコレステロール量の和が、
免疫吸着法によって測定されるＲＬＰの総コレステロー
ル量と高い相関関係にあることを見出し、本発明を完成
した。
【０００７】即ち本発明は、血清試料中のＣＭ及びＶＬ
ＤＬを液体クロマトグラフィ−で分離し、分離されたＣ
Ｍのコレステロ−ル量及び分離されたＶＬＤＬのコレス
テロ−ル量を分析することからなる、当該血清試料中の
ＲＬＰの分析方法である。以下本発明を詳細に説明す
る。
ＤＬを液体クロマトグラフィ−で分離し、分離されたＣ
Ｍのコレステロ−ル量及び分離されたＶＬＤＬのコレス
テロ−ル量を分析することからなる、当該血清試料中の
ＲＬＰの分析方法である。以下本発明を詳細に説明す
る。
【０００８】実施例に示したように、血清試料中のＲＬ
Ｐの量は、同一試料中のＣＭの量とＶＬＤＬの量との和
と高い相関関係にある。即ち、ＣＭ量とＶＬＤＬ量の和
を示すＣＭのコレステロ−ル量とＶＬＤＬのコレステロ
−ル量の和が、免疫吸着法により測定されたＲＬＰのコ
レステロ−ル量と高い相関関係にあるため、本発明によ
れば、ＣＭの量及びＶＬＤＬの量の和を分析することで
レムナント様リポタンパク質の量を知ることができるの
である。
Ｐの量は、同一試料中のＣＭの量とＶＬＤＬの量との和
と高い相関関係にある。即ち、ＣＭ量とＶＬＤＬ量の和
を示すＣＭのコレステロ−ル量とＶＬＤＬのコレステロ
−ル量の和が、免疫吸着法により測定されたＲＬＰのコ
レステロ−ル量と高い相関関係にあるため、本発明によ
れば、ＣＭの量及びＶＬＤＬの量の和を分析することで
レムナント様リポタンパク質の量を知ることができるの
である。
【０００９】血清試料は、例えば、ヒトの血液から血球
成分などを除去したものが使用されるが、特別の前処理
などは不要である。
成分などを除去したものが使用されるが、特別の前処理
などは不要である。
【００１０】ＣＭ及びＶＬＤＬの液体クロマトグラフィ
−による分離は、操作性や迅速性の向上といった観点か
ら、高速液体クロマトグラフィ−によることが特に好ま
しい。中でも、ゲル濾過用充填剤を充填してなるカラム
を用いて行う高速液体クロマトグラフィ−が特に好まし
い。分離条件に特別の制限はないが、精度の高いＲＬＰ
の分析を行うためには、少なくとも血清中のＣＭ及びＶ
ＬＤＬを、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）や高比重リ
ポタンパク質（ＨＤＬ）から分離し得るものであること
が好ましく、特に好ましい例としてこれらの物質の分子
量の差異を利用するゲル濾過用充填剤を充填してなるカ
ラムを用いて行う高速液体クロマトグラフィ−を例示で
きる。
−による分離は、操作性や迅速性の向上といった観点か
ら、高速液体クロマトグラフィ−によることが特に好ま
しい。中でも、ゲル濾過用充填剤を充填してなるカラム
を用いて行う高速液体クロマトグラフィ−が特に好まし
い。分離条件に特別の制限はないが、精度の高いＲＬＰ
の分析を行うためには、少なくとも血清中のＣＭ及びＶ
ＬＤＬを、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）や高比重リ
ポタンパク質（ＨＤＬ）から分離し得るものであること
が好ましく、特に好ましい例としてこれらの物質の分子
量の差異を利用するゲル濾過用充填剤を充填してなるカ
ラムを用いて行う高速液体クロマトグラフィ−を例示で
きる。
【００１１】特に好ましくゲル濾過用充填剤を充填して
なるカラムを用いて行う高速液体クロマトグラフィ−に
より本発明を実施する場合、充填剤として、血清中のＣ
Ｍ、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及びＨＤＬを容易に分離できる。
ＬＤＬやＨＤＬにはコレステロ−ルが含まれており、こ
れらとＣＭ又はＶＬＤＬの分離が不十分である場合、分
析結果とＲＬＰ量の相関が低下し、分析結果の精度が低
下する恐れがある。
なるカラムを用いて行う高速液体クロマトグラフィ−に
より本発明を実施する場合、充填剤として、血清中のＣ
Ｍ、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及びＨＤＬを容易に分離できる。
ＬＤＬやＨＤＬにはコレステロ−ルが含まれており、こ
れらとＣＭ又はＶＬＤＬの分離が不十分である場合、分
析結果とＲＬＰ量の相関が低下し、分析結果の精度が低
下する恐れがある。
【００１２】ＣＭ、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及びＨＤＬを分離
し得るゲル濾過用充填剤として、８００〜１２００オン
グストロ−ムの平均細孔径を有するものが例示できる。
平均細孔径が８００オングストローム未満の充填剤では
ＣＭやＶＬＤＬなどの分子サイズの大きいリポタンパク
質は細孔内に入り難くなり、一方、平均細孔径が１２０
０オングストロームを超える充填剤では、ＬＤＬやＨＤ
Ｌなどの分子サイズの小さいリポタンパク質の分離が悪
くなる。
し得るゲル濾過用充填剤として、８００〜１２００オン
グストロ−ムの平均細孔径を有するものが例示できる。
平均細孔径が８００オングストローム未満の充填剤では
ＣＭやＶＬＤＬなどの分子サイズの大きいリポタンパク
質は細孔内に入り難くなり、一方、平均細孔径が１２０
０オングストロームを超える充填剤では、ＬＤＬやＨＤ
Ｌなどの分子サイズの小さいリポタンパク質の分離が悪
くなる。
【００１３】特に平均細孔径が９００〜１１００オング
ストロームの充填剤は、血清中のＣＭ、ＶＬＤＬ、ＬＤ
Ｌ及びＨＤＬを良好に分離でき、結果として精度の高い
ＲＬＰの分析を行うことができ、好ましい。
ストロームの充填剤は、血清中のＣＭ、ＶＬＤＬ、ＬＤ
Ｌ及びＨＤＬを良好に分離でき、結果として精度の高い
ＲＬＰの分析を行うことができ、好ましい。
【００１４】以上のような充填剤を充填したカラムを用
いる液体クロマトグラフィ−による分離は、迅速性、操
作性の観点に加え、更に分析の自動化が容易であるとい
う観点で好ましい。特に、ルーチン分析として使用する
には、分析の迅速性が重視されるため、高速液体クロマ
トグラフイ−での測定が好ましいが、この場合、充填剤
は高速液体クロマトグラフイ−での使用に充分耐え得る
機械的強度を有するものを選択する。このような基材と
しては、例えば、シリカゲル、ポリビニルアルコール、
ポリヒドロキシメタクリレート及びその他の親水性樹脂
等を挙げることができる。より具体的には、市販の、親
水性樹脂を基材とする充填剤（ＴＳＫｇｅｌ Ｌｉｐｏ
ｐｒｏｐａｋ、東ソ−（株）製）を例示できる。
いる液体クロマトグラフィ−による分離は、迅速性、操
作性の観点に加え、更に分析の自動化が容易であるとい
う観点で好ましい。特に、ルーチン分析として使用する
には、分析の迅速性が重視されるため、高速液体クロマ
トグラフイ−での測定が好ましいが、この場合、充填剤
は高速液体クロマトグラフイ−での使用に充分耐え得る
機械的強度を有するものを選択する。このような基材と
しては、例えば、シリカゲル、ポリビニルアルコール、
ポリヒドロキシメタクリレート及びその他の親水性樹脂
等を挙げることができる。より具体的には、市販の、親
水性樹脂を基材とする充填剤（ＴＳＫｇｅｌ Ｌｉｐｏ
ｐｒｏｐａｋ、東ソ−（株）製）を例示できる。
【００１５】高速液体クロマトグラフィ−により本発明
を実施する場合、使用する溶離液としてはリン酸緩衝
液、トリス緩衝液、ビス−トリス緩衝液等が挙げられる
が、ＣＭ及びＶＬＤＬを分離できるものであれば特に制
限はない。緩衝液の濃度としては、十分に緩衝能があ
り、かつ後述の酵素試薬とＣＭのコレステロ−ル及びＶ
ＬＤＬのコレステロールとの反応等が阻害される恐れの
ない２０〜２００ｍＭの範囲が好ましいが、特に好まし
くは５０〜１００ｍＭの範囲である。緩衝液のｐＨにつ
いても、後述の酵素試薬とＣＭのコレステロ−ル及びＶ
ＬＤＬのコレステロールとの反応等が阻害される恐れの
ない５〜９の範囲が好ましいが、特に好ましくは７〜８
である。
を実施する場合、使用する溶離液としてはリン酸緩衝
液、トリス緩衝液、ビス−トリス緩衝液等が挙げられる
が、ＣＭ及びＶＬＤＬを分離できるものであれば特に制
限はない。緩衝液の濃度としては、十分に緩衝能があ
り、かつ後述の酵素試薬とＣＭのコレステロ−ル及びＶ
ＬＤＬのコレステロールとの反応等が阻害される恐れの
ない２０〜２００ｍＭの範囲が好ましいが、特に好まし
くは５０〜１００ｍＭの範囲である。緩衝液のｐＨにつ
いても、後述の酵素試薬とＣＭのコレステロ−ル及びＶ
ＬＤＬのコレステロールとの反応等が阻害される恐れの
ない５〜９の範囲が好ましいが、特に好ましくは７〜８
である。
【００１６】分離されたＣＭのコレステロ−ル及びＶＬ
ＤＬのコレステロールを、コレステロ−ルと反応して光
学的に測定可能な信号を発する酵素と色素からなる試薬
と反応させる。ここでいう光学的に測定可能な信号と
は、例えば蛍光検出器や紫外可視検出器などで測定し得
る信号を意味する。本発明で使用するＣＭのコレステロ
−ル及びＶＬＤＬのコレステロールと反応する試薬とし
ては、酵素では、例えばコレステロールエステラーゼ、
コレステロールオキシダーゼ及びパーオキシダーゼを、
これら酵素と組み合わせる色素では、例えばキノン系色
素が挙げられる。キノン系色素としては、Ｎ−エチル−
Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレ
ンジアミン、４−アミノアンチピリン、Ｎ−エチル−Ｎ
−（３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン等があげら
れる。より具体的には、市販のデタミナ−ＬＴＣ（商品
名、協和メデックス（株）製）や、コレスカラー・リキ
ッド（商品名、東洋紡（株）製）等が挙げられる。
ＤＬのコレステロールを、コレステロ−ルと反応して光
学的に測定可能な信号を発する酵素と色素からなる試薬
と反応させる。ここでいう光学的に測定可能な信号と
は、例えば蛍光検出器や紫外可視検出器などで測定し得
る信号を意味する。本発明で使用するＣＭのコレステロ
−ル及びＶＬＤＬのコレステロールと反応する試薬とし
ては、酵素では、例えばコレステロールエステラーゼ、
コレステロールオキシダーゼ及びパーオキシダーゼを、
これら酵素と組み合わせる色素では、例えばキノン系色
素が挙げられる。キノン系色素としては、Ｎ−エチル−
Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレ
ンジアミン、４−アミノアンチピリン、Ｎ−エチル−Ｎ
−（３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン等があげら
れる。より具体的には、市販のデタミナ−ＬＴＣ（商品
名、協和メデックス（株）製）や、コレスカラー・リキ
ッド（商品名、東洋紡（株）製）等が挙げられる。
【００１７】これらの試薬とＣＭのコレステロ−ル及び
ＶＬＤＬのコレステロールとの反応温度は、３５−５０
℃、好ましくは４５−５０℃が良い。反応温度が３５℃
未満では充分な反応が得られず、また５０℃を超えると
反応中に酵素が劣化し充分な反応が得られなくなる恐れ
がある。ＣＭのコレステロ−ル及びＶＬＤＬのコレステ
ロールの量は、例えば紫外可視検出器を用いて吸光度を
測定した場合、コレステロール濃度が既知の標準血清に
ついて同様の操作（測定）を実施した時の反応生成物の
吸光度とコレステロール濃度の関係、すなわち検量線、
と実際に測定された吸光度を比較することで分析でき
る。なお、キノン系色素の試薬を用いた場合の紫外可視
検出器の測定波長は、５４５−５５５ｎｍとすれば良
い。
ＶＬＤＬのコレステロールとの反応温度は、３５−５０
℃、好ましくは４５−５０℃が良い。反応温度が３５℃
未満では充分な反応が得られず、また５０℃を超えると
反応中に酵素が劣化し充分な反応が得られなくなる恐れ
がある。ＣＭのコレステロ−ル及びＶＬＤＬのコレステ
ロールの量は、例えば紫外可視検出器を用いて吸光度を
測定した場合、コレステロール濃度が既知の標準血清に
ついて同様の操作（測定）を実施した時の反応生成物の
吸光度とコレステロール濃度の関係、すなわち検量線、
と実際に測定された吸光度を比較することで分析でき
る。なお、キノン系色素の試薬を用いた場合の紫外可視
検出器の測定波長は、５４５−５５５ｎｍとすれば良
い。
【００１８】本発明を実施するための装置について、図
２で示した分析装置の一例に基づき具体的に説明する。
２で示した分析装置の一例に基づき具体的に説明する。
【００１９】試料は、一度に多数の検体がセットできる
試料注入装置５にセットされる。５から注入された試料
は、高速液体クロマトグラフイー用送液ポンプ３によつ
て送液される溶離液１と共に分離カラム６に導入され
る。分離カラム６に導入された試料は、血清中の各種の
リポタンパク質に約１０分以内で分離される。分離され
た各種のリポタンパク質は、送液ポンプ４で送液される
コレステロールとの反応試薬２と分離カラム６の出口で
混合され、反応オーブン７の中の反応コイル８に導入さ
れコイル内で約１分間反応される。反応生成物の吸光度
は紫外可視検出器９で測定され、免疫吸着法との相関か
らコレステロール量が算出される。また、多量の試料を
自動分析する場合は、送液ポンプ３、４の流速、試料注
入装置５の試料注入量及び試料注入順序、反応オーブン
７の反応温度、及び紫外可視検出器９の検出波長及び吸
光度の測定等の各機器の制御にシステム制御装置１０が
使用される。さらに、データ処理及び測定結果の出力も
システム制御装置１０によって行なわれる。
試料注入装置５にセットされる。５から注入された試料
は、高速液体クロマトグラフイー用送液ポンプ３によつ
て送液される溶離液１と共に分離カラム６に導入され
る。分離カラム６に導入された試料は、血清中の各種の
リポタンパク質に約１０分以内で分離される。分離され
た各種のリポタンパク質は、送液ポンプ４で送液される
コレステロールとの反応試薬２と分離カラム６の出口で
混合され、反応オーブン７の中の反応コイル８に導入さ
れコイル内で約１分間反応される。反応生成物の吸光度
は紫外可視検出器９で測定され、免疫吸着法との相関か
らコレステロール量が算出される。また、多量の試料を
自動分析する場合は、送液ポンプ３、４の流速、試料注
入装置５の試料注入量及び試料注入順序、反応オーブン
７の反応温度、及び紫外可視検出器９の検出波長及び吸
光度の測定等の各機器の制御にシステム制御装置１０が
使用される。さらに、データ処理及び測定結果の出力も
システム制御装置１０によって行なわれる。
【００２０】
【発明の効果】本発明によれば、血清中のＲＬＰ量を、
ＣＭ量及びＶＬＤＬ量の和を分析することで知ることが
できる。ＲＬＰ自体は液体クロマトグラフィ−で分離す
ることができず、このため従来は多数の検体を処理する
には迅速性などに課題があり、またル−チン分析を行う
には操作性に課題があったにもかかわらず免疫吸着法で
実施してきたが、最終的な分析対象物であるＲＬＰを直
接分析することなく、液体クロマトグラフィ−で分離可
能なＣＭ及びＶＬＤＬを分析するのみでＲＬＰ間接的に
分析する本発明によれば、迅速性や操作性を大幅に向上
できる。
ＣＭ量及びＶＬＤＬ量の和を分析することで知ることが
できる。ＲＬＰ自体は液体クロマトグラフィ−で分離す
ることができず、このため従来は多数の検体を処理する
には迅速性などに課題があり、またル−チン分析を行う
には操作性に課題があったにもかかわらず免疫吸着法で
実施してきたが、最終的な分析対象物であるＲＬＰを直
接分析することなく、液体クロマトグラフィ−で分離可
能なＣＭ及びＶＬＤＬを分析するのみでＲＬＰ間接的に
分析する本発明によれば、迅速性や操作性を大幅に向上
できる。
【００２１】具体的に本発明の分析法では、免疫吸着法
で必須の抗体固定化不溶性支持体の懸濁液と試料の振と
う混和、上清液の採取及びコレステロール反応試薬の添
加等の繁雑な操作を全く必要とせず、好ましく高速液体
クロマトグラフィ−により実施した場合、１回の分析時
間も約１０分程度と免疫吸着法の約５分の１で、操作
性、迅速性ともに優れている。更に本発明は、分析シス
テムの各構成機器の使用設定条件を制御できるシステム
コントローラ−を使用することにより、分析の自動化も
容易である。
で必須の抗体固定化不溶性支持体の懸濁液と試料の振と
う混和、上清液の採取及びコレステロール反応試薬の添
加等の繁雑な操作を全く必要とせず、好ましく高速液体
クロマトグラフィ−により実施した場合、１回の分析時
間も約１０分程度と免疫吸着法の約５分の１で、操作
性、迅速性ともに優れている。更に本発明は、分析シス
テムの各構成機器の使用設定条件を制御できるシステム
コントローラ−を使用することにより、分析の自動化も
容易である。
【００２２】なお本発明の方法では、実施例にも示す通
り、前記免疫吸着法の分析結果と高い相関を示す分析結
果を得ることができる。
り、前記免疫吸着法の分析結果と高い相関を示す分析結
果を得ることができる。
【００２３】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に詳細に説明
するが、本発明は実施例に必ずしも限定されるものでは
ない。
するが、本発明は実施例に必ずしも限定されるものでは
ない。
【００２４】実施例１ 図２に示した装置により、レムナント様リポタンパク質
の分析を実施した。分離カラム６としては、ＴＳＫｇｅ
ｌ Ｌｉｐｏｐｒｏｐａｋ（商品名、東ソー（株）製、
内径７. ５ｍｍ、長さ３０ｃｍ）を、試料注入装置５と
してはＡＳ−８０２０（商品名、東ソー（株）製）を、
紫外可視検出器９としてはＵＶ−８０２０（商品名、東
ソー（株）製）を用い、検出波長は５５０ｎｍに設定し
た。
の分析を実施した。分離カラム６としては、ＴＳＫｇｅ
ｌ Ｌｉｐｏｐｒｏｐａｋ（商品名、東ソー（株）製、
内径７. ５ｍｍ、長さ３０ｃｍ）を、試料注入装置５と
してはＡＳ−８０２０（商品名、東ソー（株）製）を、
紫外可視検出器９としてはＵＶ−８０２０（商品名、東
ソー（株）製）を用い、検出波長は５５０ｎｍに設定し
た。
【００２５】反応オーブン７としてはＣＯ−８０２０
（商品名、東ソー（株）製）を、反応コイル８としては
反応コイルＫ（商品名、東ソー（株）製、内径０. ４ｍ
ｍ、長さ７. ５ｍ）を用い、反応温度は４５℃とした。
（商品名、東ソー（株）製）を、反応コイル８としては
反応コイルＫ（商品名、東ソー（株）製、内径０. ４ｍ
ｍ、長さ７. ５ｍ）を用い、反応温度は４５℃とした。
【００２６】また送液ポンプ３としてはＣＣＰＳ（商品
名、東ソー（株）製）を、送液ポンプ４としてはＣＣＰ
Ｍ−ＩＩ（商品名、東ソー（株）製）を用い、各送液ポ
ンプの流速は送液ポンプ３は０. ６ｍｌ／ｍｉｎ、送液
ポンプ４は０. ３ｍｌ／ｍｉｎに設定した。
名、東ソー（株）製）を、送液ポンプ４としてはＣＣＰ
Ｍ−ＩＩ（商品名、東ソー（株）製）を用い、各送液ポ
ンプの流速は送液ポンプ３は０. ６ｍｌ／ｍｉｎ、送液
ポンプ４は０. ３ｍｌ／ｍｉｎに設定した。
【００２７】溶離液１としては、７５ｍＭ トリス緩衝
液（ｐＨ７. ５）を、コレステロール反応試薬２として
は、デタミナ−ＬＴＣ（商品名、協和メデックス（株）
製）を用いた。
液（ｐＨ７. ５）を、コレステロール反応試薬２として
は、デタミナ−ＬＴＣ（商品名、協和メデックス（株）
製）を用いた。
【００２８】試料として、種々の総コレステロール濃度
の血清を５μｌ使用し、本発明の分析方法により試料中
のＣＭのコレステロ−ル量及びＶＬＤＬのコレステロ−
ル量を測定し、その和を試料中のＲＬＰ量とした。
の血清を５μｌ使用し、本発明の分析方法により試料中
のＣＭのコレステロ−ル量及びＶＬＤＬのコレステロ−
ル量を測定し、その和を試料中のＲＬＰ量とした。
【００２９】一方、市販のレムナント用リポ蛋白−コレ
ステロール測定キット、ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩ
ＭＲＯ」（商品名、大塚製薬（株）製）を用い、同一の
血清試料に対する免疫吸着法によるＲＬＰの定量を実施
した。まず、キットのＲＬＰ−分画試薬を静かによく転
倒混和し、均一状態の懸濁液３００μｌを試験管に採取
し、血清５μｌ加えて常温、６０分間振とう混和反応さ
せた後、静置し、分画した上清を採取した。次に、上清
液の所定量と用時調整したキットのコレステロール反応
試薬及びコレステロール標準液を共に市販の生化学自動
分析装置（日立製、生化学自動分析装置７０７０）にセ
ットし、装置のマニュアルに従ってＲＬＰのコレステロ
ールを測定した。分析時間は約８０分であった。
ステロール測定キット、ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩ
ＭＲＯ」（商品名、大塚製薬（株）製）を用い、同一の
血清試料に対する免疫吸着法によるＲＬＰの定量を実施
した。まず、キットのＲＬＰ−分画試薬を静かによく転
倒混和し、均一状態の懸濁液３００μｌを試験管に採取
し、血清５μｌ加えて常温、６０分間振とう混和反応さ
せた後、静置し、分画した上清を採取した。次に、上清
液の所定量と用時調整したキットのコレステロール反応
試薬及びコレステロール標準液を共に市販の生化学自動
分析装置（日立製、生化学自動分析装置７０７０）にセ
ットし、装置のマニュアルに従ってＲＬＰのコレステロ
ールを測定した。分析時間は約８０分であった。
【００３０】結果を図１に示す。図１によれば、免疫吸
着法により測定した試料中のＲＬＰの総コレステロ−ル
量（横軸）は、本発明により測定された試料中のＣＭの
コレステロ−ル量及びＶＬＤＬのコレステロ−ル量の和
と良く相関していることが分かる。
着法により測定した試料中のＲＬＰの総コレステロ−ル
量（横軸）は、本発明により測定された試料中のＣＭの
コレステロ−ル量及びＶＬＤＬのコレステロ−ル量の和
と良く相関していることが分かる。
【００３１】実施例 ２ 図２に示した装置により、レムナント様リポタンパク質
の分析を実施した。分離カラム６としては、ＴＳＫｇｅ
ｌ Ｌｉｐｏｐｒｏｐａｋ（商品名、東ソー（株）製、
内径７. ５ｍｍ、長さ３０ｃｍ）を、試料注入装置５と
してはＡＳ−８０２０（商品名、東ソー（株）製）を、
紫外可視検出器９としてはＵＶ−８０２０（商品名、東
ソー（株）製）を用い、検出波長は５５０ｎｍに設定し
た。
の分析を実施した。分離カラム６としては、ＴＳＫｇｅ
ｌ Ｌｉｐｏｐｒｏｐａｋ（商品名、東ソー（株）製、
内径７. ５ｍｍ、長さ３０ｃｍ）を、試料注入装置５と
してはＡＳ−８０２０（商品名、東ソー（株）製）を、
紫外可視検出器９としてはＵＶ−８０２０（商品名、東
ソー（株）製）を用い、検出波長は５５０ｎｍに設定し
た。
【００３２】反応オーブン７としてはＣＯ−８０２０
（商品名、東ソー（株）製）を、反応コイル８としては
反応コイルＫ（商品名、東ソー（株）製、内径０. ４ｍ
ｍ、長さ７. ５ｍ）を用い、反応温度は４５℃とした。
（商品名、東ソー（株）製）を、反応コイル８としては
反応コイルＫ（商品名、東ソー（株）製、内径０. ４ｍ
ｍ、長さ７. ５ｍ）を用い、反応温度は４５℃とした。
【００３３】また送液ポンプ３としてはＣＣＰＳ（商品
名、東ソー（株）製）を、送液ポンプ４としてはＣＣＰ
Ｍ−ＩＩ（商品名、東ソー（株）製）を用い、各送液ポ
ンプの流速は送液ポンプ３は０. ６ｍｌ／ｍｉｎ、送液
ポンプ４は０. ３ｍｌ／ｍｉｎに設定した。
名、東ソー（株）製）を、送液ポンプ４としてはＣＣＰ
Ｍ−ＩＩ（商品名、東ソー（株）製）を用い、各送液ポ
ンプの流速は送液ポンプ３は０. ６ｍｌ／ｍｉｎ、送液
ポンプ４は０. ３ｍｌ／ｍｉｎに設定した。
【００３４】溶離液１としては、７５ｍＭ トリス緩衝
液（ｐＨ７. ５）を、コレステロール反応試薬２として
は、デタミナ−ＬＴＣ（商品名、協和メデックス（株）
製）を用いた。試料としては、総コレステロールが２３
７ｍｇ／ｄｌの血清を５μｌ注入した。
液（ｐＨ７. ５）を、コレステロール反応試薬２として
は、デタミナ−ＬＴＣ（商品名、協和メデックス（株）
製）を用いた。試料としては、総コレステロールが２３
７ｍｇ／ｄｌの血清を５μｌ注入した。
【００３５】図３は、血清中のリポタンパク質がＣＭ、
ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及びＨＤＬに分離されたクロマトグラ
ムを示すものである。クロマトグラムからわかるように
リポタンパク質は約１０分で分析される。そして、クロ
マトグラムよりＣＭとＶＬＤＬのコレステロール量を求
め前述の相関関係より得られた検量線から、ＲＬＰのコ
レステロールを算出した。その結果、本発明による方法
で得られたＲＬＰのコレステロール値は２６. ７ｍｇ／
ｄｌであった。
ＶＬＤＬ、ＬＤＬ及びＨＤＬに分離されたクロマトグラ
ムを示すものである。クロマトグラムからわかるように
リポタンパク質は約１０分で分析される。そして、クロ
マトグラムよりＣＭとＶＬＤＬのコレステロール量を求
め前述の相関関係より得られた検量線から、ＲＬＰのコ
レステロールを算出した。その結果、本発明による方法
で得られたＲＬＰのコレステロール値は２６. ７ｍｇ／
ｄｌであった。
【００３６】一方、市販のレムナント用リポ蛋白−コレ
ステロール測定キット、ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩ
ＭＲＯ」（商品名、大塚製薬（株）製）を用いて同一試
料中のＲＬＰを免疫吸着法により測定した。
ステロール測定キット、ＲＬＰ−コレステロール「ＪＩ
ＭＲＯ」（商品名、大塚製薬（株）製）を用いて同一試
料中のＲＬＰを免疫吸着法により測定した。
【００３７】まず、キットのＲＬＰ−分画試薬を静かに
よく転倒混和し、均一状態の懸濁液３００μｌを試験管
に採取し、血清５μｌ加えて常温、６０分間振とう混和
反応させた後、静置し、分画した上清を採取した。次
に、上清液の所定量と用時調整したキットのコレステロ
ール反応試薬及びコレステロール標準液を共に市販の生
化学自動分析装置（日立製、生化学自動分析装置７０７
０）にセットし、装置のマニュアルに従ってＲＬＰのコ
レステロールを測定した。分析時間は約８０分であり、
その結果ＲＬＰのコレステロール値は２６. ２ｍｇ／ｄ
ｌであった。
よく転倒混和し、均一状態の懸濁液３００μｌを試験管
に採取し、血清５μｌ加えて常温、６０分間振とう混和
反応させた後、静置し、分画した上清を採取した。次
に、上清液の所定量と用時調整したキットのコレステロ
ール反応試薬及びコレステロール標準液を共に市販の生
化学自動分析装置（日立製、生化学自動分析装置７０７
０）にセットし、装置のマニュアルに従ってＲＬＰのコ
レステロールを測定した。分析時間は約８０分であり、
その結果ＲＬＰのコレステロール値は２６. ２ｍｇ／ｄ
ｌであった。
【００３８】実施例３ 実施例２の記載と同様に、総コレステロールが（１）１
１５. ６ｍｇ／ｄｌ、及び（２）４５２. １ｍｇ／ｄｌ
の血清を分析した。その結果、（１）については２. ０
ｍｇ／ｄｌ、（２）については１０４. ９ｍｇ／ｄｌの
コレステロール値が得られ、分析時間は約２０分であっ
た。実施例２と同様にして、免疫吸着法で同一試料中の
ＲＬＰを測定した結果、（１）については１. ９ｍｇ／
ｄｌ、（２）については１０９. ０ｍｇ／ｄｌの値が得
られた。分析時間は約８５分を要した。
１５. ６ｍｇ／ｄｌ、及び（２）４５２. １ｍｇ／ｄｌ
の血清を分析した。その結果、（１）については２. ０
ｍｇ／ｄｌ、（２）については１０４. ９ｍｇ／ｄｌの
コレステロール値が得られ、分析時間は約２０分であっ
た。実施例２と同様にして、免疫吸着法で同一試料中の
ＲＬＰを測定した結果、（１）については１. ９ｍｇ／
ｄｌ、（２）については１０９. ０ｍｇ／ｄｌの値が得
られた。分析時間は約８５分を要した。
【図１】図１は、縦軸に本発明法で測定した血清中のＣ
Ｍ及びＶＬＤＬのコレステロール量、横軸に免疫吸着法
で測定した血清中のＲＬＰの総コレステロール量をプロ
ットした相関図である。
Ｍ及びＶＬＤＬのコレステロール量、横軸に免疫吸着法
で測定した血清中のＲＬＰの総コレステロール量をプロ
ットした相関図である。
【図２】図２は、本発明方法を用いた装置の一例を示す
概略図である。
概略図である。
【図３】図３は、実施例２の結果を示すクロマトグラム
である。
である。
１ 溶離液 ２ コレステロール反応液 ３ 送液ポンプ ４ 送液ポンプ ５ 試料注入装置 ６ 分離カラム ７ 反応オーブン ８ 反応コイル ９ 紫外可視検出器 １０ システムコントローラー
Claims (10)
- 【請求項１】血清試料中のカイロミクロン及び超低比重
リポタンパク質を液体クロマトグラフィ−で分離し、分
離されたカイロミクロンのコレステロ−ル量及び分離さ
れた超低比重リポタンパク質のコレステロ−ル量を分析
することからなる、当該血清試料中のレムナント様リポ
タンパク質の分析方法。 - 【請求項２】試料がヒト血清試料である請求項１のレム
ナント様リポタンパク質の分析方法。 - 【請求項３】カイロミクロンのコレステロ−ル量及び超
低比重リポタンパク質のコレステロ−ル量の測定を、コ
レステロ−ルと反応して光学的に測定可能な信号を発す
る酵素と色素の組み合わせを用いて行うことを特徴とす
る請求項１のレムナント様リポタンパク質の分析方法。 - 【請求項４】酵素と基質の組み合わせが、コレステロ−
ルエステラ−ゼ、コレステロ−ルオキシダ−ゼ及びパ−
オキシダ−ゼを含む群から選ばれる酵素の一種以上とキ
ノン系色素の組み合わせであることを特徴とする請求項
３のレムナント様リポタンパク質の分析方法。 - 【請求項５】キノン系色素が、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−
メチルフェニル）−Ｎ´−サクシニルエチレンジアミ
ン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−ｍ−ア
ニシジン又は４−アミノアンチピリンである請求項４の
レムナント様リポタンパク質の分析方法。 - 【請求項６】ゲル濾過用充填剤を充填してなるカラムを
用いた液体クロマトグラフィ−により血清試料中のカイ
ロミクロン及び超低比重リポタンパク質を分離し、分離
されたカイロミクロンのコレステロ−ル量及び分離され
た超低比重リポタンパク質のコレステロ−ル量を測定す
ることを特徴とする請求項１のレムナント様リポタンパ
ク質の分析方法。 - 【請求項７】ゲル濾過用充填剤が８００〜１２００オン
グストロ−ムの平均細孔径を有する充填剤であることを
特徴とする請求項６のレムナント様リポタンパク質の分
析方法。 - 【請求項８】ゲル濾過用充填剤が９００〜１１００オン
グストロ−ムの平均細孔径を有する充填剤であることを
特徴とする請求項６のレムナント様リポタンパク質の分
析方法。 - 【請求項９】酵素及び色素を、３５〜５０℃の温度条件
下でカイロミクロンのコレステロ−ル及び超低比重リポ
タンパク質のコレステロ−ルと反応させることを特徴と
する請求項３のレナント様リポタンパク質の分析方法。 - 【請求項１０】酵素及び色素を、４５〜５０℃の温度条
件下でカイロミクロンのコレステロ−ル及び超低比重リ
ポタンパク質のコレステロ−ルと反応させることを特徴
とする請求項３のレナント様リポタンパク質の分析方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21576894A JPH08105876A (ja) | 1994-08-12 | 1994-09-09 | レムナント様リポタンパク質の分析方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19051194 | 1994-08-12 | ||
| JP6-190511 | 1994-08-12 | ||
| JP21576894A JPH08105876A (ja) | 1994-08-12 | 1994-09-09 | レムナント様リポタンパク質の分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08105876A true JPH08105876A (ja) | 1996-04-23 |
Family
ID=26506138
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21576894A Pending JPH08105876A (ja) | 1994-08-12 | 1994-09-09 | レムナント様リポタンパク質の分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08105876A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1132482A2 (en) * | 2000-02-28 | 2001-09-12 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method and reagent for determination of cholesterol in remnant-like lipoprotein particles |
-
1994
- 1994-09-09 JP JP21576894A patent/JPH08105876A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1132482A2 (en) * | 2000-02-28 | 2001-09-12 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method and reagent for determination of cholesterol in remnant-like lipoprotein particles |
| EP1132482A3 (en) * | 2000-02-28 | 2001-09-26 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method and reagent for determination of cholesterol in remnant-like lipoprotein particles |
| US7202047B2 (en) | 2000-02-28 | 2007-04-10 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Aqueous method for determining cholesterol in remnant-like particles using cholesterol esterase, phospholipase, surfactant and cholesterol oxidase or dehydrogenase |
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