WO2012011563A1 - 高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量方法 - Google Patents

高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量方法 Download PDF

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麻衣子 樋口
康樹 伊藤
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デンカ生研株式会社
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol

Definitions

  • the present invention relates to a method for quantifying cholesterol in high-density lipoprotein 3 (hereinafter sometimes referred to as “HDL3”) (cholesterol in HDL3 may also be referred to as “HDL3 cholesterol” hereinafter).
  • HDL3 high-density lipoprotein 3
  • High-density lipoprotein (HDL) cholesterol is related to the removal action of cholesterol accumulated in cells because it receives cholesterol from tissues including arteriosclerotic wall, and is therefore also referred to as a reverse cholesterol transfer system. That there is arteriosclerosis negatively correlated, such as coronary arteriosclerosis is known, it HDL is low value is low value limit is provided as one of dyslipidemia, useful as an indicator of arteriosclerosis It is known that
  • HDL is composed of apoprotein, phospholipid, cholesterol, and neutral fat.
  • 2 HDL3 of a further d 1.063 ⁇ HDL2
  • d 1.125 ⁇ 1.210g / mL is 1.125 g / mL
  • It is classified into two fractions. According to the distribution curve of lipoprotein, a notch is observed at the d 1.125 portion, and a portion with a heavy specific gravity is designated as HDL3.
  • the apolipoprotein E content difference among the apoprotein in HDL also present how divided the subfractions to the HDL lot of the content of apo E and apo E-rich HDL.
  • HDL is not metabolized to LDL or IDL due to CETP deficiency, and the amount of HDL cholesterol increases.
  • HDL increased by CETP deficiency is HDL2.
  • HDL2 is said to have an anti-arteriosclerotic effect.
  • apo E-rich HDL increases due to CETP deficiency, and Apo-E-rich HDL has a strong cholesterol-extracting ability and an antiplatelet action, and is said to be a better one among HDL.
  • HDL3 does not change to HDL2 due to a decrease in hepatic lipase activity, and HDL3 increases.
  • An increase in the incidence of coronary artery disease due to an increase in HDL3 has been suggested. It is expected that measuring each of the HDL subfractions from these tendencies will help determine the presence and cause of arteriosclerosis. Further, based on the functions of these HDL subfractions, development of therapeutic drugs that inhibit the function of CETP, decrease the amount of LDL cholesterol, and increase the amount of HDL cholesterol is being promoted by each manufacturer.
  • Ultracentrifugation is a method of performing fractionation by utilizing the difference in specific gravity of lipoproteins by centrifugation, and has the disadvantages that it requires skill in work, takes days, and is expensive.
  • the method of separating HDL2 and HDL3 using HPLC by Okazaki et al. Requires time and requires special equipment.
  • the HDL3 precipitation method is a method in which other than HDL3 is aggregated with a reagent containing a divalent metal ion and dextran sulfate, and HDL3 in the supernatant is collected by centrifugation and measured with an automatic analyzer.
  • the NMR method is a method of measuring the number of lipoprotein particles by magnetic resonance, but requires a special machine and is not general.
  • Patent Document 2 There is a method for analyzing HDL subfractions (Patent Document 2). Although it can be measured with a general-purpose automatic analyzer, it uses a method that inhibits lipoproteins other than HDL3 from the action of enzymes by using a surfactant, and there is a lipoprotein other than the target in the HDL3 reaction. In other words, if it has an influence on the measurement or if it has not been completely inhibited, there is a risk of measuring lipoproteins other than HDL3.
  • An object of the present invention is to provide a method for quantifying HDL3 in a test sample without requiring complicated operations.
  • the present invention provides a method for quantifying cholesterol in high-density lipoprotein 3 comprising reacting a test sample with a surfactant that specifically reacts with high-density lipoprotein 3 and quantifying cholesterol. .
  • HDL3 cholesterol in a test sample can be specifically quantified with an automatic analyzer without requiring complicated operations such as ultracentrifugation and pretreatment.
  • the amount of HDL2 cholesterol can be quantified by calculating the difference in the amount of HDL3 cholesterol from the amount of total HDL cholesterol obtained by the conventional method for quantifying HDL total cholesterol in a subject.
  • test sample to be subjected to the method of the present invention is not particularly limited as long as it is intended to quantify HDL3 cholesterol in the sample, but is preferably serum or plasma or a dilution thereof, particularly serum. Or a dilution thereof is preferred.
  • a surfactant that reacts specifically with HDL3 is reacted with the test sample.
  • Surfactants that specifically react with HDL3 include nonionic surfactants such as polyoxyethylene distyrenated phenyl ether, polyoxyethylene lauryl ether and P-isooctyl polyoxyethylene phenol formaldehyde polymer; lauryl dimethyl- Mention may be made of amphoteric surfactants such as aminoacetic acid betaines and polyoxyethylene lauryl ethers; and cationic surfactants such as fatty acid phosphates. These surfactants can be used alone or in combination of two or more. Of these, polyoxyethylene lauryl ether is particularly preferable.
  • Emulgen A90 (trade name, manufactured by Kao Corporation, hereinafter, polyoxyethylene distyrenated phenyl ether)
  • the company name is the manufacturing company, and the company name is also the product name.
  • Emulgen 120 (Kao), polyoxyethylene lauryl ether, Triton, P-isooctyl polyoxyethylene phenol formaldehyde polymer -WR-1339 (Nacalai);
  • As amphoteric surfactants Nissan Anon BL-SF (Nippon Yushi), which is lauryl dimethyl-aminoacetic acid betaine, Persoft NK-100 (Nippon Yushi), which is polyoxyethylene lauryl ether; Fatty acid phosphates as ionic surfactants There Adekacol PS-440E (Asahi Denka), and the like.
  • the surfactant when the term “reacts” with respect to a surfactant is used, the surfactant is liable to act on the lipoprotein to bring it out of the reaction system, or to the lipoprotein. This means protecting the enzyme from acting.
  • the concentration of the surfactant is preferably 0.01 to 5.0% (w / v), more preferably 0.05 to 2.0% (w / v).
  • cholesterol is quantified by the reaction of the surfactant.
  • the cholesterol quantification method itself is well known, and any known method can be adopted, and is specifically described in the following examples.
  • ester cholesterol in lipoproteins is hydrolyzed using cholesterol esterase to produce free cholesterol and fatty acids, and the resulting free cholesterol and free cholesterol originally present in lipoproteins using cholesterol oxidase Cholesteinone and hydrogen peroxide are generated and quantified by forming a quinone dye in the presence of peroxidase.
  • Examples of compounds that generate quinone dyes include HDAOS (N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline), DAOS (N-ethyl-N (-2-hydroxy-3-sulfopropyl)) -3, 5-dimethoxyaniline sodium) or TOOS (N-ethyl-N (-2-hydroxy- 3-sulfopropyl) -3-methylaniline sodium dihydrate) and 4-aminoantipyrine. It is not limited to these as long as it is a combination capable of generating a dye.
  • the cholesterol esterase and cholesterol oxidase used in the previous step can be used as they are in the step of the present invention (step of reacting HDL3-specific surfactant). It is not necessary to add a new one.
  • the concentration of the compound that generates a quinone dye is preferably about 0.5 to 2.0 mmol / L for HDAOS, and preferably 0.1 to 2.0 mmol / L for 4-aminoantipyrine,
  • the concentration of peroxidase is preferably 0.4 to 5.0 U / mL.
  • sodium azide which is an inhibitor of catalase, is used and added to the reaction solution in the second step.
  • the concentration of sodium azide is usually about 0.1 g / L to 1.0 g / L.
  • a buffer solution of Good, Tris, phosphate and glycine is preferable.
  • Good buffer solutions such as bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxyethyl) methane (Bis-Tris), piperazine-1, 4-bis (2 -Ethanesulfonic acid (PIPES), piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid), 1.5 sodium salt, monohydrate (PIPES1.5Na), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPSO), N N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES) and piperazine-1,4- Bis (2-hydroxy-3-propanesulfonic acid) (POPSO) is
  • the reaction temperature is preferably about 25 to 40 ° C, more preferably 35 to 38 ° C, and most preferably 37 ° C.
  • the reaction time is not particularly limited, and is usually about 2 to 10 minutes.
  • the method of the present invention can be carried out by reacting the above-mentioned surfactant as it is to the test sample, but the previous step of transferring cholesterol other than cholesterol in HDL or HDL3 to the outside of the reaction system is performed first, It is preferable to perform the above-described method of the present invention on the sample after the previous step because HDL3 cholesterol can be quantified more accurately.
  • the pre-process is preferably performed in the presence of a surfactant that reacts with lipoproteins other than HDL or a surfactant that reacts with lipoproteins other than HDL3.
  • surfactants that react with lipoproteins other than HDL include anionic surfactants such as polyoxyethylene-polyoxypropylene condensate, polyoxyethylene alkyl ether sodium amide nonion, polyoxyethylene nonylphenyl ether and amide nonion And / or nonionic surfactants such as polyoxyethylene polycyclic phenyl ethers having an HLB value of 14 to 17. These surfactants can be used alone or in combination of two or more.
  • Pluronic, Pluronic P123 (Asahi Denka) Pluronic F88 (Asahi Denka), defendol WX (Kao) Nonion HS220 (Nippon Yushi), Nymid MT-215 (Nippon Yushi), Newcol-723 (Nippon Yushi), Newcol-2614 (Japanese emulsifier) and Newcol-714 (Japanese emulsifier) can be mentioned.
  • Surfactants that react with lipoproteins other than HDL3 include nonionic surfactants such as polyoxyethylene distyrenated phenyl ether; polyoxyethylene-polyoxypropylene condensates, amide ether sulfates and polyoxyethylene-stearylamine
  • Anionic surfactants such as coconut oil fatty acid-amidopropyldimethyl-aminoacetic acid betaine, alkyldimethyl-aminoacetic acid betaine and lauryl betaine; and cationic surfactants such as lauryltrimethylammonium chloride It can be mentioned, but is not limited to these.
  • the nonionic surfactant Emulgen A500 (trade name polyoxyethylene distyrenated phenyl ether, manufactured by Kao Corporation, hereinafter, the company name is the manufacturing company, the company name is also shown All are trade names);
  • As anions polyoxyethylene-polyoxypropylene condensate, Pluronic F127 (Asahi Denka), Pluronic F68 (Asahi Denka) Pluronic P103 (Asahi Denka), Sanamide, an amide ether sulfate CF-10 (Japanese fats and oils), polyoxyethylene-stearylamine, Niimine S210 (Japanese fats and oils); as amphoteric surfactants, coconut oil fatty acid-amidopropyldimethyl-aminoacetic acid betaine, Nissan Anon BDF-SF (Japanese fats and oils) ), Alkyldimethyl-aminoacetic acid solid A down NISSANANON BF (NOF), Amphi
  • the concentration of the surfactant used in the previous step is preferably 0.01 to 5.0% by weight, more preferably about 0.03 to 3.0% by weight.
  • cholesterol is transferred out of the reaction system in response to the reaction of the surfactant.
  • transferring out of the reaction system means eliminating or protecting cholesterol and its ester so that cholesterol and its ester are not involved in the subsequent steps.
  • erasing means degrading the cholesterol of lipoprotein in the test sample so that it does not act on the cholesterol measurement reaction in the subsequent steps.
  • the hydrogen peroxide generated by the action of cholesterol esterase and cholesterol oxidase to decompose the like into water and oxygen using catalase.
  • the hydrogen donor and the generated hydrogen peroxide may be reacted with peroxidase to convert to colorless quinone, but is not limited thereto.
  • the method of eliminating cholesterol itself is well known in this field, and is specifically described in the following examples.
  • “Protection” refers to protecting the lipoprotein in the test sample so that it does not react with cholesterol measurement in the subsequent steps.
  • To protect lipoproteins there is a method using a surfactant that specifically protects each lipoprotein so that cholesterol esterase and cholesterol oxidase do not act, but it is not limited thereto.
  • phospholipase and sphingomyelinase act on lipoproteins but hardly act on HDL3. Therefore, in addition to the above-mentioned surfactant, phospholipase and / or sphingomyelinase (hereinafter, both may be collectively referred to as “phospholipase etc.”) can be used to make HDL3 cholesterol more accurate. It is preferable because it can be quantitatively determined.
  • the phospholipase is not particularly limited as long as it acts on phosphatidylcholine, and phospholipase A, phospholipase C and phospholipase D are preferable, and phospholipase C and phospholipase D are particularly preferable. Since phospholipase etc. are marketed, a commercial item can be used preferably. Phospholipases and the like can be used alone or in combination of two or more.
  • the final concentration of phospholipase or the like (when two or more types are used, the total concentration, the same shall apply hereinafter) is preferably about 0.1 to 100 U / mL, more preferably about 0.2 to 50 U / mL.
  • reaction conditions reaction temperature, time, buffer solution, etc.
  • an enzyme system or a surfactant for transferring cholesterol to the outside of the reaction system is added at the same time, so that both steps can be performed simultaneously as a single step.
  • Different surfactants are used in the first step and the second step.
  • the concentration of cholesterol esterase (in the present specification, the concentration means the final concentration unless otherwise specified) is preferably about 0.1 to 10.0 U / mL, About 0.2 to 2.0 U / mL is more preferable.
  • the concentration of cholesterol oxidase is preferably about 0.05 to 10.0 U / mL, more preferably about 0.1 to 1.0 U / mL.
  • the cholesterol esterase is not particularly limited as long as it acts on ester-type cholesterol.
  • cholesterol esterase COE-311, manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • COE-312 cholesterol esterase
  • COE-311 cholesterol esterase
  • COE-312 cholesterol esterase
  • the cholesterol oxidase is not particularly limited as long as it acts on free cholesterol.
  • cholesterol oxidase (CONII) manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd. or cholesterol oxidase (COO-311, COO- 321 and COO-331) can be used.
  • the concentration of peroxidase is preferably about 2.0 to 5.0 units / mL, more preferably about 3.0 to 4.0 units / mL.
  • the concentration is preferably about 0.4 to 0.8 mm 0 l / L.
  • reaction temperature reaction temperature, reaction time, buffer solution, etc.
  • reaction temperature reaction temperature, reaction time, buffer solution, etc.
  • Reagent A and reagent B having the following reagent composition were prepared, and reagents in which various surfactants were added to reagent A at a concentration of 0.1% (w / v) or 1.0% (W / V) were prepared.
  • the following reagents A and B containing various surfactants are mixed at a ratio of 1: 3, the HDL2 fraction and the cholesterol in the HDL3 fraction are reacted, and the final absorbance at a main wavelength of 700 nm and a subwavelength of 600 nm is obtained. Measured and compared.
  • HDL2 fraction and HDL3 fraction were fractionated as follows. Using a test sample containing HDL, that is, a solution containing sodium chloride and sodium bromide in serum, the sample was fractionated by ultracentrifugation so as to separate at the specific gravity (1.125) at the boundary between HDL2 and HDL3. Minutes were collected.
  • a test sample containing HDL that is, a solution containing sodium chloride and sodium bromide in serum
  • Table 1 at a rate of HDL2 / HDL3 is 0.75 or less, showed a surfactant CM ⁇ IDL / HDL3, LDL / HDL3 is 0.75 or less, and a surfactant that reacts them in HDL3 To do.
  • Table 2 shows surfactants having a HDL2 / HDL3 ratio of 1.25 or more and CM to IDL / HDL2 and LDL / HDL2 ratios of 1.25 or more. These surfactants react with those other than HDL3. Use as an agent.
  • Table 3 shows an interface where the ratio of HDL2 / HDL3 is between 0.75 and 1.25 and the ratio of CM to IDL / HDL2, LDL / HDL2, CM to IDL / HDL3, and LDL / HDL3 is 0.75 or less.
  • Indicate active agents which are surfactants that react to HDL.
  • Table 4 shows an interface in which the ratio of HDL2 / HDL3 is between 0.75 and 1.25 and the ratio of CM to IDL / HDL2, LDL / HDL2, CM to IDL / HDL3, and LDL / HDL3 is 0.75 or more.
  • Indicate active agents which are surfactants that react with all lipoproteins.
  • Table 5 shows surfactants not applicable to the above, and these are surfactants that react in addition to HDL.
  • BES buffer 100 mmol / L HDAOS 0.7mmol / L Catalase 600U / L Cholesterol oxidase 1.4U / mL Cholesterol esterase 0.8U / mL
  • Reagent B BES buffer (pH 6.6) 100 mmol / L Sodium azide 0.1% 4-aminoantipyrine 4.0 mmol / L Peroxidase 2.4 U / mL
  • Emulgen A90, Emulgen 120, Nissan Anon BL-SF, Triton-WR-1339, Persoft NK-100 and Adecatol PS440E were surfactants that specifically react with HDL3.
  • Emulgen A500, Nissan Anon BDF-SF, Nissan Anon BF, Naimine S210, Pluronic P103, Cotamine 24P, Sanamide CF-10, Amphithol 24B, Pluronic F68, and Pluronic F127 were surfactants that react in addition to HDL3.
  • Emulgen B66, Emulgen A60, Emulgen LS110, Nowol610, Newcol2609, Newcol-CMP-11, Nissan Anon GLM-RLV, and Newcol-710 were surfactants that specifically react with HDL.
  • Emulgen 108, Emulgen 707, Newcol 707, Adekatol LB83, Adekatol LB103, and Emulgen 909 were surfactants that specifically react with all lipoproteins.
  • Newcol-714, Newcol-723, Newcol2614, Naimine S215, Pluronic P123, Letol WX, Nymid MT215, Nonion HS220 and Pluronic F88 were surfactants that specifically react in addition to HDL.
  • Example 1 The CM to LDL fraction, the HDL2 fraction, and the HDL3 fraction were fractionated using ultracentrifugation, reacted with the following reagent J, and further added with the following reagent K for measurement.
  • 150 ⁇ L of reagent E was added to 2 ⁇ L of serum, and after 5 minutes of warming reaction, reagent K was added and further heated for 5 minutes, and the absorbance at the main wavelength of 700 nm and the sub wavelength of 600 nm was measured.
  • Reagent J BES buffer (pH 7.0) 100 mmol / L HDAOS 0.7mmol / L Pluronic P103 0.03 w / v% Catalase 600U / L Cholesterol oxidase 1.4U / mL Cholesterol esterase 0.8U / mL Phospholipase D 5.0 U / mL
  • Reagent K BES buffer (pH 6.6) 100 mmol / L Sodium azide 0.1% Emulgen 120 1.0% 4-aminoantipyrine 4.0 mmol / L Peroxidase 2.4 U / mL
  • FIG. 1 shows the results of changes in absorbance over time in each fraction after the addition of reagent K. It can be seen that it reacts specifically to HDL3.

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Abstract

要約　煩雑な操作を必要とすることなく、被検試料中の高密度リポタンパク質３(HDL3)中のコレステロールを定量する方法が開示されている。HDL3中のコレステロールの定量方法は、被検試料に高密度リポタンパク質３と特異的に反応する界面活性剤を反応させ、コレステロールを定量することを含む。被検試料中のＨＤＬ３コレステロールを、超遠心や前処理といった煩雑な作業を必要とせずに自動分析装置で特異的に定量することが可能となった。また、従来技術である被検体中ＨＤＬ総コレステロール定量法により得られた総ＨＤＬコレステロール量よりＨＤＬ３コレステロール量の差を算出することによりＨＤＬ２コレステロール量を定量することも可能となった。

Description

高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量方法
　本発明は、高密度リポタンパク質３（以下、「HDL3」と呼ぶことがある）中のコレステロール（HDL3中のコレステロールを以下、「HDL3コレステロール」と呼ぶことがある）の定量方法に関する。
　高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）コレステロールは動脈硬化壁を含めた各組織からコレステロールを受け取るため細胞内に蓄積したコレステロールの除去作用に関係し、そのためコレステロール逆転送系ともいわれている。冠動脈硬化などの動脈硬化疾患と負の相関があることが知られており、ＨＤＬが低値であることは脂質異常症の一つとして低値限界が設けられており、動脈硬化の指標として有用であることが知られている。
　ＨＤＬはアポタンパク質とリン脂質、コレステロール、中性脂肪から構成されている。ＨＤＬは比重がｄ＝１．０６３～１．２１０ｇ／ｍＬであり、さらにｄ＝１．０６３～１．１２５ｇ／ｍＬであるＨＤＬ２とｄ＝１．１２５～１．２１０ｇ／ｍＬであるＨＤＬ３の２つの分画に分類される。リポ蛋白の分布曲線によりｄ＝１．１２５部分にノッチが認められ、ここから比重の重い部分をＨＤＬ３とされる。また、ＨＤＬ中のアポタンパク質のうちアポリポ蛋白Ｅ含有量差から、アポＥの含有量の多いＨＤＬをアポＥ－ｒｉｃｈ　ＨＤＬとする亜分画の分け方も存在する。
　従来までのＨＤＬ蛋白全体だけではなく、ＨＤＬ２およびＨＤＬ３それぞれの亜分画において異なった働きを示すことが知られている。臨床において、ＣＥＴＰ欠損によりＨＤＬがＬＤＬやＩＤＬに代謝されず、ＨＤＬコレステロール量が増加することが知られている。ＣＥＴＰ欠損により増加したＨＤＬはＨＤＬ２である。ＨＤＬ２には抗動脈硬化作用があると言われている。また、ＣＥＴＰ欠損によりアポＥ－ｒｉｃｈ　ＨＤＬが上昇するとも言われており、Ａｐｏ－Ｅ―ｒｉｃｈｉ　ＨＤＬはコレステロール引き抜き能が強く抗血小板作用があり、ＨＤＬの中でもより善玉であるとも言われている。また、肝性リパーゼ活性の低下によりＨＤＬ３がＨＤＬ２に変化せず、ＨＤＬ３が増加する。ＨＤＬ３の増加による冠動脈疾患の発症率の増加が示唆されている。これらの傾向からＨＤＬ亜分画それぞれを測定することは、動脈硬化疾患の有無や原因を判断する助けとなることが予想される。また、現在、これらＨＤＬ亜分画の働きを踏まえ、ＣＥＴＰの働きを阻害し、ＬＤＬコレステロール量を減少させ、ＨＤＬコレステロール量を増加させる治療薬の開発が各メーカーで進められている。
　ＨＤＬ亜分画の簡便な測定方法を確立することは詳細な働きの解明や、これらの治療の効果やへと繋がる可能性がある。
　現在までにＨＤＬ亜分画の測定法として知られているものとしては、超遠心法、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法、ＨＤＬ３沈殿法（特許文献１）、ＮＭＲ法、などが知られている。
　超遠心は遠心によりリポ蛋白の比重の差を利用して画分する方法であり、作業に熟練が必要なこと、日数がかかること、また費用も高額となる欠点がある。岡崎らによるＨＰＬＣを用いたＨＤＬ２とＨＤＬ３とを分ける方法では、作業に時間を要し、特別な機器が必要である。ＨＤＬ３沈殿法は２価金属イオンおよびデキストラン硫酸を含む試薬によりＨＤＬ３以外を凝集させ、遠心により上清部分のＨＤＬ３を回収し自動分析装置で測定する方法である。やはり、作業に熟練が必要であること、また用手法であり検体の前処理操作が必要であることもあり、測定までにある程度の時間がかかるといった欠点があり、汎用的ではなかった。また、ＮＭＲ法は磁気共鳴によりリポ蛋白の粒子数を計測する方法であるが、特殊な機械が必要であり、一般的ではない。
　なお、ＨＤＬ亜画分の分析方法(特許文献２)が存在する。汎用自動分析装置により測定が可能であるが、界面活性剤を使用することによりＨＤＬ３以外のリポ蛋白を酵素の作用から阻害する方法を用いており、ＨＤＬ３反応中において、目的以外のリポ蛋白質が存在していることなり、測定への影響、もしくは、阻害しきれなかった場合は、ＨＤＬ３以外のリポ蛋白を測りこむ恐れがある。
　このような方法に変わり、簡便でかつコレステロール量をより選択的に定量できる試薬の発明が必要とされている。
特開２００９－２０７４６３号公報 特開２００１－３４６５９８号公報
　本発明の目的は、煩雑な操作を必要とすることなく、被検試料中のHDL3を定量する方法を提供することである。
　本願発明者らは、鋭意研究の結果、高密度リポタンパク質３と特異的に反応する界面活性剤を見出した。そして、被検試料にこのような界面活性剤を反応させ、コレステロールを定量することにより被検試料中のHDL3コレステロールが定量可能であることに想到し、これが可能であることを実験的に確認して本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、被検試料に高密度リポタンパク質３と特異的に反応する界面活性剤を反応させ、コレステロールを定量することを含む、高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量方法を提供する。
　本発明により、被検試料中のＨＤＬ３コレステロールを、超遠心や前処理といった煩雑な作業を必要とせずに自動分析装置で特異的に定量することが可能となった。また、従来技術である被検体中ＨＤＬ総コレステロール定量法により得られた総ＨＤＬコレステロール量よりＨＤＬ３コレステロール量の差を算出することによりＨＤＬ２コレステロール量を定量することも可能となった。
本発明の実施例において行った、試薬Ｋを添加してからの各分画の吸光度変化の結果を示す図である。
　本発明の方法に供される被検試料としては、その試料中のHDL3コレステロールを定量しようとするものであれば特に限定されないが、好ましくは、血清若しくは血漿又はこれらの希釈物であり、特に血清又はその希釈物が好ましい。
　本発明の方法では、被検試料にHDL3と特異的に反応する（HDL3以外のリポタンパク質とはほとんど反応しない）界面活性剤を反応させる。HDL3と特異的に反応する界面活性剤としては、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル及びＰ－イソオクチルポリオキシエチレンフェノールホルムアルデヒドポリマーのような非イオン界面活性剤；ラウリルジメチル－アミノ酢酸ベタイン及びポリオキシエチレンラウリルエーテルのような両性界面活性剤；並びに脂肪酸族リン酸エステルのような陽イオン界面活性剤を挙げることができる。これらの界面活性剤は、単独で用いることもできるし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。これらのうち、特にポリオキシエチレンラウリルエーテルが好ましい。
　より具体的には、ＨＤＬ３に特異的に反応する界面活性剤の例としては、非イオン界面活性剤として、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルであるエマルゲンＡ９０（商品名、花王社製、以下、会社名は製造会社であり、会社名が併記されているものは全て商品名である）、ポリオキシエチレンラウリルエーテルであるエマルゲン１２０（花王）、Ｐ－イソオクチルポリオキシエチレンフェノールホルムアルデヒドポリマーであるＴｒｉｔｏｎ－ＷＲ－１３３９（ナカライ）；両性界面活性剤として、ラウリルジメチル－アミノ酢酸ベタインであるニッサンアノンＢＬ－ＳＦ（日本油脂）、ポリオキシエチレンラウリルエーテルであるパーソフトＮＫ－１００（日本油脂）；陽イオン界面活性剤として脂肪酸族リン酸エステルであるアデカコールＰＳ－４４０Ｅ（旭電化）が挙げられる。
　本発明中において界面活性剤に対して「反応する」という言葉を用いる場合は、界面活性剤がリポ蛋白質に対して、反応系外に導くために酵素が作用しやすくする、もしくはリポ蛋白に対して酵素が作用できないよう保護することを意味する。
　界面活性剤の濃度は０．０１～５.０％（ｗ／ｖ）が好ましく、さらには０．０５～２．０％（ｗ／ｖ）が好ましい。
　本発明の方法においては、上記界面活性剤の反応によりコレステロールを定量する。コレステロールの定量方法自体は周知であり、周知のいずれの方法をも採用することができ、下記実施例にも具体的に記載されている。例えば、リポ蛋白中のエステル型コレステロールにコレステロールエステラーゼを用いて加水分解し、遊離型コレステロールと脂肪酸が生じ、生じた遊離型コレステロールと元来リポ蛋白中に存在する遊離コレステロールとをコレステロールオキシダーゼを用いてコレステノンと過酸化水素を発生させ、これをペルオキシダーゼの存在下でキノン色素を形成させ定量する。キノン色素を発生させる化合物として、例えばＨＤＡＯＳ(N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル）-3,5-ジメトキシアニリン）、ＤＡＯＳ(N-エチル-N(-2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3, 5-ジメトキシアニリンナトリウム)又はＴＯＯＳ(N-エチル-N(-2-ヒドロキシ- 3-スルホプロピル)-3-メチルアニリンナトリウム二水和物）と４－アミノアンチピリンが挙げられるが、キノン色素を発生させることができる組み合わせであればこれらに限定されるものではない。後述する前工程でコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを用いる場合には、本発明の工程（HDL3特異的界面活性剤を反応させる工程）では、前工程で用いたコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼをそのまま用いることができ、新たに添加する必要はない。
　キノン色素を発生させる化合物の濃度は、例えば、ＨＤＡＯＳであれば濃度は０．５～２．０ｍｍｏｌ／Ｌ程度が好ましく、４－アミノアンチピリンであれば０．１～２．０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましく、また、ペルオキシダーゼの濃度は０．４～５．０Ｕ／ｍＬが好ましい。また、前工程で発生した過酸化水素をカタラーゼで分解する工程ではカタラーゼの阻害剤であるアジ化ナトリウムを使用し、第二工程の反応液中へ添加する。この場合のアジ化ナトリウムの濃度は、通常、０．１ｇ／L～１．０ｇ／Ｌ程度である。
　反応液には通常の生化学反応に用いられる各種の緩衝液を使用することができ、ｐＨが５～８の間であるのが好ましい。溶液としては、グッド、トリス、リン酸、グリシンの緩衝溶液が好ましく、グッド緩衝液であるビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシエチル）メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、ピペラジンー１、４－ビス（２－エタンスルフォン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジンー１、４－ビス（２－エタンスルフォン酸）、１．５ナトリウム塩、一水和物（ＰＩＰＥＳ１．５Ｎａ）、3-モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ、Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）―２―アミノエタンスルフォン酸（ＢＥＳ）、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルフォン酸（ＨＥＰＥＳ）およびピペラジン－１、４－ビス（２－ヒドロキシー３－プロパンスルフォン酸）（ＰＯＰＳＯ）が好ましい。
　反応温度は２５～４０℃程度が好ましく、さらに３５～３８℃が好ましく、３７℃が最も好ましい。反応時間は特に限定されず、通常、２～１０分程度である。
　本発明の方法は、被検試料に上記界面活性剤をそのまま反応させて行うことも可能であるが、HDL又はHDL3中のコレステロール以外のコレステロールを反応系外に移行させる前工程を先に行い、この前工程後の試料に対して上記した本発明の方法を行うとHDL3コレステロールをより正確に定量することができるので好ましい。
　前記前工程は、HDL以外のリポタンパク質と反応する界面活性剤又はHDL3以外のリポタンパク質と反応する界面活性剤の存在下で行うことが好ましい。HDL以外のリポタンパク質と反応する界面活性剤としては、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウムアミドノニオン、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル及びアミドノニオンのような陰イオン界面活性剤；及び／又はＨＬＢ値が１４～１７のポリオキシエチレン多環フェニルエーテルのような非イオン系界面活性剤が好ましい。これらの界面活性剤は、単独で用いることもできるし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。より具体的には、プルロニック、プルロニックＰ１２３（旭電化）プルロニックＦ８８（旭電化）、レベノールＷＸ（花王)ノニオンHS２２０(日本油脂) 、ナイミッドＭＴ－２１５（日本油脂）、Ｎｅｗｃｏｌ-７２３（日本油脂）、Ｎｅｗｃｏｌ－２６１４（日本乳化剤）、Ｎｅｗｃｏｌ－７１４（日本乳化剤）を挙げることができる。
　HDL3以外のリポタンパク質に反応する界面活性剤としては、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル等の非イオン界面活性剤；ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン縮合物、アミドエーテルサルフェート及びポリオキシエチレン－ステアリルアミン等の陰イオン界面活性剤；ヤシ油脂肪酸―アミドプロピルジメチル－アミノ酢酸ベタイン、アルキルジメチル－アミノ酢酸ベタイン及びラウリルベタイン等の両性界面活性剤；並びにラウリルトリメチルアンモニウムクロライドのような陽イオン界面活性剤を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。より具体的には、非イオン界面活性剤としてはポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテルであるエマルゲンＡ５００（商品名、花王社製、以下、会社名は製造会社であり、会社名が併記されているものは全て商品名である）；陰イオンとしてはポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン縮合物であるプルロニックＦ１２７（旭電化）、プルロニックＦ６８（旭電化）プルロニックＰ１０３（旭電化）、アミドエーテルサルフェートであるサンアミドＣＦ－１０（日本油脂）、ポリオキシエチレン－ステアリルアミンであるナイミーンＳ２１０（日本油脂）；両性界面活性剤としてはヤシ油脂肪酸―アミドプロピルジメチル－アミノ酢酸ベタインであるニッサンアノンＢＤＦ－ＳＦ（日本油脂）、アルキルジメチル－アミノ酢酸ベタインであるニッサンアノンＢＦ（日本油脂）、ラウリルベタインであるアンヒトール２４Ｂ（花王）；陽イオン界面活性剤としては、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライドであるコータミン２４Ｐ（花王）、が挙げられる。これらは単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
　前工程で用いる界面活性剤の濃度は、０．０１～５.０重量％が好ましく、０．０３～３．０重量％程度がより好ましい。
　前工程では、界面活性剤の反応を受けてコレステロールを反応系外に移行させる。ここで、「反応系外に移行させる」とは、コレステロール及びそのエステルを消去又は保護することにより、その後の工程において、コレステロール及びそのエステルが関与しないようにすることを意味する。
　ここで、「消去」とは、被検試料中のリポ蛋白のコレステロールを分解し、その後の工程において、コレステロール測定の反応に作用させないようにすることである。リポ蛋白コレステロールを消去するための方法としては、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ発生した過酸化水素を、カタラーゼを用いて水と酸素に分解する方法が挙げられる。また、ペルオキシダーゼを用いて水素供与体と発生した過酸化水素を反応させ無色キノンに転化してもよいが、これらに限定されるものではない。コレステロールの消去の方法自体はこの分野において周知であり、下記実施例にも具体的に記載されている。
　「保護」とは、被検試料中のリポ蛋白をその後の工程においてコレステロール測定に反応しないように、保護を行なうことである。リポ蛋白を保護するのには、各リポ蛋白をコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼが作用しないように特異的に保護する界面活性剤を用いる方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本願発明者らは、さらに、ホスフォリパーゼ及びスフィンゴミエリナーゼがリポタンパク質に作用するが、HDL3にはほとんど作用しないことを見出した。従って、上記した界面活性剤に加え、ホスフォリパーゼ及び／又はスフィンゴミエリナーゼ（以下、両者を総称して「ホスフォリパーゼ等」と呼ぶことがある）を共存させることにより、HDL3コレステロールをさらに正確に定量できるので好ましい。
　ホスフォリパーゼとしては、少なくともホスファチジルコリンに作用するものであればよく、ホスフォリパーゼＡ、ホスフォリパーゼＣ及びホスフォリパーゼＤが好ましく、特にホスフォリパーゼＣ及びホスフォリパーゼＤが好ましい。ホスフォリパーゼ等は市販されているので、市販品を好ましく用いることができる。ホスフォリパーゼ等は単独で用いることもできるし、２種以上のものを組み合わせて用いることもできる。
　ホスフォリパーゼ等の終濃度（２種類以上のものが用いられる場合にはその合計濃度、以下同じ）は０．１～１００Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、０．２～５０Ｕ／ｍＬ程度がより好ましい。
　なお、前工程に界面活性剤を共存させる場合でも、反応条件（反応温度、時間、緩衝液等）は上記の通りである。
　前工程は、コレステロールを反応系外に移行させるための酵素系や界面活性剤を同時に添加しておくことにより、両工程を単一の工程として同時に行うこともできる。なお、第１工程と第２工程では異なる界面活性剤を用いる。
　前工程において、コレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを用いる場合、コレステロールエステラーゼの濃度（本明細書において、濃度は特に断りがない限り終濃度を意味する）は０．１～１０．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、０．２～２．０Ｕ／ｍＬ程度がより好ましい。コレステロールオキシダーゼの濃度は０．０５～１０．０Ｕ／ｍＬ程度が好ましく、０．１～１．０Ｕ／ｍＬ程度がより好ましい。なお、コレステロールエステラーゼは、エステル型コレステロールに作用するものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、旭化成社製のコレステロールエステラーゼ(ＣＥＢＰ、ＣＥＮ)や東洋紡社製のコレステロールエステラーゼ(ＣＯＥ－３１１、ＣＯＥ－３１２)などの市販品を用いることができる。また、コレステロールオキシダーゼは、遊離型コレステロールに作用するものであれば、特に制限されるものではなく、例えば、旭化成社製のコレステロールオキシダーゼ(ＣＯＮII)や東洋紡社製のコレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ－３１１、ＣＯＯ－３２１、ＣＯＯ－３３１）などの市販品を用いることができる。
　前工程において、ペルオキシダーゼを用いる場合、ペルオキシダーゼの濃度は２．０～５．０単位/ｍL程度が好ましく、さらに３．０～４．０単位/ｍL程度が好ましい。また、無色キノンに転化する化合物を用いる場合、その濃度は０．４～０．８ｍｍ０ｌ／Ｌ程度が好ましい。
　前工程の他の条件（反応温度、反応時間、緩衝液等）は、上記した本発明の方法と同様であってよい。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
参考例１
　以下の試薬組成の試薬Ａと試薬Ｂを調製し、試薬Ａに各種界面活性剤を０．１％（ｗ／ｖ）または１．０％（Ｗ／Ｖ）濃度添加した試薬をそれぞれ調製した。測定直前に各種界面活性剤入りの下記試薬Ａと試薬Ｂを１：３の割合で混合し、ＨＤＬ２分画とＨＤＬ３分画のコレステロールを反応させ、主波長７００ｎｍ、副波長６００ｎｍでの終吸光度を測定し比較した。
　ＨＤＬ２分画とＨＤＬ３分画は、以下の様にして画分した。ＨＤＬを含む被検試料、すなわち、血清に塩化ナトリウム及び臭化ナトリウムを用いた溶液を用いて、超遠心によりＨＤＬ２とＨＤＬ３との境目の比重(1.125)で別れるように画分し、それぞれの画分を回収した。
　下記表１には、ＨＤＬ２／ＨＤＬ３の率が０．７５以下で、ＣＭ～ＩＤＬ／ＨＤＬ３、ＬＤＬ／ＨＤＬ３が０．７５以下である界面活性剤を示し、これらをＨＤＬ３に反応する界面活性剤とする。表２には、ＨＤＬ２／ＨＤＬ３の率が１．２５以上で、ＣＭ～ＩＤＬ／ＨＤＬ２、ＬＤＬ／ＨＤＬ２の率が１．２５以上である界面活性剤を示し、これらをＨＤＬ３以外に反応する界面活性剤とする。表３には、ＨＤＬ２／ＨＤＬ３の率が０．７５～１．２５間で、ＣＭ～ＩＤＬ/ＨＤＬ２、ＬＤＬ/ＨＤＬ２、ＣＭ～ＩＤＬ／ＨＤＬ３、ＬＤＬ／ＨＤＬ３の率が０．７５以下である界面活性剤を示し、これらをＨＤＬに反応する界面活性剤とする。表４には、ＨＤＬ２／ＨＤＬ３の率が０．７５～１．２５間で、ＣＭ～ＩＤＬ/ＨＤＬ２、ＬＤＬ/ＨＤＬ２、ＣＭ～ＩＤＬ／ＨＤＬ３、ＬＤＬ／ＨＤＬ３の率が０．７５以上である界面活性剤を示し、これらを全てのリポ蛋白に反応する界面活性剤とする。表５には、上記にあてはまらない界面活性剤を示しこれらを、ＨＤＬ以外に反応する界面活性剤とする。
試薬Ａ
　ＢＥＳ緩衝液　(ｐＨ７．０）　１００ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＨＤＡＯＳ　　０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
　カタラーゼ　　６００Ｕ／Ｌ
　コレステロールオキシダーゼ　　１．４Ｕ／ｍＬ
　コレステロールエステラーゼ　　０．８Ｕ／ｍＬ
試薬Ｂ
　ＢＥＳ緩衝液　（ｐＨ６．６）　１００ｍｍｏｌ／Ｌ
　アジ化ナトリウム　０．１％
　４－アミノアンチピリン　４．０ｍｍｏｌ／Ｌ　
　ペルオキシダーゼ　２．４Ｕ／ｍＬ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 （単位：Ａｂｓ×１００００）
　エマルゲンA90、エマルゲン120、ニッサンアノンBL-SF、Triton－WR-1339、パーソフトNK-100、アデカトールPS440EがHDL３に特異的に反応する界面活性剤であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 （単位：Ａｂｓ×１００００）
　エマルゲンA500、ニッサンアノンBDF-SF、ニッサンアノンBF、ナイミーンS210、プルロニックP103、コータミン24P、サンアミドCF-10、アンヒトール２４B、プルロニックF68、プルロニックF127がHDL３以外に反応する界面活性剤であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 （単位：Ａｂｓ×１００００）
　エマルゲンB66、エマルゲンA60、エマルゲンLS110、Nowol610、Newcol2609、Newcol-CMP-11、ニッサンアノンGLM－RLV、Newcol-710がHDLに特異に反応する界面活性剤であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 （単位：Ａｂｓ×１００００）
　エマルゲン108、エマルゲン707、Newcol707、アデカトールLB83、アデカトールLB103、エマルゲン909が全てのリポ蛋白に特異に反応する界面活性剤であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 （単位：Ａｂｓ×１００００）
　Newcol－714、Newcol-723、Newcol2614、ナイミーンS215、プルロニックP123、レベノールWX、ナイミッドMT215、ノニオンHS220、プルロニックF88がHDL以外に特異に反応する界面活性剤であった。
実施例１
　超遠心を用いてＣＭ～ＬＤＬ分画、ＨＤＬ２分画、ＨＤＬ３分画を画分し、下記試薬Ｊを反応させ、さらに、下記試薬Ｋを添加し、測定を行なった。測定は、血清２μＬに試薬Ｅを１５０μＬ添加し、５分加温反応の後、試薬Ｋを添加しさらに５分加温反応させ、主波長７００ｎｍ、副波長６００ｎｍの吸光度を測定した。
試薬Ｊ
　ＢＥＳ緩衝液　（ｐＨ７．０）　１００ｍｍｏｌ／Ｌ
　ＨＤＡＯＳ　　０．７ｍｍｏｌ／Ｌ
プルロニックＰ１０３　０．０３ｗ／ｖ％
　カタラーゼ　　６００Ｕ／Ｌ
　コレステロールオキシダーゼ　　１．４Ｕ／ｍＬ
　コレステロールエステラーゼ　　０．８Ｕ／ｍＬ
　ホスフォリパーゼＤ　　５．０Ｕ／ｍＬ
試薬Ｋ
　ＢＥＳ緩衝液　（ｐＨ６．６）　１００ｍｍｏｌ／Ｌ
　アジ化ナトリウム　０．１％
　エマルゲン１２０　１．０％
　４－アミノアンチピリン　４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　２．４Ｕ／ｍＬ
　試薬Ｋが添加されてからの各分画における吸光度の経時変化の結果を図１に示す。ＨＤＬ３に対して特異的に反応することが見て取れる。

Claims (3)

  1. 　被検試料に高密度リポタンパク質３と特異的に反応する界面活性剤を反応させ、コレステロールを定量することを含む、高密度リポタンパク質３中のコレステロールの定量方法。
  2. 　前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル及びＰ－イソオクチルポリオキシエチレンフェノールホルムアルデヒドポリマーから成る群より選ばれる少なくとも１種の非イオン界面活性剤；ラウリルジメチル－アミノ酢酸ベタイン及びポリオキシエチレンラウリルエーテルから成る群より選ばれる少なくとも１種の両性界面活性剤；及び／又は脂肪酸族リン酸エステルから成る群より選ばれる少なくとも１種の陽イオン界面活性剤である請求項１記載の方法。
  3. 　前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンラウリルエーテルである請求項２記載の方法。
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