WO2006085654A1 - レムナント様リポ蛋白（ｒｌｐ）中のコレステロールの定量方法、試薬およびキット - Google Patents

レムナント様リポ蛋白（ｒｌｐ）中のコレステロールの定量方法、試薬およびキット Download PDF

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WO2006085654A1
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cholesterol
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enzyme
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Kazuhito Miyauchi
Mayumi Fujinaka
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Kyowa Medex Co., Ltd.
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors

Definitions

  • the present invention relates to a method, reagent and kit for quantifying cholesterol in remnant-like lipoprotein (hereinafter abbreviated as RLP), which is regarded as a risk factor such as arteriosclerosis in clinical examinations.
  • RLP remnant-like lipoprotein
  • CM chylomicron
  • VLDL very low density lipoprotein
  • LDL low density lipoprotein
  • HDL high It is classified as a density lipoprotein (hereinafter abbreviated as HDL).
  • Each lipoprotein has different proportions of constituents such as cholesterol, tridalylide, phospholipid, and protein, and has different actions in vivo.
  • cholesterol in HDL is a negative factor as a risk factor for arteriosclerosis
  • cholesterol in LDL is a positive factor as a risk factor for arteriosclerosis. Has been measured.
  • cholesterol in lipoproteins produced due to lipid metabolism and the like is a closer index than cholesterol in LDL as a risk factor for arteriosclerosis.
  • RLP is mentioned as a lipoprotein produced due to lipid metabolism or the like.
  • RLP-C a quantification method of cholesterol in RLP (hereinafter abbreviated as RLP-C) by an immunoadsorption method.
  • the serum was obtained from the serum by immunoaffinity mouthmatography using a affinity gel containing a specific anti-apo B-100 monoclonal antibody that does not recognize anti-apo A-I monoclonal antibody and apo B-48.
  • RLP is separated, and cholesterol contained in the separated RLP is quantified.
  • the reagent for quantifying cholesterol in RLP applied to this quantification method is sold by Nippon Antibody Laboratory Co., Ltd. [Product name: RLP-cholesterol "JIMRO" II] (Non-patent document 1, Non-patent document) (Ref. 2). This An insurance score is given by the Ministry of Health, Labor and Welfare for the quantitative determination of RLP-C by the immunoadsorption method.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-231597
  • Non-Patent Document 1 Arteriosclerosis, 25 (9,10), 371 (1998)
  • Non-Patent Document 2 Clinical Chemistry, 48 (2), 217
  • An object of the present invention is to provide a quantification method, a reagent, and a kit for easily quantifying RLP-C that does not require a sample separation operation with high sensitivity.
  • the present invention relates to a remnant-like lipoprotein in the presence of a cholesterol ester hydrolase and cholesterol oxidase or cholesterol dehydrogenase activity in combination with a specific surfactant and an enzyme that hydrolyzes phospholipids. It was completed based on the knowledge that it specifically acts on cholesterol.
  • the present invention relates to the following (1) to (20).
  • the hydrogen peroxide is quantified by reacting the produced hydrogen peroxide with an oxidative coloring chromogen in the presence of peroxidase and quantifying the produced dye. The method described.
  • Polyoxyethylene polyoxybutylene copolymer has the general formula (I)
  • A, B and C are the same or different and each represents an integer of 1 to 200, and R represents a hydrogen atom, linear or branched alkyl
  • Enzyme that hydrolyzes phospholipids, cholesterol ester hydrolase, cholesterol oxyenzyme, and combination of surfactant (dl) and surfactant (d2), or interface A reagent for quantifying remnant-like lipoprotein cholesterol in a sample, comprising a combination of an activator (d3) and a surfactant (d4).
  • a polyoxyethylene polyoxybutylene copolymer is represented by the general formula (I)
  • A, B and C are the same or different and each represents an integer of 1 to 200, and R represents a hydrogen atom, linear or branched alkyl) (7) to (10)!
  • R represents a hydrogen atom, linear or branched alkyl
  • (13) Contains a first reagent containing a surfactant (dl) and a second reagent containing an enzyme that hydrolyzes phospholipids, a cholesterol esterase, and a cholesterol acid enzyme And a surfactant (d2) in at least one of the first reagent and the second reagent, a kit for quantifying remnant-like lipoprotein cholesterol in a sample
  • a kit for quantifying remnant-like lipoprotein cholesterol in a sample characterized by
  • a first reagent containing a surfactant (d3) and a second reagent containing an enzyme that hydrolyzes phospholipid, a cholesterol esterase and a cholesterol dehydrogenase In a sample characterized by containing a surfactant (d4) in at least one of the first reagent and the second reagent, and containing an oxidized coenzyme in at least one of the first reagent and the second reagent. Kit for the determination of remnant-like lipoprotein cholesterol.
  • A, B and C are the same or different and each represents an integer of 1 to 200, and R represents a hydrogen atom, linear or branched alkyl) (13), (15), (16) or the kit according to (18).
  • a method, a reagent and a kit for easily and easily quantifying RLP-C which does not require a sample separation operation.
  • FIG. 1 shows a correlation diagram between a quantification method using RLP cholesterol “JIMRO” II (manufactured by Nippon Antibody Laboratories) and the quantification method of Example 4.
  • FIG. 2 shows a correlation diagram between a quantitative method using RLP cholesterol “JIMRO” II (manufactured by Nippon Antibody Laboratories) and the quantitative method of Example 5.
  • FIG. 3 shows a correlation diagram between a quantitative method using RLP cholesterol “JIMRO” II (manufactured by Nippon Antibody Laboratories) and the quantitative method of Example 6.
  • FIG. 4 shows a correlation diagram between a quantitative method using RLP-cholesterol “JIMRO” II (manufactured by Nippon Antibody Laboratories) and a quantitative method of Comparative Example 2.
  • FIG. 5 shows a correlation diagram between a quantitative method using RLP-cholesterol “JIMRO” II (manufactured by Nippon Antibody Laboratories) and the quantitative method of Example 11.
  • FIG. 6 shows a correlation diagram between the quantification method using RLP-cholesterol “JIMRO” II (manufactured by Nippon Antibody Laboratories) and the quantification method of Example 12.
  • FIG. 7 shows a correlation diagram between a quantification method using RLP-cholesterol “JIMRO” II (manufactured by Nippon Antibody Laboratories) and the quantification method of Example 13.
  • FIG. 8 shows a correlation diagram between the quantification method using RLP-cholesterol “JIMRO” II (manufactured by Nippon Antibody Laboratories) and the quantification method of Example 14.
  • RLP refers to a lipoprotein that is a combination of a VLDL remnant and a CM remnant.
  • RLP-C remnant-like lipoprotein cholesterol
  • RLP-C is used to mean a combination of ester cholesterol and free cholesterol in RLP. Therefore, RLP-C is a combination of ester-type cholesterol in VLDL remnants, free cholesterol in VLDL remnants, ester-type cholesterol in CM remnants, and free cholesterol in CM remnants.
  • RLP-C in samples such as whole blood, plasma and serum can be quantified by the quantification method of the present invention
  • a feature of the present invention is that polyoxyethylene polyoxybutylene co-activator is used as a surfactant that causes RLP-C to act on an enzyme specifically used for cholesterol quantitative reaction in the presence of an enzyme that hydrolyzes phospholipids.
  • POE'POB copolymer polyoxyethylene styrenated ether
  • POE styrenated ether polyoxyethylene polyoxypropylene long chain branched alkyl
  • One or more surfactants selected from the group of ether (hereinafter abbreviated as POE ⁇ POP long-chain branched alkyl ether) and polyoxyethylene poly Oxypropylene alkyl aryl ether (hereinafter referred to as POE ⁇ POP)
  • alkyl aryl ether polyoxyethylene alkyl aryl ether
  • POE alkyl aryl ether polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether
  • POE ⁇ POP alkyl ether polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ether
  • PO E ⁇ POP short chain branched alkyl ether polyoxyethylene polyoxypropylene short chain branched alkyl ether
  • POE / POP copolymer polyoxyethylene polyoxypropylene copolymer
  • POE alkyl ether ether Polyoxyethylene alkyl ether ether
  • Polio Siethylene polyoxypropylene alkyl ether Polio Siethylene polyoxypropylene alkyl ether
  • P OE ⁇ POP short chain branched alkyl ether polyoxyethylene polyoxypropylene short chain branched alkyl ether
  • P OE ⁇ POP short chain branched alkyl ether A combination with one or two more selected surfactants [hereinafter referred to as “surfactant (d4) t,”] has an excellent effect.
  • the combination of these surfactants is specific to RLP-C in the presence of an enzyme that hydrolyzes phospholipids, and cholesterol ester hydrolase and cholesterol oxidase or cholesterol dehydrogenase. To act on.
  • RLP-C in a sample contains cholesterol ester hydrolase and cholesterol acid enzyme or cholesterol dehydrogenase in the presence of an enzyme that hydrolyzes phospholipids in an aqueous medium.
  • a combination of surfactants that specifically act on (i) a combination of surfactant (dl) and surfactant (d2), or (ii) a surfactant (d3) and a surfactant (In the presence of a combination with d4) RLP-C in the sample is added to (c) cholesterol ester hydrolyzing enzyme and cholesterol oxidase or (d) cholesterol ester hydrolase and oxidized coenzyme. It can be quantified by acting hydrogen peroxide and cholesterol dehydrogenase to produce hydrogen peroxide or reduced coenzyme and quantifying the produced hydrogen peroxide or reduced coenzyme. wear.
  • RLP-C in the sample is subjected to cholesterol ester-hydrolyzing enzyme and oxygenase in the presence of oxygen.
  • cholesterol ester-hydrolyzing enzyme By the action of cholesterol oxidase, ester cholesterol in RLP in the sample is converted to free cholesterol by the action of cholesterol ester hydrolase, and the resulting free cholesterol and RLP Peroxyhydrogen is produced from the free form of cholesterol and oxygen by the action of cholesterol acid enzyme.
  • the ester-type cholesterol in RLP in the sample is hydrolyzed by cholesterol ester. It is converted to free cholesterol by the action of a degrading enzyme, and free cholesterol produced by the conversion and free cholesterol in the RLP and acid-type coenzyme activity. Reduced coenzyme is converted by the action of cholesterol dehydrogenase. Generate.
  • the enzymatic reaction hydrolyzes a combination of surfactant (dl) and surfactant (d2), or a combination of surfactant (d3) and surfactant (d4), and phospholipid.
  • a combination of surfactant (dl) and surfactant (d2) or a combination of surfactant (d3) and surfactant (d4), and phospholipid.
  • dl surfactant
  • d3 surfactant
  • d4 surfactant
  • phospholipid phospholipid.
  • surfactant (d4) are combined with surfactant (dl) and surfactant.
  • surfactant (d2), the surfactant (d3), and the surfactant (d4) one or more surfactants constituting the surfactants (dl) to (d4) may be used.
  • Examples of combinations of the surfactant (dl) and the surfactant (d2) include the combinations shown in Tables 1 to 7.
  • POE-POB copolymer POE alkyl aryl ether
  • POE-POB copolymer POE alkyl aryl ether
  • phospholipids are hydrolyzed.
  • a strong combination of the action of cholesterol ester hydrolase and cholesterol esterase or cholesterol dehydrogenase to act specifically on remnant-like lipoprotein cholesterol in the presence of a degrading enzyme is preferred.
  • Examples of combinations of the surfactant (d3) and the surfactant (d4) include the combinations shown in the following Table 9.
  • reaction solution for the enzyme reaction it can be carried out in the presence of cyclodextrin or a derivative thereof, albumin or a lipoprotein flocculant, if necessary.
  • cholesterol ester hydrolase and cholesterol esterase or cholesterol may be used as long as they do not affect the specificity of the quantitative reaction of RLP-C.
  • Various enzymes used to solubilize proteins such as enzyme activators, stabilizers, preservatives, interferent inhibitors, and globulins in biological samples, which are often used to activate dehydrogenases These salts can also coexist.
  • Cholesterol ester hydrolysis reaction, free cholesterol oxidation or dehydrogenation reaction is performed by an enzyme that hydrolyzes phospholipid, and a combination of surfactant (dl) and surfactant (d2), or This can be carried out sequentially in the presence of a combination of surfactant (d3) and surfactant (d4).
  • the sample and the surfactant may be contacted in advance in an aqueous solution, and then an enzyme that hydrolyzes phospholipids and an enzyme that participates in the cholesterol reaction may be added to the solution to perform a cholesterol reaction. it can.
  • the cholesterol reaction can be performed in an aqueous solution containing all the components necessary for the quantification of RLP-C, but the components necessary for the quantification of RLP-C can be divided into groups of 2-3. This can also be done by sequentially adding the components to the reaction solution.
  • the quantification of RLP-C is preferably carried out using the RLP-C quantification kit described below.
  • cholesterol esterase, cholesterol oxidase and cholesterol dehydrogenase are usually 0.001 to 400 UZmL, preferably 0.01 to 200 UZmL, more preferably 0.05 to : Used at a concentration of LOOUZmL.
  • the concentration of the enzyme that hydrolyzes phospholipids in an aqueous medium is not particularly limited, but is preferably 0.001 to 400 U / mI ⁇ force S, more preferably 0.01 to 200 U / mI ⁇ force S, 0.05 to : LOOU / m L is particularly preferred.
  • the concentrations of the surfactant (dl), the surfactant (d2), the surfactant (d3), and the surfactant (d4) are 0.001 to 5 respectively.
  • (wZv)% is preferred 0.00 5-2.5
  • (wZv)% is more preferred 0.05-: L (wZv)% is particularly preferred.
  • the enzyme reaction is usually carried out at a temperature of 10 to 50 ° C, preferably 20 to 40 ° C, and is usually completed in 2 to 30 minutes.
  • the peroxyhydrogen produced is produced, for example, by the reaction of peracid hydrogen with the chromogen converted to the pigment by the acid in the presence of peroxidase, The change in absorbance is quantified, for example, by measuring at the absorption maximum wavelength of the dye produced.
  • the generated peroxyhydrogen is produced by reacting, for example, an organic luminescent substance such as luminol, isoluminol, lucigenin, atalydium ester with peracid hydrogen to produce photon. Quantified by quantifying.
  • the reduced coenzyme can be quantified, for example, by measuring the absorbance of the reduced coenzyme-containing solution produced by the enzyme reaction at 300 500, preferably 330 400 nm, more preferably around 340 nm.
  • the produced reduced coenzyme generates, for example, a dye by the reaction of the reduced coenzyme in the presence of diaphorase or an electron carrier and the chromogen converted to the dye by the reduction, and produces a change in the absorbance of the reaction solution, for example. It is quantified by measuring at the absorption maximum wavelength of the dye.
  • An example of an electron carrier is 1-methoxy-5-methylphenmethyl methyl sulfate.
  • the concentration of RLP-C in the sample shows, for example, the relationship between cholesterol concentration and the amount of peroxyhydrogen or reduced coenzyme using a sample containing a known concentration of RLP-C.
  • a calibration curve can be created and obtained from this calibration curve.
  • Cholesterol ester-hydrolyzing enzyme is an enzyme that can hydrolyze cholesterol ester, for example, cholesterol esterase, lipoprotein lipase, etc., and is derived from animals, plants or microorganisms, or manufactured by genetic engineering techniques, Chemically modified enzymes and the like can be used.
  • the chemically modified enzyme include a group mainly composed of polyethylene glycol or polypropylene glycol, a group having a copolymer of polypropylene glycol and polyethylene glycol, a group containing a water-soluble polysaccharide, and a sulfopropyl group.
  • An enzyme modified with a chemical modification group such as a sulfobutyl group, a polyurethane group, or a group having a chelating function.
  • an enzyme modified with a group mainly composed of polyethylene glycol is preferred.
  • the water-soluble polysaccharide include dextran, pullulan, and soluble starch.
  • a reagent for chemical modification combines the above-mentioned chemical modification group with a functional group or structure capable of reacting with an amino group, carboxyl group, sulfhydryl group, etc. of the enzyme. Holding One compound and the like.
  • Functional groups or structures capable of reacting with amino groups in enzymes include, for example, carboxyl groups, active ester groups (such as N-hydroxysuccinimide groups), acid anhydrides, acid chlorides, aldehydes, epoxide groups, 1, 3 propane sultone, 1, 4 Butane sultone etc. are included.
  • Functional groups or structures that can react with carboxyl groups in enzymes include, for example, amino groups.
  • Groups or structures reactive with sulfhydryl groups in enzymes include, for example, maleimide groups, disulfides, a-haloesters (such as ⁇ -ester esters), and the like.
  • Examples of chemical modifiers are: Sunbright VFM—4101, Sunbright MEAC—50HS, Sunbright MEC—50HS (V, deviation from Japan) having a group based on polyethylene glycol and a hydroxysuccinimide group.
  • Chemical modification of the enzyme can be performed, for example, by the following method.
  • the cholesterol esterase hydrolyzing enzyme is dissolved in a buffer solution having a pH of 8.0 or more, for example, HEP ES buffer solution, and 0.01 to 500-fold molar amount of chemical modifier is added at 0 to 55 ° C. Stir for 5 minutes to 5 hours.
  • a buffer solution having a pH of 8.0 or more, for example, HEP ES buffer solution
  • chemical modifier 0.01 to 500-fold molar amount of chemical modifier is added at 0 to 55 ° C. Stir for 5 minutes to 5 hours.
  • the reaction solution itself but also the unreacted chemical modifier etc. removed by an ultrafiltration membrane etc. if necessary Can also be used.
  • cholesterol enzyme an enzyme derived from an animal, plant or microorganism, an enzyme produced by a genetic engineering method, a chemically modified enzyme, or the like can be used.
  • the chemical modification enzyme can be produced by the above-described chemical modification method.
  • Cholesterol dehydrogenase is an animal, plant or microorganism source as long as it has the ability to produce reduced coenzyme by acidifying cholesterol in the presence of acid coenzyme.
  • Conventional enzymes, enzymes produced by genetic engineering techniques, and chemically modified enzymes can be used.
  • the chemically modified enzyme can be produced by the above-described chemical modification method using, for example, the above-described chemical modifier.
  • the enzyme that hydrolyzes phospholipids is not particularly limited as long as it has an ability to degrade phospholipids.
  • Examples include enzymes that degrade phospholipids derived from animals, plants and microorganisms.
  • Specific examples of enzymes that degrade phospholipids include phospholipase 0, phospholipase, phospholipase A2, and lysophospholipase.
  • Examples of the acid type coenzyme used in the quantification method using cholesterol dehydrogenase of the present invention are NAD, NADP, thio NAD, and thio NADP.
  • the surfactant (dl) used in the present invention is combined with the surfactant (d2) used in the present invention to hydrolyze cholesterol ester in the presence of an enzyme that hydrolyzes phospholipids. It has the function of causing RLP-C to specifically act on enzymes and cholesterol oxidase or cholesterol dehydrating enzymes.
  • RLP-C cholesterol oxidase
  • cholesterol ester hydrolase and cholesterol acid enzyme or cholesterol dehydrogenase are not necessarily specific to RLP-C. It is not necessary to have a high function.
  • the surfactant (d3) used in the present invention is combined with the surfactant (d4) used in the present invention to hydrolyze cholesterol ester in the presence of an enzyme that hydrolyzes phospholipids. It has the function of causing RLP-C to specifically act on enzymes and cholesterol oxidase or cholesterol dehydrating enzymes.
  • RLP-C cholesterol oxidase or cholesterol dehydrating enzymes.
  • cholesterol ester hydrolase and cholesterol acid enzyme or cholesterol dehydrogenase are not necessarily specific to RLP-C. It is not necessary to have a high function.
  • the POE'POB copolymer includes a random polymer and a block polymer of polyoxyethylene and polyoxybutylene.
  • R is a hydrogen atom, A straight-chain or branched alkyl [hereinafter referred to as compound (I)] and the like.
  • R is preferably a hydrogen atom.
  • the straight chain or branched alkyl in the compound (I) has 1 to 30 carbon atoms, such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentinole, isopentyl, neopentyl, Hexyl, isohexyl, heptyl, isoheptyl, octyl, isooctyl, Noel, isonoel, decyl, isodecyl, undecyl, isondecyl, dodecyl, isododecyl, tridecyl, isotridecyl, tetradecyl, isotetradecyl, pentadecyl, isopentadecyl, he Xadecyl, isohexadecyl, heptadecyl,
  • the molecular weight of the polyoxybutylene moiety is preferably 700 or more, more preferably 1,000 or more, and particularly preferably 1,500 or more.
  • compound (I) examples include pronone B-204 and pronon B-208 (manufactured by NOF Corporation).
  • POE styrenated ethers examples include BLAUNON DSP—9, BLAUNON DSP-12.5, BLAUNON DSP—20, BLAUNON DSP—10, BLAUNO
  • N TSP-5, BLAUNON TSP-7.5, BLAUNON TSP-16, BLAUNON TSP-20, BLAUNON TSP-50 (above, manufactured by Aoki Yushi Co., Ltd.) and the like are commercially available.
  • the long-chain branched alkyl in the POP long-chain branched alkyl ether includes, for example, a branched alkyl having 20 to 30 carbon atoms, such as isoicosyl, otatildodecyl, isohexicosyl, isodocosyl, isotricosyl, isotetracosyl, decyltetra Examples include decyl, isopentacosyl, isohexacosyl, dodecyltetradecyl, isoheptacosyl, isooctacosyl, isononacosyl, and isotriaconsyl.
  • P POP long chain branched alk A specific example of Ruether is Duloop MT-0620B (manufactured by NOF Corporation), and is commercially available.
  • Examples of the alkyl in POE ⁇ POP alkylaryl ether and POE alkylaryl ether include those having 8 or more carbon atoms, such as octyl, nor, etc., and examples of aryl include phenyl, naphthyl, and the like. It is done. As the reel, a file is preferable.
  • the alkyl in the POP alkyl ether includes 6 to 30 carbon atoms such as hexyl, heptyl, octyl, noel, decyl, undecyl, dodecyl (lauryl), tridecyl, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, Examples include xadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecyl, icosyl, hencosyl, docosyl (benhenyl), tricosinole, tetracosyl, pentacosyl, hexacosyl, heptacosyl, octacosyl, nonacosyl, triaconsil, and the like.
  • Short chain branched alkyls in POE POP short chain branched alkyl ethers include branched alkyls having 6 to 19 carbon atoms such as isohexyl, isoheptyl, isooctyl, isonol, isodecyl, isondecyl, isododecyl, isotridecyl, isotetradecyl, Examples include decyl, isopentadecyl, isohexadecyl, isoheptadecyl, isooctadecyl, and isononadecyl.
  • POP alkylaryl ethers include polyoxyethylene polyoxypropylene alkylphenol ethers and the like. Specific examples are Emargen L-40 (manufactured by Kao Corporation), Akroneses KP-189R (manufactured by NOF Corporation), and the like, which are commercially available.
  • POE alkyl ether examples include polyoxyethylene alkyl ether. Specific examples are Emargen 911, Emargen 810 (above, manufactured by Kao), NORON HS-210, NOON HS-215, NOON NS—208.5, NOON HS—208 (above, Nippon Oil & Fats Co., Ltd.) and the like are commercially available.
  • POE ⁇ POP alkyl ethers and POE ⁇ POP branched alkyl ethers are preferably POE'POP alkyl ethers and POE ⁇ POP branched alkyl ethers with a hydrophilic mono-lipophilic balance (HLB) of 9 to 20! / ,.
  • HLB hydrophilic mono-lipophilic balance
  • POE and POP alkyl ethers examples are WONDERSURF RL-100, WONDERSURF S-1000 (manufactured by Aoki Yushi Co., Ltd.) and the like, which are commercially available.
  • POP short-chain branched alkyl ethers are Wandersurf ID-70, Wandersurf ID-90 (manufactured by Aoki Yushi Co., Ltd.), etc., and are commercially available.
  • ⁇ ⁇ POP copolymers include random polymers and block polymers of polyoxyethylene and polyoxypropylene, such as those represented by the general formula (II)
  • R represents a hydrogen atom, linear or branched alkyl
  • R is preferably a hydrogen atom
  • Examples of the straight chain or branched alkyl in the compound ( ⁇ ) include the same as the straight chain or branched alkyl in the compound (I).
  • the molecular weight of the polyoxypropylene moiety in the present compound is preferably 2,050 or more, more preferably 2,750 or more, and particularly preferably 3,250 or more.
  • Pronon 102 Pronon 104, Pronon 201, Pronon 204, Pronon 208, Pronon 202B (manufactured by NOF Corporation), etc., are commercially available.
  • Examples of the aqueous medium include deionized water, distilled water, and a buffer solution, and a buffer solution is preferable.
  • Examples of the buffer used in the buffer include tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, borate buffer, Good's buffer, and the like.
  • Good buffering agents include, for example, 2 morpholinoethanesulfonic acid (MES), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), N- (2-acetamido) iminonic acid (ADA), piperazine 1 N, N, 1 bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPE S), N— (2 acetamido) 2 aminoethanesulfonic acid (ACES), 3-morpholino 1 2-hydroxypropanesulfonic acid ( MOPSO), N, N Bis (2-hydroxyethyl) 2 aminoethanesulfonic acid (BES), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), N— [Tris (hydroxymethyl) methyl] 2 aminoethanesulfonic acid (TES), 2- [4- (2-hydroxyethyl) 1-piperadyl] ethanesulfonic acid (HEPES), 3- [N, N Bis (2-hydroxyethyl)
  • TAPS N cyclohexyl 2 Aminoethanesulfonic acid
  • CHES N -cyclohexyl 3 Amino 2 hydroxypropane sulfonic acid
  • CAPSO N -cyclohexyl 3
  • the buffer is usually at a pH of 4 to 10, preferably 5 to 9, usually 0.001 to 0.5 mol / L, preferably 0.005 to 0.2 molZL, more preferably 0.01 to 0. Used at a concentration of ImolZL.
  • chromogen used for the determination of peroxyhydrogen for example, a chromogen that is converted into a pigment by oxidation with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase is used.
  • examples include leuco chromogens and oxidative coupling chromogens.
  • Leuco-type chromogens are substances that can be converted into pigments alone in the presence of peroxidation active substances such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • Examples of leuco chromogens are 10—N-carboxymethylcarbamoyl-3,7 bis (dimethylamino) —10H phenothiazine (CCAP), 10- (N-methylcarbamoyl) -3,7 bis (dimethylamino) — 10H phenothiazine (MCDP), N— (carboxymethylaminocarbol) —4,4, -bis (dimethylamino) diphenylamine salt (DA 64), 4,4,1bis (dimethylamino) diphenylamine, Bis [3 bis (4 phenyl) methyl 4-dimethylaminophenol] amine (BCMA).
  • CCAP 10—N-carboxymethylcarbamoyl-3,7 bis (dimethylamino) —10H phenothiazine
  • MCDP 10- (N-methylcarbamoyl) -3,7 bis (dimethylamino) — 10H phenothi
  • the oxidatively coupled chromogen is a color in which two compounds are coupled by an acid and converted into a dye in the presence of a peroxide active substance such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • a peroxide active substance such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • Examples of combinations of the two compounds include combinations of couplers and aryls, and couplers and phenols.
  • couplers are 4-aminoantipyrine (4-AA), 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazine.
  • phosphines are N— (3-sulfopropyl) -arylin, N-ethyl—N— (2-hydroxy-3-sulfopropyl) —3-methylmethyl-line (TOOS), N-ethyl N— (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethylaline (MA OS), N-ethyl-N— (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxy-phosphorus (DAOS) ), N-ethylyl N— (3-sulfopropyl) -3-methylaline (TOP S), N— (2-hydroxy-1-sulfopropyl) -3,5-dimethoxy-phosphorus (HDAOS), N, N-dimethyl-3-methylaline, N, N-di
  • Peroxidase is usually used at a concentration of 1 to: LOOkUZL.
  • the chromogen is usually used at a concentration of 0.01 to: LOgZL.
  • chromogen used for quantification of the reduced coenzyme for example, a chromogen that is converted into a dye by reduction with a reduced coenzyme in the presence of diaphorase or an electron carrier is used.
  • An example is 3— (4,5 dimethyl—2 thiazolyl) — 2,5 diphenol—2H—tetrazolium bromide (MTT) ⁇ 2- (4—Edophenol) 3— (4—-Trophee -L) —5— (2, 4 disulfophenol) 2H—tetrazolium monosodium salt (WST— 1), 2- (4 Codophor) 3— (2, 4 Di-Trophe) 5— (2, 4 Disulfophenol) 2H—Tetrazolium monosodium salt (WST-3).
  • Diaphorase and one electron carrier are usually used at a concentration of 1 to: LOOkUZL.
  • the chromogen is usually used at a concentration of 0.01 to 10 gZL.
  • cyclodextrin or derivatives thereof are cyclodextrin, dimethylcyclodextrin, trimethylcyclodextrin, hydroxyethylcyclodextrin, hydroxypropylcyclodextrin, carboxymethylcyclodextrin, glycosylcyclodextrin, maltosylcyclodextrin, Cyclodextrin phosphate, cyclodextrin
  • Xistrin is preferred.
  • cyclodextrin examples are at-cyclodextrin, 13-cyclodextrin, and ⁇ -cyclodextrin.
  • dimethylcyclodextrin examples include dimethyl-at-cyclodextrin, dimethyl-13-cyclodextrin, dimethyl- l -cyclodextrin.
  • trimethylcyclodextrin examples include trimethyl- (X-cyclodextrin, trimethyl- ⁇ -cyclodextrin, trimethyl- ⁇ -cyclodextrin.
  • carboxymethylcyclodextrin examples include carboxymethyl-at-cyclodextrin, carboxymethyl-13-cyclodextrin, carboxymethyl- ⁇ -cyclodextrin.
  • glycosyl cyclodextrins examples include glycosyl mono ⁇ -cyclodextrin, glycosyl- ⁇ -cyclodextrin, glycosyl mono ⁇ -cyclodextrin.
  • maltosyl cyclodextrin examples include maltosyl-a-cyclodextrin, maltosyl - ⁇ -cyclodextrin, maltosyl mono- ⁇ -cyclodextrin.
  • cyclodextrin sulfate examples include ⁇ -cyclodextrin sulfate, ⁇ -cyclodextrin sulfate, 7-cyclodextrin sulfate.
  • cyclodextrin polymer is a cyclodextrin polymer. Two or more kinds of cyclodextrins or their derivatives can be used in combination.
  • the concentration of cyclodextrin or a derivative thereof is preferably 0.001-5 (w / v)%, and 0.005-5 (wZv)% is more preferable.
  • ⁇ : L (wZv)% is particularly preferred.
  • albumin examples include urushi, horse, hedge, human-derived albumin, and urine serum albumin (BSA) is preferred.
  • BSA urine serum albumin
  • Albumin produced by genetic engineering techniques can also be used. Two or more types of albumin can also be used in combination.
  • concentration of albumin is 0.001 to 5 (wZv)% forceful, 0.005 to 2.5 (w / v)% force is preferred 0.001 to L (wZv) % Is particularly preferred.
  • polyions such as phosphotungstate, dextran sulfate, and heparin include divalent metal salt such as magnesium, calcium, and cobalt.
  • concentration of the lipoprotein aggregating agent is preferably independently 0.001 to 5 (wZv)%, more preferably 0.005 to 2.5 (wZv)%. wZv)% is particularly preferred.
  • Examples of enzyme activators include ionic surfactants such as bile acids and alkyl sulfonates.
  • bile acids include cholic acid, deoxycholic acid, taurocholic acid, and chenodeoxycholic acid.
  • alkyl sulfonates include 1 pentasulfonate, 1 hexasulfonate, 1 heptasulfonate, 1 otatasulfonate.
  • Examples of salts in the alkyl sulfonates include ammonium salts, lithium salts, sodium salts, strong lithium salts, magnesium salts, calcium salts.
  • stabilizers include ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), sucrose, calcium chloride.
  • preservatives examples include sodium azido and antibiotics.
  • interference inhibitors are ascorbic acid oxy to suppress the effects of ascorbic acid. Contains ferrocyan potassium to suppress the effects of dases and pyrilvin.
  • Examples of the salts are lithium chloride, lithium sulfate, sodium chloride sodium, sodium sulfate, potassium chloride, potassium sulfate, magnesium chloride, magnesium sulfate, magnesium acetate, sodium chloride salt, magnesium sulfate. Contains magnesium nitrate and calcium nitrate.
  • the RLP-C quantitative reagent of the present invention comprises an enzyme that hydrolyzes phospholipid, cholesterol esterase, cholesterol acid enzyme, and a combination of a surfactant (dl) and a surfactant (d2). Or it contains a combination of surfactant (d3) and surfactant (d4).
  • the reagent may contain a hydrogen peroxide quantification reagent. Examples of the hydrogen peroxide determination reagent include a reagent containing a peroxidase and a chromogen that is converted into a pigment by oxidation with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase.
  • RLP-C quantification reagents of the present invention include enzymes that hydrolyze phospholipids, cholesterol ester hydrolases, oxidized coenzymes, cholesterol dehydrogenases, and surfactants. Contains a combination of (dl) and surfactant (d2) or a combination of surfactant (d3) and surfactant (d4).
  • the reagent can contain a reducing coenzyme quantification reagent.
  • Examples of a reagent for quantifying reduced coenzyme include a reagent containing a diaphorase or an electron carrier and a chromogen that is converted into a dye by reduction with a reduced coenzyme in the presence of the aforementioned diaphorase or electron carrier. Can be mentioned.
  • a reagent containing cholesterol esterase, cholesterol acid enzyme, surfactant (dl), surfactant (d2) and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent containing cholesterol esterase, cholesterol acid enzyme, surfactant (d3), surfactant (d4) and a reagent for measuring hydrogen peroxide is provided.
  • a reagent comprising cholesterol esterase, oxidized coenzyme, cholesterol dehydrogenase, surfactant (d3) and surfactant (d4).
  • a reagent comprising cholesterol esterase, oxidized coenzyme, cholesterol dehydrogenase, surfactant (dl), surfactant (d2) and a reagent for measuring reduced coenzyme.
  • a reagent comprising cholesterol esterase, oxidized coenzyme, cholesterol dehydrogenase, surfactant (d3), surfactant (d4) and a reagent for measuring reduced coenzyme.
  • the RLP-C quantification reagent of the present invention is preferably stored, distributed and used in the form of a kit.
  • the kit form is preferably a two-reagent system that uses two and three reagents.
  • the cholesterol ester-hydrolyzing enzyme and the cholesterol acid enzyme or cholesterol dehydrogenase may be contained in separate reagents, In particular, kits contained in the same reagent are preferred, and kits contained in the second reagent are preferred.
  • the enzyme that hydrolyzes the phospholipid is preferably contained in the second reagent, the power contained in either the first reagent, the second reagent or both.
  • Surfactant (dl) and surfactant (d2) are contained in either or both of the first reagent and the second reagent, while surfactant (dl) is contained in the first reagent. It is preferable.
  • Surfactant (d3) and surfactant (d4) are contained in either or both of the first reagent and second reagent, but surfactant (d3) may be contained in the first reagent. preferable.
  • the oxidized coenzyme is contained in at least one of the first reagent and the second reagent.
  • the hydrogen peroxide quantification reagent is contained in at least one of the first reagent and the second reagent.
  • the reagent contains an oxidized coupling chromogen, Respectively These compounds are preferably contained in separate reagents.
  • the reduced coenzyme quantification reagent is contained in at least one of the first reagent and the second reagent.
  • a reagent containing a surfactant (dl) and a part of a reagent for determining hydrogen peroxide is a reagent containing a surfactant (dl) and a part of a reagent for determining hydrogen peroxide.
  • a reagent containing a surfactant (d3) and a part of a hydrogen peroxide determination reagent is provided.
  • a reagent containing a surfactant (d2), an enzyme that hydrolyzes phospholipids, a cholesterol ester hydrolase, an oxidized coenzyme, and a cholesterol dehydrogenase is provided.
  • a reagent containing a surfactant (d3) A reagent containing a surfactant (d3).
  • Surfactant (d4) enzyme that hydrolyzes phospholipids, cholesterol ester A reagent containing a degrading enzyme, an oxidized coenzyme and cholesterol dehydrogenase.
  • a reagent containing a surfactant (d2), an enzyme that hydrolyzes phospholipids, a cholesterol ester hydrolase, an oxidized coenzyme, a cholesterol dehydrogenase, and a reducing coenzyme quantification reagent a surfactant (d2), an enzyme that hydrolyzes phospholipids, a cholesterol ester hydrolase, an oxidized coenzyme, a cholesterol dehydrogenase, and a reducing coenzyme quantification reagent.
  • a reagent containing a surfactant (d3) A reagent containing a surfactant (d3).
  • a reagent containing a surfactant (d4), an enzyme that hydrolyzes phospholipids, a cholesterol ester hydrolase, an oxidized coenzyme, a cholesterol dehydrogenase, and a reducing coenzyme quantification reagent a surfactant (d4), an enzyme that hydrolyzes phospholipids, a cholesterol ester hydrolase, an oxidized coenzyme, a cholesterol dehydrogenase, and a reducing coenzyme quantification reagent.
  • the RLP-C quantification reagent and kit of the present invention can be used for quantification of RLP-C in a sample.
  • Each component in the RLP-C quantification reagent and kit of the present invention comprises an enzyme that hydrolyzes the phospholipid described in the above RLP-C quantification method, a cholesterol ester hydrolase, a cholesterol acid enzyme, an oxidized form Coenzyme, cholesterol dehydrogenase, surfactant (dl), surfactant (d2), surfactant (d3), surfactant (d4), hydrogen peroxide quantification reagent and reduced coenzyme quantification reagent Can be used.
  • the above-mentioned aqueous medium, cyclodextrin or a derivative thereof, albumin, lipoprotein flocculant, enzyme activator, stabilizer, preservative are included as necessary.
  • Various salts for solubilizing proteins such as agents, interfering substance inhibitors, and globulins in biological samples may be contained.
  • the RLP-C quantification reagent and the enzyme in the present invention, the two surfactants, and the two surfactants may be dissolved in an aqueous medium at a concentration that is the concentration described in the RLP-C quantification method section. Made.
  • MOPS Good buffer; manufactured by Dojin Chemical Research Co., Ltd.
  • TOOS rinder reagent (oxidation coupling type chromogen); manufactured by Dojin Chemical Research Laboratory Co., Ltd.]
  • 4-Aminoantipyrine (Hanai ) Sodium sulfate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • pronon B-208 ⁇ POE / POB copolymer surfactant (dl)]; manufactured by NOF Corporation ⁇ , pronon ⁇ ⁇ -204 ⁇ ⁇ Copolymer [surfactant (dl)]; manufactured by Nippon Oil & Fats Co., Ltd. ⁇ , Wandersurf RL-100 ⁇ POE'POP alkyl ether [surfactant (d2)]; manufactured by Aoki Oil & Fat Co., Ltd. ⁇ , Wandersurf ID— 70 ⁇ ⁇ ⁇ short-chain branched alkyl ether [surfactant (d2)]; manufactured by Aoki Oil
  • POD Peroxidase 10 U / mL Ascorbate oxidase (AOD) 2 U / mL
  • RLP which also has the following 1st reagent and 2nd reagent power
  • CHER Cholesterol ester water-degrading enzyme
  • POD Peroxidase 10 U / mL Ascorbate oxidase (AOD) 2 U / mL
  • CHER Cholesterol ester water-degrading enzyme
  • Example 4 64 human fresh sera used in the quantification of Example 4 using the Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as the quantification method of Example 4 except that the kit of Example 2 is used instead of the kit of Example 1.
  • the RLP-C concentration in each sample was quantified.
  • Example 4 64 human fresh sera used in the quantification of Example 4 using the Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as the quantification method of Example 4 except that the kit of Example 3 is used instead of the kit of Example 1.
  • the RLP-C concentration in each sample was quantified.
  • Example 4 64 human fresh sera used in the quantification of Example 4 using the Hitachi 7170 automatic analyzer in the same manner as the quantification method of Example 4 except that the kit of Comparative Example 1 was used instead of the kit of Example 1.
  • the RLP-C concentration in each sample was quantified.
  • RLP-C concentration in serum samples of patients with type III hyperlipidemia was determined using the kits of RLP cholesterol “JIMR 0” (manufactured by Japan Antibody Laboratories), Examples 1-3 and Comparative Example 1 .
  • a serum standard solution whose RLP-C concentration was found to be 32.4 mgZdL from the measurement using RLP cholesterol “JIMRO” II (manufactured by Nippon Antibody Laboratories) was used as a standard product.
  • a diluted serum prepared by appropriately diluting the serum standard solution was used as a sample for preparing a calibration curve. The results are shown in Table 12.
  • VLDL remnants are particularly abundant in sera of patients with type III hyperlipidemia. Therefore, from the results of Table 12, in the quantification method of the present invention, the VLDL remnant contained in the VLDL remnant compared to the kit of Comparative Example 1 (the kit described in Example 1 of JP-A-2001-231597). It can be seen that the reactivity of cholesterol is improved. Also, RLP collection Compared with the quantification method using sterol “jIMRO” II, it can be seen that the quantification method of the present invention is highly reactive with LP-C.
  • Cholesterol ester water-degrading enzyme (CHER) 1 U / mL Cholesterol oxidase (CHOD) 3 U / mL
  • RLP-C quantification kits consisting of the first and second reagents, were prepared.
  • Cholesterol ester water-degrading enzyme (CHER) 1 U / mL Cholesterol oxidase (CHOD) 3 U / mL
  • Cholesterol ester hydrolase (CHER) 1 U / mL Cholesterol oxidase (CHOD) 3 U / mL
  • RLP-C quantification kits were prepared which were the first and second reagents.
  • Cholesterol ester water-degrading enzyme (CHER) 1 U / mL Cholesterol oxidase (CHOD) 3 U / mL
  • RLP-C quantification methods useful for the diagnosis of arteriosclerotic diseases are provided.

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Abstract

  試料の分離操作が不要なレムナント様リポ蛋白中のコレステロールを簡便に感度良く定量する定量方法、試薬およびキットを提供する。   試料を含有する水性媒体中、特定の界面活性剤の組み合わせ、ならびに、リン脂質を加水分解する酵素の存在下、試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロールを、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素（酸化型補酵素共存）と反応させて、生成した過酸化水素または還元型補酵素を定量することを特徴とする、試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロールの定量方法。

Description

明 細 書
レムナント様リポ蛋白（RLP)中のコレステロールの定量方法、試薬および キット
技術分野
[0001] 本発明は、臨床検査において動脈硬化症等の危険因子とされるレムナント様リポ蛋 白質 (以下、 RLPと略記する）中のコレステロールの定量方法、試薬およびキットに関 する。
背景技術
[0002] 血液中には、種々のリポ蛋白が含有されている。これらのリポ蛋白は比重の違いに より、カイロミクロン (以下、 CMと略記する）、超低密度リポ蛋白（以下、 VLDLと略記 する）、低密度リポ蛋白（以下、 LDLと略記する）、高密度リポ蛋白（以下、 HDLと略 記する）に分類されている。各リポ蛋白は、コレステロール、トリダリセライド、リン脂質、 蛋白質等の構成成分の割合が異なっており、生体内で異なる作用を有する。
[0003] 臨床検査において、 HDL中のコレステロールは動脈硬化症の危険因子として負の 因子、 LDL中のコレステロールは動脈硬化症の危険因子として正の因子とされてお り、臨床検査の分野で頻繁に測定されている。
また、脂質の代謝等に起因して生成するリポ蛋白質中のコレステロールが動脈硬 化症の危険因子として LDL中のコレステロールより密接な指標となることが示されて きている。脂質の代謝等に起因して生成するリポ蛋白質としては、例えば RLPがあげ られている。
[0004] 最近、免疫吸着法による RLP中のコレステロール（以下、 RLP— Cと略記する）の定 量法が開発された。本定量法においては、抗アポ A— Iモノクローナル抗体およびァ ポ B— 48を認識しな 、特異的抗アポ B— 100モノクローナル抗体を含有するァフィ- ティーゲルを用いたィムノアフィ-ティーク口マトグラフィにより血清から RLPを分離し 、この分離した RLPに含まれるコレステロールが定量される。本定量法に適用される RLP中のコレステロール定量用試薬が、（株）日本抗体研究所カゝら販売されている [ 製品名： RLP—コレステロール「JIMRO」II] (非特許文献 1、非特許文献 2参照)。こ の免疫吸着法による RLP— Cの定量法については、厚生労働省より保険点数が付 与されている。
[0005] し力しながら本方法は抗体を使用したァフィユティークロマトグラフィー方法を使用 するもので、試料の分離操作を必要とする等操作が煩雑で時間が力かる。
また、試料の分離操作が不要な RLP— Cを簡便に感度良く測定する方法が知られ ている (特許文献 1参照)。
特許文献 1 :特開 2001— 231597号公報
非特許文献 1 :動脈硬化、 25(9,10)、 371 (1998)
非特許文献 2 :タリ-カル ケミストリー (Clinical Chemistry), 48(2)、 217
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の目的は、試料の分離操作が不要な RLP— Cを簡便に感度良く定量する 定量方法、試薬およびキットを提供することにある。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明は、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸ィ匕酵素も しくはコレステロール脱水素酵素力 特定の界面活性剤の組み合わせおよびリン脂 質を加水分解する酵素の存在下、レムナント様リポ蛋白質コレステロールに特異的に 作用するという知見に基づき完成された。本発明は、下記（1)〜（20)に関する。
[0008] (1) 試料を含有する水性媒体中、（a) (i)ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共 重合体、ポリオキシエチレンスチレン化フエ-ルエーテルおよびポリオキシエチレンポ リオキシプロピレン長鎖分岐アルキルエーテル力 なる群より選択される一種または 二種以上の界面活性剤 [以下、界面活性剤（dl)という]と、ポリオキシエチレンポリオ キシプロピレンアルキルァリールエーテル、ポリオキシエチレンアルキルァリールエー テル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルおよびポリオキシェ チレンポリオキシプロピレン短鎖分岐アルキルエーテル力 なる群より選択される一 種または二種以上の界面活性剤 [以下、界面活性剤 (d2)という]との組み合わせ、ま たは、（ii)ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体 [以下、界面活性剤（d3) という]と、ポリオキシエチレンアルキルァリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキ シプロピレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレン短鎖分 岐アルキルエーテル力 なる群より選択される一種または二種の界面活性剤 [以下、 界面活性剤 (d4) t ヽぅ]との組み合わせ、並びに (b)リン脂質を加水分解する酵素の 存在下、試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロールに、 （c)コレステロールエステ ル加水分解酵素およびコレステロール酸ィ匕酵素または (d)酸化型補酵素の存在下 にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を作用さ せ、過酸ィヒ水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素または還元 型補酵素を定量することを特徴とする試料中のレムナント様コレステロールの定量方 法。
[0009] (2) 過酸化水素の定量がパーォキシダーゼの存在下、生成した過酸化水素を酸 化発色型色原体と反応させ、生成した色素を定量することによって行われる前記（1) 記載の方法。
(3) 還元型補酵素の定量が反応液の吸光度を測定することによって行われる前 記（1)記載の方法。
[0010] (4) 還元型補酵素の定量が生成した還元型補酵素を還元発色型色原体と反応さ せ、生成した色素を定量することによって行われる前記（1)記載の方法。
(5) ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体が一般式 (I)
[0011] [化 1]
R O - ( C 2 H4 0) A ( C 4 H s O) B ( C 2 H4 0) H ( I )
[0012] (式中、 A、 Bおよび Cは同一または異なって 1〜200の整数を表し、 Rは、水素原子 、直鎖または分岐のアルキルを表す)で表される界面活性剤である前記（1)〜 (4)の いずれかに記載の方法。
(6) リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼ0、ホスホリパーゼ Cまたはホス ホリパーゼ A2である前記（1)〜（5)の 、ずれかに記載の方法。
[0013] (7) リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、コレス テロール酸ィ匕酵素、および界面活性剤（dl)と界面活性剤（d2)との組み合わせ、ま たは、界面活性剤 (d3)と界面活性剤 (d4)との組み合わせを含有することを特徴とす る試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用試薬。 (8) さらに過酸化水素定量用試薬を含有する前記 (7)記載の試薬。
[0014] (9) リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、コレス テロール脱水素酵素、酸化型補酵素、および界面活性剤 (dl)と界面活性剤 (d2)と の組み合わせまたは界面活性剤 (d3)と界面活性剤 (d4)との組み合わせを含有する ことを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用試薬。
(10) さらに還元型補酵素定量用試薬を含有する前記 (9)記載の試薬。
[0015] (11) ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体が一般式 (I)
[0016] [化 2]
R O - ( C 2 H4 0) A ( C 4 H s O) B ( C 2 H4 0) H ( I )
[0017] (式中、 A、 Bおよび Cは同一または異なって 1〜200の整数を表し、 Rは、水素原子 、直鎖または分岐のアルキルを表す)で表される界面活性剤である前記（7)〜（10) の！、ずれかに記載の試薬。
(12) リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼ0、ホスホリパーゼ Cまたはホ スホリパーゼ A2である前記（7)〜（11)の 、ずれかに記載の試薬。
[0018] (13) 界面活性剤 (dl)を含有する第 1試薬と、リン脂質を加水分解する酵素、コレ ステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸ィ匕酵素を含有する第 2試 薬とを含有し、かつ、界面活性剤 (d2)を第 1試薬および第 2試薬の少なくとも一方に 含有することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キット
(14) 界面活性剤 (d3)を含有する第 1試薬と、リン脂質を加水分解する酵素、コレ ステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸ィ匕酵素を含有する第 2試 薬とを含有し、かつ、界面活性剤 (d4)を第 1試薬および第 2試薬の少なくとも一方に 含有することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キット
[0019] (15) さらに過酸化水素定量用試薬を第 1試薬、第 2試薬の少なくとも一方に含有 する前記（ 13)または（14)記載のキット。
(16) 界面活性剤 (dl)を含有する第 1試薬と、リン脂質を加水分解する酵素、コレ ステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第 2 試薬とを含有し、界面活性剤 (d2)を第 1試薬および第 2試薬の少なくとも一方に含 有し、かつ、酸化型補酵素を第 1試薬および第 2試薬の少なくとも一方に含有するこ とを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キット。
[0020] (17) 界面活性剤 (d3)を含有する第 1試薬と、リン脂質を加水分解する酵素、コレ ステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第 2 試薬とを含有し、界面活性剤 (d4)を第 1試薬および第 2試薬の少なくとも一方に含 有し、かつ、酸化型補酵素を第 1試薬および第 2試薬の少なくとも一方に含有するこ とを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キット。
[0021] (18) さらに還元型補酵素定量用試薬を第 1試薬、第 2試薬の少なくとも一方に含 有する前記（16)または（17)記載のキット。
( 19) ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体が一般式 (I)
[0022] [化 3]
R O - ( C 2 H4 0) A ( C 4 H s O) B ( C 2 H4 0) H ( I )
[0023] (式中、 A、 Bおよび Cは同一または異なって 1〜200の整数を表し、 Rは、水素原子 、直鎖または分岐のアルキルを表す)で表される界面活性剤である前記（ 13)、（ 15) 、（16)または（18)記載のキット。
(20) リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼ0、ホスホリパーゼじ、または 、ホスホリパーゼ A2である前記（13)〜（19)のいずれかに記載のキット。
発明の効果
[0024] 本発明により、試料の分離操作が不要な RLP— Cを簡便に感度良く定量する方法 、試薬およびキットが提供される。
図面の簡単な説明
[0025] [図 1]RLP コレステロール「JIMRO」II (日本抗体研究所社製)を用いた定量法と実 施例 4の定量法との相関図を表す。
[図 2]RLP コレステロール「JIMRO」 II (日本抗体研究所社製)を用 、た定量法と実 施例 5の定量法との相関図を表す。
[図 3]RLP コレステロール「JIMRO」 II (日本抗体研究所社製)を用 ヽた定量法と実 施例 6の定量法との相関図を表す。 [図 4]RLP—コレステロール「JIMRO」 II (日本抗体研究所社製)を用 ヽた定量法と比 較例 2の定量法との相関図を表す。
[図 5]RLP—コレステロール「JIMRO」 II (日本抗体研究所社製)を用 ヽた定量法と実 施例 11の定量法との相関図を表す。
[図 6]RLP—コレステロール「JIMRO」 II (日本抗体研究所社製)を用 、た定量法と実 施例 12の定量法との相関図を表す。
[図 7]RLP—コレステロール「JIMRO」 II (日本抗体研究所社製)を用いた定量法と実 施例 13の定量法との相関図を表す。
[図 8]RLP—コレステロール「JIMRO」 II (日本抗体研究所社製)を用 、た定量法と実 施例 14の定量法との相関図を表す。
発明を実施するための最良の形態
[0026] 本発明にお 、て、「レムナント様リポ蛋白（RLP)」と ヽぅ用語は、 VLDLレムナントと CMレムナントをあわせたリポ蛋白を意味する。また、「レムナント様リポ蛋白コレステ ロール (RLP— C)」という用語は、 RLP中のエステル型コレステロールおよび遊離型 コレステロールを合わせた意味で使用される。従って、 RLP— Cとは、 VLDLレムナ ント中のエステル型コレステロール、 VLDLレムナント中の遊離型コレステロール、 C Mレムナント中のエステル型コレステロールおよび CMレムナント中の遊離型コレステ 口ールを合わせたものである。
本発明の定量方法によって全血、血漿、血清等の試料中の RLP— Cを定量できる
[0027] 本発明の特徴は、リン脂質を加水分解する酵素の存在下に、 RLP— Cに特異的に コレステロール定量反応に用いられる酵素を作用させる界面活性剤として、ポリオキ シエチレンポリオキシブチレン共重合体 (以下、 POE'POB共重合体と略記する）、 ポリオキシエチレンスチレン化フエ-ルエーテル（以下、 POEスチレン化フエ-ルェ 一テルと略記する）およびポリオキシエチレンポリオキシプロピレン長鎖分岐アルキル エーテル (以下、 POE · POP長鎖分岐アルキルエーテルと略記する）力もなる群より 選択される一種または二種以上の界面活性剤 [以下、界面活性剤 (dl)という]と、ポ リオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルァリールエーテル（以下、 POE · POP アルキルァリールエーテルと略記する）、ポリオキシエチレンアルキルァリールエーテ ル（以下、 POEアルキルァリールエーテルと略記する）、ポリオキシエチレンポリオキ シプロピレンアルキルエーテル（以下、 POE · POPアルキルエーテルと略記する）お よびポリオキシエチレンポリオキシプロピレン短鎖分岐アルキルエーテル（以下、 PO E · POP短鎖分岐アルキルエーテルと略記する）力もなる群より選択される一種また は二種以上の界面活性剤 [以下、界面活性剤 (d2)という]との組み合わせ、または、 ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体（以下、 POE · POP共重合体と略 記する） [以下、界面活性剤（d3)という]と、ポリオキシエチレンアルキルァリールエー テル（以下、 POEアルキルァリールエーテルと略記する）、ポリオキシエチレンポリオ キシプロピレンアルキルエーテル（以下、 POE · POPアルキルエーテルと略記する） およびポリオキシエチレンポリオキシプロピレン短鎖分岐アルキルエーテル（以下、 P OE · POP短鎖分岐アルキルエーテルと略記する）力 なる群より選択される一種また は二種の界面活性剤 [以下、界面活性剤 (d4) t 、う]との組み合わせが優れた効果 を奏することにある。
[0028] すなわち、これらの界面活性剤の組み合わせは、リン脂質を加水分解する酵素の 存在下、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸ィ匕酵素もしく はコレステロール脱水素酵素を RLP— Cに特異的に作用させる。
本発明方法によれば試料中の RLP— Cは、水性媒体中、リン脂質を加水分解する 酵素の存在下にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸ィ匕酵 素もしくはコレステロール脱水素酵素を RLP— Cに特異的に作用させる界面活性剤 の組み合わせ、すなわち、（i)界面活性剤 (dl)と界面活性剤 (d2)との組み合わせ、 または、（ii)界面活性剤 (d3)と界面活性剤 (d4)との組み合わせの存在下、試料中 の RLP— Cに、（c)コレステロールエステルカ卩水分解酵素およびコレステロール酸化 酵素または (d)酸化型補酵素の存在下にコレステロールエステル加水分解酵素およ びコレステロール脱水素酵素を作用させ、過酸化水素または還元型補酵素を生成さ せ、生成した過酸ィヒ水素または還元型補酵素を定量することにより定量することがで きる。
[0029] 試料中の RLP— Cに、酸素の存在下にコレステロールエステルカ卩水分解酵素およ びコレステロール酸化酵素を作用させることにより、試料中の RLP中のエステル型コ レステロールがコレステロールエステル加水分解酵素の作用により遊離型コレステロ ールに変換され、該変換されて生成する遊離型コレステロールおよび RLP中の遊離 型コレステロールと酸素とから、コレステロール酸ィ匕酵素の作用によって過酸ィ匕水素 が生成する。
[0030] また試料中の RLP— Cに、酸化型補酵素の存在下にコレステロールエステルカロ水 分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を作用させることにより、試料中の RLP中 のエステル型コレステロールがコレステロールエステル加水分解酵素の作用により遊 離型コレステロールに変換され、該変換されて生成する遊離型コレステロールおよび RLP中の遊離型コレステロールと酸ィ匕型補酵素力 コレステロール脱水素酵素の作 用により還元型補酵素が生成する。
[0031] 酵素反応は、界面活性剤 (dl)および界面活性剤 (d2)の組み合わせ、または、界 面活性剤（d3)および界面活性剤（d4)の組み合わせ、ならびに、リン脂質を加水分 解する酵素の存在下、コレステロールの定量に必要なコレステロールエステルカロ水 分解酵素およびコレステロール酸ィ匕酵素もしくはコレステロール脱水素酵素（コレス テロール脱水素酵素を用いる場合には酸化型補酵素が必要)を含有する緩衝液等 の水溶液中で行われる。
界面活性剤 (dl)および界面活性剤 (d2)の組み合わせ、および、界面活性剤 (d3
)および界面活性剤 (d4)の組み合わせにお 、ては、界面活性剤 (dl)、界面活性剤
(d2)、界面活性剤 (d3)、界面活性剤 (d4)として、界面活性剤 (dl)〜 (d4)を構成 する界面活性剤を一種または二種以上用いてもょ 、。
[0032] 界面活性剤 (dl)および界面活性剤 (d2)の組み合わせとしては、第 1表〜第 7表に 示す組み合わせが例示される。
[0033] [表 1] 第 1表
Figure imgf000010_0001
2] 第 2表
Figure imgf000011_0001
3] 第 3表
Figure imgf000012_0001
4] 第 4表
界面活性剤 （ d 1 ) 界面活性剤 （d 2)
P0E-P0B共重合体 POE-POPアルキルァリ ルエ テル
P0Eスチレンィ匕フエニルエーテル
P0E-P0B共重合体 P0Eアルキルァリ ルエ テル
P0Eスチレンィ匕フエニルエーテル
P0E-P0B共重合体 P0E-P0Pアルキルエ テル
P0Eスチレンィ匕フエニルエーテル
P0E-P0B共重合体 P0E-P0P短鎖分岐アルキルエ テル
P0Eスチレンィ匕フエニルエーテル
P0E-P0B共重合体 P0E-P0Pアルキルァリ ルエ テル
P0Eスチレンィ匕フエニルエーテル P0Eアルキルァリ ルエ テル
P0E-P0B共重合体 P0E-P0Pアルキルァリ ルエ テル
P0Eスチレンィ匕フエニルエーテル P0E-P0Pアルキルエ テル
P0E-P0B共重合体 P0E-P0Pアルキルァリ ルエ テル
P0Eスチレンィ匕フエニルエーテル POE-POP短鎖分岐アルキルエ テル
POE-POB共重合体 POEアルキルァリ ルエ テル
P0Eスチレンィ匕フエニルエーテル POE-POPアルキルエ テル
POE-POB共重合体 POEアルキルァリ ルエ テル
P0Eスチレンィ匕フエニルエーテル POE-POP短鎖分岐アルキルエ テル
POE-POB共重合体 POE-POPアルキルエ テル
P0Eスチレンィ匕フエニルエーテル POE-POP短鎖分岐アルキルエ テル
P0E-P0B共重合体 POE-POPアルキルァリ ルエ テル
P0Eスチレンィ匕フエニルエーテル POEアルキルァリ ルエ テル
POE-POPアルキルエ テル
P0E-P0B共重合体 POE-POPアルキルァリ ルエ テル
P0Eスチレンィ匕フエニルエーテル POEアルキルァリ ルエ テル
POE-POP短鎖分岐アルキルエテル
P0E-P0B共重合体 POE-POPアルキルァリ ルエ テル
P0Eスチレンィ匕フエニルエーテル POE-POPアルキルエ テル
POE-POP短鎖分岐アルキルエテル
P0E-P0B共重合体 POEアルキルァリ ルエ テル
P0Eスチレンィ匕フエニルエーテル POE-POPアルキルエ テル
POE-POP短鎖分岐アルキルエ テル
P0E-P0B共重合体 POE-POPアルキルァリ ルエ テル
P0Eスチレンィ匕フエニルエーテル POEアルキルァリ ルエ テル
POE-POPアルキルエ テル
POE-POP短鎖分岐アルキルエテル 5] 第 5表
Figure imgf000014_0001
6] 第 6表
Figure imgf000015_0001
7] 第 7表
Figure imgf000016_0001
界面活性剤 (dl)および界面活性剤 (d2)の糸且み合わせの中でも、リン脂質を加水 分解する酵素の存在下にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロ一 ル酸ィ匕酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をレムナント様リポ蛋白コレステロール に特異的に作用させる作用の強 ヽ組合せが好ま 、。
具体的には、第 1表に記載された POE'POB共重合体と界面活性剤 (d2)との組 み合わせが好ましい。
POE'POB共重合体と界面活性剤 (d2)との組み合わせの中でも、第 8表に示す 以下の組み合わせがより好ま U、。
[0041] [表 8]
第 8表
Figure imgf000017_0001
[0042] 界面活性剤 (d3)および界面活性剤 (d4)の組み合わせとしては、次の第 9表に示 す組み合わせが例示される。
[0043] [表 9]
第 9表
Figure imgf000018_0001
[0044] 界面活性剤 (d3)および界面活性剤 (d4)の糸且み合わせの中でも、リン脂質を加水 分解する酵素の存在下にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロ一 ル酸ィ匕酵素もしくはコレステロール脱水素酵素を RLP— Cに特異的に作用させる作 用の強 、組合せが好まし 、。
具体的には、第 10表に示す以下の組み合わせが好ましい。
[表 10]
第 1 0表
Figure imgf000018_0002
[0045] 反応によって生成する過酸ィヒ水素または還元型補酵素の定量はそれ自体公知の 方法によって行われる。
酵素反応の反応液中には、必要に応じて、シクロデキストリンもしくはその誘導体、 アルブミンまたはリポ蛋白凝集剤の存在下に行うこともできる。シクロデキストリンもしく はその誘導体、アルブミンまたはリポ蛋白凝集剤によってレムナント様リポ蛋白以外 のリポ蛋白コレステロールに酵素が作用するのを抑制することができるので好ましい。
[0046] また、酵素反応の反応液中には、必要に応じて、 RLP— Cの定量反応の特異性に 影響を及ぼさない範囲でコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロ一 ル酸ィ匕酵素もしくはコレステロール脱水素酵素を活性ィ匕するためによく使用される酵 素活性化剤、安定化剤、防腐剤、干渉物抑制剤、生体試料中のグロブリンなどの蛋 白質を可溶ィ匕するための種々の塩類を共存させることもできる。
[0047] コレステロールエステル加水分解反応、遊離コレステロールの酸化または脱水素反 応は、リン脂質を加水分解する酵素、および界面活性剤 (dl)と界面活性剤活性剤（ d2)との組み合わせ、もしくは、界面活性剤 (d3)と界面活性剤 (d4)との組み合わせ の存在下に、順次行うことができる。また、試料と界面活性剤とを予め水溶液中接触 させ、次いで、この溶液にリン脂質を加水分解する酵素、コレステロールの反応に関 与する酵素を添カ卩して、コレステロールの反応を行うこともできる。コレステロールの 反応は、 RLP— Cの定量に必要な成分を全て含有する水溶液中で行わせることもで きるが、 RLP— Cの定量に必要な成分を 2〜3のグループに分けて、分けられた成分 を順次、反応液に添加することによつても行うことができる。 RLP— Cの定量は、好ま しくは、後述の RLP— C定量用キットを用いて行われる。
[0048] 水性媒体中、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸ィ匕酵素およ びコレステロール脱水素酵素は、通常 0. 001〜400UZmLで、好ましくは 0. 01〜 200UZmL、より好ましくは 0. 05〜： LOOUZmLの濃度で用いられる。
水性媒体中、リン脂質を加水分解する酵素の濃度は、特に制限はないが、 0. 001 〜400U/mI^力 S好ましく、 0. 01〜200U/mI^力 Sより好ましく、 0. 05〜： LOOU/m Lが特に好ましい。
[0049] 水性媒体中、界面活性剤 (dl)、界面活性剤活性剤 (d2)、界面活性剤 (d3)およ び界面活性剤（d4)の濃度は、それぞれに、 0. 001〜5 (wZv) %が好ましぐ 0. 00 5〜2. 5 (wZv) %がより好ましぐ 0. 05〜： L (wZv) %が特に好ましい。
酵素反応は通常 10〜50°C、好ましくは 20〜40°Cの温度で行われ、通常 2〜30分 で完了する。 [0050] 生成した過酸ィ匕水素は例えばパーォキシダーゼの存在下過酸ィ匕水素と酸ィ匕によ つて色素に変換される色原体との反応によって色素を生成させ、反応液の吸光度の 変化を例えば生成した色素の吸収極大波長で測定することにより定量される。また生 成した過酸ィ匕水素は例えばィ匕学発光物質、例えばルミノール、イソルミノール、ルシ ゲニン、アタリジ-ゥムエステル等と過酸ィ匕水素とを反応させてフオトンを生成させ、 生成したフオトンを定量することにより定量される。
[0051] 還元型補酵素は例えば酵素反応によって生成した還元型補酵素含有液の吸光度 を 300 500 好ましくは 330 400nm、より好ましくは 340nm付近で測定する ことによって定量できる。また、生成した還元型補酵素は例えばジァホラーゼまたは 電子キャリアーの存在下還元型補酵素と還元によって色素に変換される色原体との 反応によって色素を生成させ、反応液の吸光度の変化を例えば生成した色素の吸 収極大波長で測定することによって定量される。電子キャリアーの例は 1ーメトキシー 5—メチルフエナジゥムメチルサルフェートである。
[0052] 試料中の RLP— Cの濃度は、例えば予め既知の濃度の RLP— Cを含有する試料 を用いて、コレステロール濃度と過酸ィ匕水素または還元型補酵素の量との関係を示 す検量線を作成し、この検量線から求めることができる。
コレステロールエステルカ卩水分解酵素はコレステロールエステルをカ卩水分解できる 酵素、例えばコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等が用いられ、動 物、植物または微生物由来または、遺伝子工学的な手法により製造される酵素、化 学的に修飾された酵素等を使用することができる。化学的に修飾された酵素としては 、例えばポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポ リプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖 類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能 を有する基等の化学修飾基で修飾された酵素が含まれる。特にポリエチレングリコー ルを主成分とする基で修飾された酵素が好ましい。水溶性多糖類としては、例えば デキストラン、プルラン、可溶性デンプン等が含まれる。
[0053] 化学的に修飾するための試薬 (ィ匕学修飾剤）は、上記の化学修飾基と、酵素のアミ ノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得る官能基または構造とを併せ持 つ化合物等が含まれる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基または構造は、例えば カルボキシル基、活性エステル基 (N ヒドロキシサクシンイミド基等）、酸無水物、酸 塩化物、アルデヒド、エポキシド基、 1, 3 プロパンスルトン、 1 , 4 ブタンスルトン等 が含まれる。酵素中のカルボキシル基と反応し得る官能基または構造は、例えばアミ ノ基を含む。酵素中のスルフヒドリル基と反応性がある基または構造は、例えばマレイ ミド基、ジスルフイド、 aーハロエステル（ α ョードエステル等）等を含む。
[0054] 化学修飾剤の例は、ポリエチレングリコールを主成分とする基と Ν ヒドロキシサク シンイミド基とを有するサンブライト VFM— 4101、サンブライト MEAC— 50HS、サ ンブライト MEC— 50HS (V、ずれも日本油脂社製）、ポリアルキレングリコールを主成 分とする基と酸無水物構造とを有するサンブライト AKMシリーズ (例えば、サンブライ トAKM—1510等）、サンブラィトADMシリーズ、サンブライト ACMシリーズ（いずれ も日本油脂社製）、ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有す る EPOX— 3400、 M— EPOX— 5000 (いずれも Sheawater Polymers社製）、キ レート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミンー N, N, Ν' , Ν" , Ν" ペンタ無水酢酸（DTPA anhydride；同仁化学研究所社製）、ポリウレ タン修飾用の活性ィ匕ポリウレタン P4000 (ベーリンガーマンノヽィム社製）、デキストラ ン修飾用のデキストラン T40、活性化 TCT (ベーリンガーマンノヽィム社製)等を含む。
[0055] 酵素の化学修飾は、例えば以下の方法で行うことができる。
まず、コレステロールエステルカ卩水分解酵素を ρΗ8. 0以上の緩衝液、例えば HEP ES緩衝液に溶解し、 0〜55°Cで 0. 01〜500倍モル量の化学修飾剤を添カ卩し、 5分 〜5時間攪拌する。実際の酵素反応においては、化学的に修飾されたコレステロ一 ルエステル加水分解酵素として、この反応液そのもののみならず、必要に応じて限外 濾過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去したものも、使用することもできる。
[0056] コレステロール酸ィ匕酵素は動物、植物または微生物由来酵素、遺伝子工学的な手 法により製造される酵素、化学的に修飾された酵素等を用いることができる。
化学修飾酵素は、前述の化学修飾方法により作製することができる。
コレステロール脱水素酵素は、酸ィ匕型補酵素の存在下にコレステロールを酸ィ匕して 還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれば、動物、植物または微生物由 来の酵素、遺伝子工学的な手法により製造される酵素、化学的に修飾された酵素を 用いることができる。化学的に修飾された酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用い て、前述の化学修飾方法により作製することができる。
[0057] リン脂質を加水分解する酵素としては、リン脂質を分解する能力を有する酵素であ れば特に制限されない。例えば動物、植物および微生物由来のリン脂質を分解する 酵素があげられる。具体的なリン脂質を分解する酵素としては、例えばホスホリパー ゼ0、ホスホリパーゼじ、ホスホリパーゼ A2、リゾホスホリパーゼ等があげられる。 本発明のコレステロール脱水素酵素を用いる定量法において使用される酸ィ匕型補 酵素の例は、 NAD、 NADP、チォ NAD、チォ NADPである。
[0058] 本発明において使用される界面活性剤（dl)は、本発明において使用される界面 活性剤（d2)と組み合わさって、リン脂質を加水分解する酵素の存在下、コレステロ一 ルエステル加水分解酵素およびコレステロール酸ィ匕酵素もしくはコレステロール脱水 素酵素を RLP— Cに特異的に作用させる機能を有する。界面活性剤 (dl)および界 面活性剤（d2)は、それぞれ単独で使用された場合には、必ずしも、コレステロール エステル加水分解酵素およびコレステロール酸ィ匕酵素もしくはコレステロール脱水素 酵素を RLP— Cに特異的に作用させる機能が高い必要はない。
[0059] 本発明において使用される界面活性剤（d3)は、本発明において使用される界面 活性剤（d4)と組み合わさって、リン脂質を加水分解する酵素の存在下、コレステロ一 ルエステル加水分解酵素およびコレステロール酸ィ匕酵素もしくはコレステロール脱水 素酵素を RLP— Cに特異的に作用させる機能を有する。界面活性剤 (d3)および界 面活性剤（d4)は、それぞれ単独で使用された場合には、必ずしも、コレステロール エステル加水分解酵素およびコレステロール酸ィ匕酵素もしくはコレステロール脱水素 酵素を RLP— Cに特異的に作用させる機能が高い必要はない。
[0060] POE'POB共重合体は、ポリオキシエチレンとポリオキシブチレンとのランダム重合 体、ブロック重合体を含み、例えば一般式 (I)
[0061] [化 4]
R O - ( C 2 H4 0) A ( C 4 H s O) B ( C 2 H4 0) H ( I ) [0062] (式中、 A、 Bおよび Cは同一または異なって 1〜200の整数を表し、 Rは水素原子、 直鎖または分岐のアルキルを表す)で表される化合物 [以下、化合物 (I)と称する]等 が挙げられる。一般式 (I)中、 Rは水素原子が好ましい。
化合物 (I)における直鎖または分岐のアルキルは、炭素数が 1〜30の、例えばメチ ル、ェチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、 sec—ブチル、 tert—ブチ ル、ペンチノレ、イソペンチル、ネオペンチル、へキシル、イソへキシル、ヘプチル、イソ ヘプチル、ォクチル、イソオタチル、ノエル、イソノエル、デシル、イソデシル、ゥンデシ ル、イソゥンデシル、ドデシル、イソドデシル、トリデシル、イソトリデシル、テトラデシル 、イソテトラデシル、ペンタデシル、イソペンタデシル、へキサデシル、イソへキサデシ ル、ヘプタデシル、イソへプタデシル、ォクタデシル、イソォクタデシル、ノナデシル、 イソノナデシル、ィコシル、イソィコシル、へネィコシル、イソへネイルコシル、ドコシル (ベへニル）、イソドコシル、トリコシル、イソトリコシル、テトラコシル、イソテトラコシル、 ペンタコシル、イソペンタコシル、へキサコシル、イソへキサコシル、ヘプタコシル、ィ ソヘプタコシル、ォクタコシル、イソォクタコシル、ノナコシル、イソノナコシル、トリアコ ンシル、イソトリアコンシル、等を含む。
[0063] ポリオキシブチレン部分の分子量としては、 700以上が好ましぐ 1, 000以上がより 好ましぐ 1, 500以上が特に好ましい。
化合物 (I)の具体例は、プロノン B— 204、プロノン B— 208 (以上、日本油脂社製） を含む。
POEスチレン化フエ-ルエーテルの例は、 BLAUNON DSP— 9、 BLAUNON DSP- 12. 5、 BLAUNON DSP— 20、 BLAUNON DSP— 10、 BLAUNO
N TSP— 5、 BLAUNON TSP— 7. 5、 BLAUNON TSP— 16、 BLAUNON TSP— 20、 BLAUNON TSP— 50 (以上、青木油脂社製)等であって、市販され ている。
[0064] ΡΟΕ· POP長鎖分岐アルキルエーテルにおける長鎖分岐アルキルとしては、例え ば炭素数 20〜30の分岐アルキル、例えばイソィコシル、オタチルドデシル、イソへネ ィコシル、イソドコシル、イソトリコシル、イソテトラコシル、デシルテトラデシル、イソペン タコシル、イソへキサコシル、ドデシルテトラデシル、イソへプタコシル、イソォクタコシ ル、イソノナコシル、イソトリアコンシル等が挙げられる。 ΡΟΕ· POP長鎖分岐アルキ ルエーテルの具体例は、ュ-ループ MT— 0620B (日本油脂社製)等であり、巿販さ れている。
POE · POPアルキルァリールエーテルおよび POEアルキルァリールエーテルにお けるアルキルとしては、例えば炭素数 8以上の、たとえばオタチル、ノ-ル等が挙げら れる、ァリールとしては、例えばフエニル、ナフチル等が挙げられる。ァリールとしては 、フエ-ルが好ましい。
[0065] ΡΟΕ· POPアルキルエーテルにおけるアルキルとしては、炭素数 6〜30の、例えば へキシル、ヘプチル、ォクチル、ノエル、デシル、ゥンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリ デシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、へキサデシル（セチル）、ヘプタデ シル、ォクタデシル (ステァリル）、ノナデシル、ィコシル、へネィコシル、ドコシル（ベ へ二ノレ）、トリコシノレ、テトラコシル、ペンタコシル、へキサコシル、ヘプタコシル、ォクタ コシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられる。
POE · POP短鎖分岐アルキルエーテルにおける短鎖分岐アルキルとしては、炭素 数 6〜19の分岐アルキル、例えばイソへキシル、イソへプチル、イソオタチル、イソノ -ル、イソデシル、イソゥンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、ィ ソペンタデシル、イソへキサデシル、イソへプタデシル、イソォクタデシル、イソノナデ シル等が挙げられる。
[0066] ΡΟΕ· POPアルキルァリールエーテルとしては、例えばポリオキシエチレンポリオキ シプロピレンアルキルフエ-ルエーテル等が挙げられる。具体例は、ェマルゲン L— 40 (花王社製）、ァクロネセス KP— 189R (日本油脂社製)等であって、市販されてい る。
POEアルキルァリールエーテルとしては、例えばポリオキシエチレンアルキルフエ -ルエーテル等が挙げられる。具体例は、ェマルゲン 911、ェマルゲン 810 (以上、 花王社製）、ノ-オン HS— 210、ノ-オン HS— 215、ノ-オン NS— 208. 5、ノ-ォ ン HS— 208 (以上、日本油脂社製)等であって、市販されている。
[0067] POE · POPアルキルエーテルおよび POE · POP分岐アルキルエーテルとしては、 親水性一親油性バランス（HLB)が 9〜20の POE'POPアルキルエーテルおよび P OE · POP分岐アルキルエーテルが好まし!/、。 POE · POPアルキルエーテルの具体 例は、ワンダサーフ RL— 100、ワンダサーフ S— 1000 (以上、青木油脂社製)等で あって、市販されている。 ΡΟΕ· POP短鎖分岐アルキルエーテルの具体例は、ワン ダサーフ ID— 70、ワンダサーフ ID— 90 (以上、青木油脂社製)等であって、巿販さ れている。
[0068] ΡΟΕ· POP共重合体としては、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのランダ ム重合体、ブロック重合体を含み、例えば一般式 (II)
[0069] [化 5]
R O - ( C 2 H4 0) A ( C 3 H 6 0) B— ( C 2 H4 0) H ( I I )
[0070] (式中、 A、 Bおよび Cは同一または異なって 1〜200の整数を表し、 Rは水素原子、 直鎖または分岐のアルキルを表す)で表される化合物等が挙げられる。一般式 (II) 中、 Rは水素原子が好ましい。
化合物 (Π)における直鎖または分岐のアルキルは、前述の化合物 (I)における直 鎖または分岐のアルキルと同様のものが挙げられる。
[0071] 本ィ匕合物におけるポリオキシプロピレン部分の分子量としては、 2, 050以上が好ま しぐ 2, 750以上がより好ましぐ 3, 250以上が特に好ましい。
具体例は、プル口ニック F— 108、プル口-ック L— 121、プル口-ック L— 122、プ ルロニック L— 101、プル口ニック L— 103 (以上、旭電化工業社製）、プロノン 102、 プロノン 104、プロノン 201、プロノン 204、プロノン 208、プロノン 202B (以上、 日本 油脂社製)等であって、市販されている。
[0072] 水性媒体は、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等を含み、緩衝液が好ま ヽ。緩 衝液に用いる緩衝剤の例はトリス (ヒドロキシメチル)ァミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤 、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等があげられる。
[0073] グッドの緩衝剤としては、例えば 2 モルホリノエタンスルホン酸（MES)、ビス（2— ヒドロキシェチル)イミノトリス（ヒドロキシメチル)メタン（Bis— Tris)、 N— (2—ァセトァ ミド)イミノニ酢酸 (ADA)、ピペラジン一 N, N，一ビス（2—エタンスルホン酸） (PIPE S)、 N— (2 ァセトアミド） 2 アミノエタンスルホン酸 (ACES)、 3 -モルホリノ一 2 —ヒドロキシプロパンスルホン酸（MOPSO)、 N, N ビス（2—ヒドロキシェチル） 2 アミノエタンスルホン酸（BES)、 3—モルホリノプロパンスルホン酸（MOPS)、 N— 〔トリス（ヒドロキシメチル)メチル〕 2 アミノエタンスルホン酸 (TES)、 2— [4- (2- ヒドロキシェチル） 1—ピペラジ -ル〕エタンスルホン酸（HEPES)、 3—〔N, N ビ ス（2—ヒドロキシェチル）ァミノ〕— 2—ヒドロキシプロパンスルホン酸（DIPSO)、 N— 〔トリス（ヒドロキシメチル)メチル〕 - 2-ヒドロキシ 3—ァミノプロパンスルホン酸 (TA PSO)、ピペラジン一 N, N，一ビス（2 ヒドロキシプロパンスルホン酸）（POPSO)、 3 —〔4— (2—ヒドロキシェチル） 1—ピペラジ -ル〕 2—ヒドロキシプロパンスルホン 酸（HEPPSO)、 3—〔4一（2 ヒドロキシェチル） 1ーピぺラジュル〕プロパンスル ホン酸〔（H) EPPS〕、 N 〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Tricine)、 N, N
—3 ァミノプロパンスルホン酸（TAPS)、 N シクロへキシル 2 アミノエタンスル ホン酸（CHES)、 N -シクロへキシル 3 ァミノ 2 ヒドロキシプロパンスルホン酸 (CAPSO)、 N -シクロへキシル 3—ァミノプロパンスルホン酸（CAPS)を含む。
[0074] 緩衝液は通常 4〜10、好ましくは 5〜9の pHで、通常 0. 001〜0. 5mol/L,好ま しくは 0. 005〜0. 2molZL、より好ましくは 0. 01〜0. ImolZLの濃度で用いられ る。
過酸ィ匕水素定量に用いられる色原体として、例えばパーォキシダーゼの存在下過 酸化水素と酸化によって色素に変換される色原体が用いられる。その例はロイコ型 色原体、酸化カップリング型色原体を含む。ロイコ型色原体は、過酸化水素およびパ 一ォキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質であ る。
[0075] ロイコ型色原体の例は 10— N—カルボキシメチルカルバモイルー 3, 7 ビス（ジメ チルァミノ）— 10H フエノチアジン（CCAP)、 10- (N—メチルカルバモイル） - 3, 7 ビス（ジメチルァミノ）— 10H フエノチアジン（MCDP)、 N— (カルボキシメチル ァミノカルボ-ル）—4, 4，—ビス（ジメチルァミノ）ジフエ-ルァミンナトリウム塩（DA 64)、 4, 4，一ビス（ジメチルァミノ）ジフエ-ルァミン、ビス〔3 ビス（4 クロ口フエ -ル)メチル 4—ジメチルァミノフエ-ル〕ァミン（BCMA)である。
[0076] 酸化カップリング型色原体は、過酸化水素およびパーォキシダーゼ等の過酸化活 性物質の存在下、 2つの化合物が酸ィ匕によってカップリングして色素に変換される色 原体である。 2つの化合物の組み合わせの例はカプラーとァ-リン類との組み合わせ 、カプラーとフエノール類との組み合わせを含む。
[0077] カプラーの例は、 4ーァミノアンチピリン（4— AA)、 3—メチルー 2 べンゾチアゾリ ノンヒドラジンである。ァ-リン類の例は N— (3—スルホプロピル）ァ-リン、 N—ェチ ル— N— (2—ヒドロキシ— 3—スルホプロピル）— 3—メチルァ-リン (TOOS)、 N— ェチル N— (2—ヒドロキシ— 3—スルホプロピル） - 3, 5—ジメチルァ-リン（MA OS)、 N—ェチルー N— (2—ヒドロキシ— 3—スルホプロピル） - 3, 5—ジメトキシァ -リン（DAOS)、 N—ェチルー N— (3—スルホプロピル）—3—メチルァ-リン（TOP S)、 N— (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） - 3, 5—ジメトキシァ-リン（HDAOS ) , N, N—ジメチルー 3—メチルァ-リン、 N, N—ジ（3—スルホプロピル） - 3, 5— ジメトキシァ-リン、 N ェチル N— (3—スルホプロピル） 3—メトキシァ-リン、 N —ェチルー N— (3—スルホプロピル）ァ-リン、 N ェチル N— (3—スルホプロピ ル）—3, 5—ジメトキシァ-リン、 N— (3—スルホプロピル） - 3, 5—ジメトキシァユリ ン、 N ェチル N— (3—スルホプロピル）—3, 5—ジメチルァ-リン、 N ェチル -N- (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） 3—メトキシァ-リン、 N ェチル N - (2 ヒドロキシ一 3—スルホプロピル）ァ-リン、 N ェチル N— (3—メチルフエ -ル） N，—サクシ-ルエチレンジァミン（EMSE)、 N—ェチルー N— (3—メチル フエ-ル） N，一ァセチルエチレンジァミン、 N ェチル N— (2 ヒドロキシ一 3— スルホプロピル）— 4—フルオロー 3, 5—ジメトキシァ-リン（F— DAOS)を含む。フ ェノール類の例はフエノール、 4—クロ口フエノール、 3—メチルフエノール、 3—ヒドロ キシ— 2, 4, 6 トリョード安息香酸 (HTIB)を含む。
[0078] パーォキシダーゼは、通常 1〜： LOOkUZLの濃度で用いられる。色原体は、通常 0 . 01〜： LOgZLの濃度で用いられる。
還元型補酵素の定量に用いられる色原体として、例えばジァホラーゼまたは電子 キャリアーの存在下還元型補酵素と還元によって色素に変換される色原体が用いら れる。その例は、 3— (4, 5 ジメチル— 2 チアゾリル）— 2, 5 ジフエ-ル— 2H— テトラゾリゥムブロミド（MTT)ゝ 2- (4—ョードフエ-ル） 3— (4— -トロフエ-ル） —5— (2, 4 ジスルホフエ-ル） 2H—テトラゾリゥムモノナトリウム塩 (WST— 1)、 2- (4 ョードフエ-ル） 3— (2, 4 ジ-トロフエ-ル） 5— (2, 4 ジスルホフエ -ル） 2H—テトラゾリゥムモノナトリウム塩 (WST— 3)を含む。
[0079] ジァホラーゼおよび電子キャリア一は、通常 1〜： LOOkUZLの濃度で用いられる。
色原体は、通常 0. 01〜10gZLの濃度で用いられる。
[0080] シクロデキストリンまたはその誘導体の例はシクロデキストリン、ジメチルシクロデキス トリン、トリメチルシクロデキストリン、ヒドロキシェチルシクロデキストリン、ヒドロキシプロ ビルシクロデキストリン、カルボキシメチルシクロデキストリン、グリコシルシクロデキスト リン、マルトシルシクロデキストリン、シクロデキス口リンスルフェート、シクロデキストリン
キストリンが好ましい。
[0081] シクロデキストリンの例は at—シクロデキストリン、 13—シクロデキストリン、 γ—シクロ デキストリンである。
ジメチルシクロデキストリンの例はジメチルー atーシクロデキストリン、ジメチルー 13 —シクロデキストリン、ジメチル一 Ί—シクロデキストリンである。
トリメチルシクロデキストリンの例はトリメチルー (Xーシクロデキストリン、トリメチルー βーシクロデキストリン、トリメチルー γ—シクロデキストリンである。
、ヒドロキシェチル一 13—シクロデキストリン、ヒドロキシェチル一 Ί—シクロデキストリ ンである。 リン、ヒドロキシプロピル一 β—シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル一 γ—シクロデ キストリンである。
[0083] カルボキシメチルシクロデキストリンの例はカルボキシメチルー atーシクロデキストリ ン、カルボキシメチルー 13ーシクロデキストリン、カルボキシメチルー γ—シクロデキス トリンである。
グリコシルシクロデキストリンの例はグリコシル一 α—シクロデキストリン、グリコシル - β—シクロデキストリン、グリコシル一 γ—シクロデキストリンである。
[0084] マルトシルシクロデキストリンの例はマルトシルー aーシクロデキストリン、マルトシル - β—シクロデキストリン、マルトシル一 γ—シクロデキストリンである。 シクロデキストリンスルフェートの例は α—シクロデキストリンスルフェート、 βーシク ロデキストリンスルフェート、 7ーシクロデキストリンスルフェートである。
シクロデキストリンポリマーの例は —シクロデキストリンポリマーである。 2種類以上 のシクロデキストリンまたはその誘導体を組み合わせて使用することもできる。
[0085] 水性媒体中、シクロデキストリンもしくはその誘導体の濃度は、 0. 001-5 (w/v) %が好ましぐ 0. 005-2. 5 (wZv) %がより好ましぐ 0. 01〜： L (wZv) %が特に好 ましい。
アルブミンの例はゥシ、ゥマ、ヒッジ、ヒト由来のアルブミンを含み、ゥシ血清アルブ ミン (BSA)が好ましい。遺伝子工学的な手法により製造されたアルブミンも用いるこ とができる。 2種類以上のアルブミンを組み合わせて使用することもできる。水性媒体 中、アルブミンの濃度は、 0. 001〜5 (wZv) %力 子ましく、 0. 005〜2. 5 (w/v) % 力 り好ましぐ 0. 01〜： L (wZv) %が特に好ましい。
[0086] リポ蛋白凝集剤としてはリンタングステン酸塩、デキストラン硫酸塩、へパリンなどの ポリア-オンが、マグネシウム、カルシウム、コバルト等の 2価の金属塩力 あげられる 。水性媒体中、リポ蛋白凝集剤の濃度は、それぞれ独立に 0. 001〜5 (wZv) %が 好ましく、 0. 005〜2. 5 (wZv) %がより好ましぐ 0. 01〜： L (wZv) %が特に好まし い。
[0087] 酵素活性化剤の例は、胆汁酸類、アルキルスルホン酸塩等のァ-オン性界面活性 剤を含む。胆汁酸類の例は、コール酸、デォキシコール酸、タウロコール酸、ケノデ ォキシコール酸を含む。アルキルスルホン酸塩の例は 1 ペンタスルホン酸塩、 1 へキサスルホン酸塩、 1 ヘプタスルホン酸塩、 1 オタタスルホン酸塩を含む。アル キルスルホン酸塩における塩の例はアンモニゥム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、力リウ ム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩を含む。
[0088] 安定化剤の例は、エチレンジァミン四酢酸 (EDTA)、シユークロース、塩化カルシ ゥムを含む。
防腐剤の例は、アジィ匕ナトリウム、抗生物質を含む。
干渉抑制剤の例は、ァスコルビン酸の影響を抑制するためのァスコルビン酸ォキシ ダーゼ、ピリルビンの影響を抑制するためのフエロシアンィ匕カリウムを含む。
[0089] 塩類の例は、塩化リチウム、硫酸リチウム、塩ィ匕ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリ ゥム、硫酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩ィ匕ァ ンモ-ゥム、硫酸マグネシウム、硝酸マグネシウム、硝酸カルシウムを含む。
本発明の RLP— Cの定量方法として、以下の具体的態様を例示することができる。
[0090] 定量方法 1
(1)水性媒体中、試料、リン脂質を加水分解する酵素、界面活性剤 (dl)、界面活性 剤（d2)、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸ィ匕酵素の存 在下、酵素反応を行い、
(2)生成する過酸化水素を測定し、
(3) (2)で測定した値と、予め作成した検量線とから、試料中の RLP— C濃度を決定 する方法。
[0091] 定量方法 2
(1)水性媒体中、試料、リン脂質を加水分解する酵素、界面活性剤 (d3)、界面活性 剤（d4)、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸ィ匕酵素の存 在下、酵素反応を行い、
(2)生成する過酸化水素を測定し、
(3) (2)で測定した値と、予め作成した検量線とから、試料中の RLP— C濃度を決定 する方法。
[0092] 定量方法 3
(1)水性媒体中、試料、リン脂質を加水分解する酵素、界面活性剤 (dl)、界面活性 剤（d2)、コレステロールエステル加水分解酵素、酸ィ匕型補酵素およびコレステロ一 ル脱水素酵素の存在下、酵素反応を行い、
(2)生成する還元型補酵素を測定し、
(3) (2)で測定した値と、予め作成した検量線とから、試料中の RLP— C濃度を決定 する方法。
[0093] 定量方法 4
(1)水性媒体中、試料、リン脂質を加水分解する酵素、界面活性剤 (d3)、界面活性 剤（d4)、コレステロールエステル加水分解酵素、酸ィ匕型補酵素およびコレステロ一 ル脱水素酵素の存在下、酵素反応を行い、
(2)生成する還元型補酵素を測定し、
(3) (2)で測定した値と、予め作成した検量線とから、試料中の RLP— C濃度を決定 する方法。
[0094] (RLP— C定量用試薬）
本発明の RLP— C定量用試薬は、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールェ ステル加水分解酵素、コレステロール酸ィ匕酵素、および、界面活性剤（dl)と界面活 性剤 (d2)の組み合わせもしくは界面活性剤 (d3)と界面活性剤 (d4)の組み合わせ を含有する。該試薬は、過酸化水素定量用試薬を含有することができる。過酸化水 素定量用試薬の例は、パーォキシダーゼおよび前述のパーォキシダーゼの存在下 過酸化水素と酸化によって色素に変換される色原体を含有する試薬が挙げられる。
[0095] また、本発明の他の RLP— C定量用試薬は、リン脂質を加水分解する酵素、コレス テロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、およ び、界面活性剤 (dl)と界面活性剤 (d2)の組み合わせもしくは界面活性剤 (d3)と界 面活性剤 (d4)の組み合わせを含有する。該試薬は、還元型補酵素定量用試薬を含 有することができる。還元型補酵素定量用試薬の例は、ジァホラーゼまたは電子キヤ リア一および前述のジァホラーゼまたは電子キャリアーの存在下還元型補酵素と還 元によつて色素に変換される色原体を含有する試薬が挙げられる。
[0096] 本発明の RLP— C定量用試薬として、以下の具体的態様を例示することができる。
試薬 1
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸ィ匕酵素、界面活性剤（dl )、界面活性剤 (d2)および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬 2
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸ィ匕酵素、界面活性剤（d3 )、界面活性剤 (d4)および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
[0097] 試薬 3
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素 、界面活性剤 (dl)および界面活性剤 (d2)を含有する試薬。
纏 4
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素 、界面活性剤 (d3)および界面活性剤 (d4)を含有する試薬。
[0098] 試薬 5
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素 、界面活性剤 (dl)、界面活性剤 (d2)および還元型補酵素測定用試薬を含有する 試薬。
試薬 6
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素 、界面活性剤 (d3)、界面活性剤 (d4)および還元型補酵素測定用試薬を含有する 試薬。
(RLP— C定量用キット）
本発明の RLP— C定量用試薬は、キットの形態で保存、流通および使用されるの が好ましい。キットの形態は、 2試薬および 3試薬が用いられる力 2試薬系が好まし い。
[0099] 第 1試薬と第 2試薬の 2試薬系のキットにおいて、コレステロールエステルカ卩水分解 酵素と、コレステロール酸ィ匕酵素またはコレステロール脱水素酵素とは別々の試薬に 含有されてもよいが、同一試薬に含有されるキットが好ましぐ特に、第 2試薬に含有 されるキットが好ましい。リン脂質を加水分解する酵素は、第 1試薬、第 2試薬のいず れカまたは両方に含有される力 第 2試薬に含有されることが好ま 、。
[0100] 界面活性剤 (dl)と界面活性剤 (d2)は、第 1試薬、第 2試薬のいずれカゝまたは両方 に含有されるが、界面活性剤 (dl)は第 1試薬に含有されることが好ましい。界面活 性剤 (d3)と界面活性剤 (d4)は、第 1試薬、第 2試薬のいずれかまたは両方に含有さ れるが、界面活性剤 (d3)は第 1試薬に含有されることが好ましい。
酸化型補酵素は、第 1試薬、第 2試薬の少なくとも一方に含有される。過酸化水素 定量用試薬は、第 1試薬、第 2試薬の少なくとも一方に含有されるが、当該試薬が酸 化カップリング型色原体を含有する場合には、酸化カップリング型色原体のそれぞれ の化合物は好ましくは別々の試薬に含有される。還元型補酵素定量用試薬は、第 1 試薬、第 2試薬の少なくとも一方に含有される。
[0101] 本発明の RLP— C定量用キットとして、以下の具体的態様を例示することができる。
キット 1
第 1試薬
界面活性剤 (dl)および過酸化水素定量用試薬の一部を含有する試薬。 第 2試薬
界面活性剤（d2)、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分 解酵素、コレステロール酸ィ匕酵素および過酸ィ匕水素定量用試薬の残りの一部を含有 する試薬。
[0102] キット 2
第 1試薬
界面活性剤 (d3)および過酸化水素定量用試薬の一部を含有する試薬。 第 2試薬
界面活性剤（d4)、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分 解酵素、コレステロール酸ィ匕酵素および過酸ィ匕水素定量用試薬の残りの一部を含有 する試薬。
[0103] キット 3
第 1試薬
界面活性剤 (dl)を含有する試薬。
第 2試薬
界面活性剤（d2)、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分 解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
[0104] キット 4
第 1試薬
界面活性剤 (d3)を含有する試薬。
第 2試薬
界面活性剤（d4)、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分 解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
[0105] キット 5
第 1試薬
界面活性剤 (dl)を含有する試薬。
第 2試薬
界面活性剤（d2)、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分 解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試 薬を含有する試薬。
[0106] キット 6
第 1試薬
界面活性剤 (d3)を含有する試薬。
第 2試薬
界面活性剤（d4)、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分 解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試 薬を含有する試薬。
[0107] 本発明の RLP— C定量用試薬およびキットは、試料中の RLP— Cの定量に使用す ることがでさる。
本発明の RLP— C定量用試薬およびキットにおける各成分は、前述の RLP— C定 量方法に記載のリン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵 素、コレステロール酸ィ匕酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性 剤 (dl)、界面活性剤 (d2)、界面活性剤 (d3)、界面活性剤 (d4)、過酸化水素定量 用試薬および還元型補酵素定量用試薬を用いることができる。
[0108] 本発明の RLP— C定量用試薬およびキットには、必要に応じて、前述の水性媒体、 シクロデキストリンもしくはその誘導体、アルブミン、リポ蛋白凝集剤、酵素活性化剤、 安定化剤、防腐剤、干渉物抑制剤、生体試料中のグロブリンなどの蛋白質を可溶ィ匕 するための種々の塩類等が含有されてもよ!、。
本発明の RLP— C定量用試薬およびキットにおける酵素、 2種の界面活性剤は、 水性媒体で溶解された状態で RLP— C定量方法の項に記載の濃度となる含量で構 成される。
[0109] 以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら 限定するものではない。尚、本実施例においては、下記メーカーの試薬および機器 を使用した。
[0110] MOPS (グッド緩衝剤；同仁ィ匕学研究所社製)、 TOOS [トリンダー試薬 (酸化カップ リング型色原体）；同仁ィ匕学研究所社製]、 4—ァミノアンチピリン (半井ィ匕学社製)、 硫酸ナトリウム (和光純薬工業社製）、プロノン B— 208 { POE · POB共重合体 [界面 活性剤 (dl) ]；日本油脂社製 }、プロノン Β— 204{ΡΟΕ·ΡΟΒ共重合体 [界面活性 剤（dl) ]；日本油脂社製 }、ワンダサーフ RL—100{POE'POPアルキルエーテル [ 界面活性剤 (d2) ]；青木油脂社製 }、ワンダサーフ ID— 70{ΡΟΕ·ΡΟΡ短鎖分岐ァ ルキルエーテル [界面活性剤（d2) ]；青木油脂社製 }、ワンダサーフ ID— 90{POE' POP短鎖分岐アルキルエーテル [界面活性剤（d2) ]；青木油脂社製 }、ェマルゲン L —40{ΡΟΕ·ΡΟΡアルキルァリールエーテル [界面活性剤（d2) ]；花王社製 }、プル 口ニック F— 108 (POE · POP共重合体；旭電化工業社製）、ホスホリパーゼ D (旭化 成社製)、コレステロール酸ィ匕酵素 (CHOD ;協和発酵工業社製)、コレステロールェ ステル加水分解酵素 (CHER;東洋紡績社製)、パーォキシダーゼ (POD) (東洋紡 績社製）、ァスコルビン酸ォキシダーゼ (AOD) (旭化成社製)。
実施例 1
[0111] RLP— C定量用キット
以下の第 1試薬および第 2試薬力もなる RLP— C定量用キットを作製した。
MOPS (pH6. 8) 20 mmol/L
Figure imgf000035_0001
硫酸ナトリウム 2 g/L
プロノン B— 208 8 g/L
ワンダサーフ RL— 100 1 g/L
パーォキシダーゼ（POD) 10 U/mL
ァスコルビン酸ォキシダーゼ (AOD) 2 U/mL [0112] ·第 2試薬
MOPS (pH6. 8) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 5 g/L ワンダサーフ RL— 100 1 g/L
パーォキシダーゼ 10 U/mL コレステロールエステル加水分解酵素（CHER) 1 U/mL コレステロール酸化酵素（CHOD) 3 U/mL ホスホリパーゼ D 5 U/mL 実施例 2
[0113] RLP— C定量用キット
以下の第 1試薬および第 2試薬力もなる RLP— C定量用キットを作:
MOPS (pH6. 8) 20 mmol/L
Figure imgf000036_0001
硫酸ナトリウム 2 g/L
プロノン B— 204 8 g/L
ワンダサーフ ID— 70 1 g/L
パーォキシダーゼ（POD) 10 U/mL ァスコルビン酸ォキシダーゼ（AOD) 2 U/mL
[0114] ·第 2試薬
MOPS (pH6. 8) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 5 g/L ワンダサーフ ID— 70 1 g
パーォキシダーゼ 10 U/mL コレステロールエステル加水分解酵素（CHER) 1 U/mL コレステロール酸化酵素（CHOD) 3 U/mL ホスホリパーゼ D 5 U/mL 実施例 3 [0115] RLP— C定量用キット
以下の第 1試薬および第 2試薬力もなる RLP
•第 1試薬
MOPS (pH6. 8) 20 mmol/L
Figure imgf000037_0001
硫酸ナトリウム 2 g/L
プロノン B— 208 8 g/L
エマノレゲン L 40 2 g/L
パーォキシダーゼ（POD) 10 U/mL
ァスコルビン酸ォキシダーゼ (AOD) 2 U/mL
[0116] -^2
MOPS (pH6. 8) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 5 g/L
エマノレゲン L 40 3 g/L
パーォキシダーゼ 10 U/mL
コレステロールエステルカ卩水分解酵素（CHER) 1 U/mL
コレステロール酸化酵素（CHOD) 3 U/mL
ホスホリパーゼ D 5 U/mL
[0117] 比較例 1
RLP— C定量用キット
以下の第 1試薬および第 2試薬力もなる RLP— C定量用キットを作製した。当処方 は、特開 2001— 231597号公報の実施例 1に記載された処方である。
MOPS (pH6 20 mmol/L
Figure imgf000037_0002
硫酸ナトリウム 2 g/L
プノレ ック F 1 g/L
パーォキシダ ゼ（POD) 10 U/mL ァスコルビン酸ォキシダーゼ (AOD) 2 U/mL
[0118] ·第 2試蓉
MOPS (pH6. 8) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 5 g/L
ェマルゲン L 40 2 g/L
パーォキシダーゼ 10 U/mL
コレステロールエステルカ卩水分解酵素（CHER) 1 U/mL
コレステロール酸化酵素（CHOD) 2 U/mL
ホスホリパーゼ D 5 U/mL
実施例 4
[0119] RLP— Cの定量
実施例 1のキットを用いて、ヒト新鮮血清 64検体について、各検体中の RLP— Cを 日立 7170型自動分析機により、以下の方法により定量した。
(1)検量線の作成
RLP コレステロール「JIMRO」II (日本抗体研究所社製）を用いた測定より、 RLP —C濃度が 32. 4 mgZdLであることが判明している血清標準液を標準品として用 Vヽて、当該血清標準液を適宜希釈して調製した希釈血清を検量線作成用サンプル とした。
[0120] 測定用キットとして実施例 1のキットを用いて、以下の手順に従い、日立 7170型自 動分析機にて、各希釈血清中の RLP— C濃度を測定し、検量線を作成した。
反応セルへ希釈血清（3. 8 /z L)と第 1試薬 (0. 18 mL)とを添加し 37°Cで 5分 間加温し、反応液の吸光度 (E1)を主波長 600nm、副波長 700nmで測定し (測光 ポイント： 16)、次いで、この反応液に、 37°Cに予め加温された第 2試薬（0. 06 mL )を添加しさらに 37°Cで 5分間加温し、反応液の吸光度 (E2)を主波長 600nm、副 波長 700nmで測定した (測光ポイント： 32)。反応における吸光度変化 (E2— E1)と 希釈血清中の RLP— C濃度との関係から検量線を作成した。
(2)ヒト新鮮血清 64検体中の RLP— Cの定量
血清標準液の代わりにヒト新鮮血清 64検体を用いて、（1)と同様の方法により、該 6 4検体各々について反応を行い、反応後の反応液の吸光度と（1)で作成した検量線 とから、各検体中の RLP— C濃度を定量した。
実施例 5
[0121] RLP— Cの定量
実施例 1のキットの代わりに実施例 2のキットを用いる以外は実施例 4の定量法と同 様にして、日立 7170型自動分析装置により、実施例 4の定量において使用したヒト 新鮮血清 64検体の各検体中の RLP— C濃度を定量した。
実施例 6
[0122] RLP— Cの定量
実施例 1のキットの代わりに実施例 3のキットを用いる以外は実施例 4の定量法と同 様にして、日立 7170型自動分析装置により、実施例 4の定量において使用したヒト 新鮮血清 64検体の各検体中の RLP— C濃度を定量した。
[0123] 比較例 2
RLP— Cの定量
実施例 1のキットの代わりに比較例 1のキットを用いる以外は実施例 4の定量法と同 様にして、日立 7170型自動分析装置により、実施例 4の定量において使用したヒト 新鮮血清 64検体の各検体中の RLP— C濃度を定量した。
[0124] 試験例 1
RLP コレステロール「JIMRO」 II (日本抗体研究所社製）を用 、た測定との相関 前述のヒト新鮮血清 64検体について、 RLP コレステロール「JIMRO」II (日本抗 体研究所社製)を用いて、各検体中の RLP— C濃度を定量した。
各検体について、実施例 4〜6および比較例 2の定量法と RLP コレステロール「JI
MROj IIを用 、た定量法との相関性を相関係数で評価した。その結果を第 11表に 示す。また、相関図を図 1〜図 4に示す。
[0125] [表 11] 第 1 1表
Figure imgf000040_0001
[0126] 第 11表に示すように、本発明の方法は、比較例 2 (特開 2001— 231597号公報の 実施例 1に記載されたキットを用いた定量）に比較して、いずれも、 RLP コレステロ ール「JIMRO」 IIを用 、た定量法との相関が良好な処方であることが判明した。
[0127] 試験例 2
III型高脂血症検体中の RLP— Cの定量
III型高脂血症患者の血清検体中の RLP— C濃度を、 RLP コレステロール「JIMR 0」Π (日本抗体研究所社製）、実施例 1〜3および比較例 1のキットを用いて決定した 。なお、 RLP コレステロール「JIMRO」II (日本抗体研究所社製)を用いた測定より 、RLP— C濃度が 32. 4 mgZdLであることが判明している血清標準液を標準品と して用いて、当該血清標準液を適宜希釈して調製した希釈血清を検量線作成用サ ンプルとした。その結果を第 12表に示す。
[0128] [表 12] 第 1 2表
Figure imgf000040_0002
III型高脂血症患者の血清には、特に VLDLレムナントが多く存在することが知られ ている。従って、第 12表の結果から、本発明の定量法においては、比較例 1のキット (特開 2001— 231597号公報の実施例 1に記載されたキット）に比較して、 VLDLレ ムナント中のコレステロールの反応性が向上していることがわかる。また、 RLP コレ ステロール「jIMRO」 IIを用いた定量法に比較しても、本発明の定量法にぉ LP— Cに対する反応性が高いことがわかる。
実施例 7
[0130] RLP— C定量用キット
以下の第 1試薬および第 2試薬力もなる RLP— C定量用キットを作製した。
MOPS (pH6. 8) 20 mmol/L
Figure imgf000041_0001
硫酸ナトリウム 2 g/L
プロノン B— 208 8 g/L
エマルゲン L 40 1 g/L
ワンダサーフ ID— 70 1 g/L
パーォキシダーゼ（POD) 10 U/mL
ァスコルビン酸ォキシダーゼ（AOD) 2 U/mL
[0131] ·第 2試薬
MOPS (pH6. 8) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 5 g/L
ワンダサーフ ID— 70 1 g/L
パーォキシダーゼ 10 U/mL
コレステロールエステルカ卩水分解酵素（CHER) 1 U/mL コレステロール酸化酵素（CHOD) 3 U/mL
ホスホリパーゼ D 5 U/mL
実施例 8
[0132] RLP— C定量用キット
以下の第 1試薬および第 2試薬カゝらなる RLP— C定量用キットを作製した
MOPS (pH6. 8) 20 mmol/L
TOOS 0. 3 g/L 硫酸ナトリウム 2 g/L
プロノン B— 208 8 g/L
ェマルゲン L 40 1 g/L
ワンダサーフ ID— 70 g
パーォキシダーゼ（POD) 10 U/mL
ァスコルビン酸ォキシダーゼ（AOD) 2 U/mL
[0133]
MOPS (pH6. 8) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 5 g/L
ワンダサーフ ID— 70 1
エマノレゲン L 40 1 /
パーォキシダーゼ 10 U/mL
コレステロールエステルカ卩水分解酵素（CHER) 1 U/mL コレステロール酸化酵素（CHOD) 3 U/mL
ホスホリパーゼ D 5 U/mL
実施例 9
[0134] RLP— C定量用キット
以下の第 1試薬および第 2試薬力 なる RLP— C定量用キットを作製した ' 1纏
MOPS (pH6. 8) 20 mmol/L
Figure imgf000042_0001
硫酸ナトリウム 2 g/L
プロノン B— 208 8 g/L
ェマルゲン L 40 1
ワンダサーフ ID— 90 1
パーォキシダーゼ（POD) 10 U/mL
ァスコルビン酸ォキシダーゼ（AOD) 2 U/mL
[0135] ·第 2試蓉 MOPS (pH6. 8) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 5 g/L
ワンダサーフ ID— 90 1 g/L
パーォキシダーゼ 10 U/mL
コレステロールエステル加水分解酵素（CHER) 1 U/mL コレステロール酸化酵素（CHOD) 3 U/mL
ホスホリパーゼ D 5 U/mL
実施例 10
[0136] RLP— C定量用キット
以下の第 1試薬および第 2試薬力 なる RLP— C定量用キットを作製した
MOPS (pH6. 8) 20 mmol/L
Figure imgf000043_0001
硫酸ナトリウム 2 g/L
プロノン B— 208 8 g/L
ェマルゲン L 40 1 /
ワンダサーフ ID— 90 1
パーォキシダーゼ（POD) 10 U/mL
ァスコルビン酸ォキシダーゼ（AOD) 2 U/mL
[0137] ·第 2試薬
MOPS (pH6. 8) 20 mmol/L
4ーァミノアンチピリン 0. 5 g/L
ワンダサーフ ID— 90 1 /
ェマルゲン L 40 1 /
パーォキシダーゼ 10 U/mL
コレステロールエステルカ卩水分解酵素（CHER) 1 U/mL コレステロール酸化酵素（CHOD) 3 U/mL
ホスホリパーゼ D 5 U/mL 実施例 11
[0138] RLP— Cの定量
定量用キットとして、実施例 1のキットの代わりに実施例 7のキットを、検体として、実 施例 5〜8で使用したヒト新鮮血清 64検体の代わりにヒト新鮮血清 35検体を用いる以 外は実施例 4の定量法と同様の方法により、日立 7170型自動分析装置により、当該 35検体の各検体中の RLP— C濃度を定量した。
実施例 12
[0139] RLP— Cの定量
実施例 7のキットの代わりに実施例 8のキットを用いる以外は実施例 11の定量法と 同様の方法により、日立 7170型自動分析装置により、ヒト新鮮血清 35検体の各検体 中の RLP— C濃度を定量した。
実施例 13
[0140] RLP— Cの定量
実施例 7のキットの代わりに実施例 9のキットを用いる以外は実施例 11の定量法と 同様の方法により、日立 7170型自動分析装置により、ヒト新鮮血清 35検体の各検体 中の RLP— C濃度を定量した。
実施例 14
[0141] RLP— Cの定量
実施例 7のキットの代わりに実施例 10のキットを用いる以外は実施例 11の定量法と 同様の方法により、日立 7170型自動分析装置により、ヒト新鮮血清 35検体の各検体 中の RLP— C濃度を定量した。
[0142] 試験例 3
RLP コレステロール「JIMRO」 II (日本抗体研究所社製）を用 、た測定との相関 実施例 11〜 14で使用したヒト新鮮血清 35検体にっ 、て、 RLP—コレステロール「J
IMRO」II (日本抗体研究所社製)を用いて、各検体中の RLP— C濃度を定量した。 各検体につ 、て、実施例 11〜 14の定量法と RLP コレステロール「JIMRO」 IIを 用いた定量法との相関性を相関係数で評価した。その結果を第 13表に示す。また、 相関図を図 5〜図 8に示す。
[表 13]
第 1 3表
Figure imgf000045_0001
第 13表に示すように、界面活性剤 (d2)として 2種類の界面活性剤を使用したキット においても、 RLP コレステロール「JIMRO」 IIを用 、た定量法との間に良好な相関 関係が認められた。また、第 11表に示した実施例 4〜6との比較から、界面活性剤 2)を 1種類使用したキットよりも、 2種類使用したキットを用いた定量の方力 RLP- コレステロール「jIMRO」IIを用いた定量法との間によりよい相関が認められた。 産業上の利用可能性
本発明により、動脈硬化性疾患の診断に有用な RLP— Cの定量方法、試薬および キットが提供される。

Claims

請求の範囲
[1] 試料を含有する水性媒体中、（a) (i)ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体 、ポリオキシエチレンスチレン化フエニルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキ シプロピレン長鎖分岐アルキルエーテル力 なる群より選択される一種または二種以 上の界面活性剤 [以下、界面活性剤（dl)という]と、ポリオキシエチレンポリオキシプ ロピレンアルキルァリールエーテル、ポリオキシエチレンアルキルァリールエーテル、 ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレン ポリオキシプロピレン短鎖分岐アルキルエーテル力 なる群より選択される一種また は二種以上の界面活性剤 [以下、界面活性剤 (d2)という]との組み合わせ、または、 (ii)ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体 [以下、界面活性剤 (d3) t 、う ]と、ポリオキシエチレンアルキルァリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプ ロピレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレン短鎖分岐ァ ルキルエーテル力 なる群より選択される一種または二種の界面活性剤 [以下、界面 活性剤 (d4) t 、う]との組み合わせ、並びに (b)リン脂質を加水分解する酵素の存在 下、試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロールに、 （c)コレステロールエステル加 水分解酵素およびコレステロール酸ィ匕酵素または (d)酸化型補酵素の存在下にコレ ステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を作用させ、過 酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素または還元型補酵 素を定量することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロールの定量 方法。
[2] 過酸ィ匕水素の定量がパーォキシダーゼの存在下、生成した過酸化水素を酸化発色 型色原体と反応させ、生成した色素を定量することによって行われる請求項 1記載の 方法。
[3] 還元型補酵素の定量が反応液の吸光度を測定することによって行われる請求項 1記 載の方法。
[4] 還元型補酵素の定量が生成した還元型補酵素を還元発色型色原体と反応させ、生 成した色素を定量することによって行われる請求項 1記載の方法。
[5] ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体が一般式 (I) [化 6]
RO (C2H40) A— (C4HsO) B (C2H40) H (I)
(式中、 A、 Bおよび Cは同一または異なって 1〜200の整数を表し、 Rは、水素原子 、直鎖または分岐のアルキルを表す)で表される界面活性剤である請求項 1〜4の 、 ずれかに記載の方法。
[6] リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼ0、ホスホリパーゼ Cまたはホスホリパ ーゼ A2である請求項 1〜5のいずれかに記載の方法。
[7] リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロ一 ル酸化酵素、および界面活性剤 (dl)と界面活性剤 (d2)との組み合わせ、または、 界面活性剤 (d3)と界面活性剤 (d4)との組み合わせを含有することを特徴とする試 料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用試薬。
[8] さらに過酸化水素定量用試薬を含有する請求項 7記載の試薬。
[9] リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロ一 ル脱水素酵素、酸化型補酵素、および界面活性剤 (dl)と界面活性剤 (d2)との組み 合わせまたは界面活性剤 (d3)と界面活性剤 (d4)との組み合わせを含有することを 特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用試薬。
[10] さらに還元型補酵素定量用試薬を含有する請求項 9記載の試薬。
[11] ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体が一般式 (I)
[化 7]
RO- (C2H40) A (C4HsO) B (C2H40) H (I)
(式中、 A、 Bおよび Cは同一または異なって 1〜200の整数を表し、 Rは、水素原子
、直鎖または分岐のアルキルを表す)で表される界面活性剤である請求項 7〜： L0の いずれかに記載の試薬。
[12] リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼ0、ホスホリパーゼ Cまたはホスホリパ ーゼ A2である請求項 7〜 11の!、ずれかに記載の試薬。
[13] 界面活性剤 (dl)を含有する第 1試薬と、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロ一 ルエステル加水分解酵素およびコレステロール酸ィ匕酵素を含有する第 2試薬とを含 有し、かつ、界面活性剤 (d2)を第 1試薬および第 2試薬の少なくとも一方に含有する ことを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キット。
[14] 界面活性剤 (d3)を含有する第 1試薬と、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロ一 ルエステル加水分解酵素およびコレステロール酸ィ匕酵素を含有する第 2試薬とを含 有し、かつ、界面活性剤 (d4)を第 1試薬および第 2試薬の少なくとも一方に含有する ことを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キット。
[15] さらに過酸ィ匕水素定量用試薬を第 1試薬、第 2試薬の少なくとも一方に含有する請求 項 13または 14記載のキット。
[16] 界面活性剤 (dl)を含有する第 1試薬と、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロ一 ルエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第 2試薬とを 含有し、界面活性剤 (d2)を第 1試薬および第 2試薬の少なくとも一方に含有し、かつ 、酸化型補酵素を第 1試薬および第 2試薬の少なくとも一方に含有することを特徴と する試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キット。
[17] 界面活性剤 (d3)を含有する第 1試薬と、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロ一 ルエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第 2試薬とを 含有し、界面活性剤 (d4)を第 1試薬および第 2試薬の少なくとも一方に含有し、かつ 、酸化型補酵素を第 1試薬および第 2試薬の少なくとも一方に含有することを特徴と する試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キット。
[18] さらに還元型補酵素定量用試薬を第 1試薬、第 2試薬の少なくとも一方に含有する請 求項 16または 17記載のキット。
[19] ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体が一般式 (I)
[化 8]
R O - ( C 2 H4 0) A - ( C 4 H s O) B - ( C 2 H4 0) H ( I )
(式中、 A、 Bおよび Cは同一または異なって 1〜200の整数を表し、 Rは、水素原子 、直鎖または分岐のアルキルを表す)で表される界面活性剤である請求項 13、 15、 1 6または 18記載のキット。
[20] リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼ0、ホスホリパーゼじ、または、ホスホリ パーゼ A2である請求項 13〜 19のいずれかに記載のキット。
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