JPWO2006085654A1 - レムナント様リポ蛋白(rlp)中のコレステロールの定量方法、試薬およびキット - Google Patents
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Abstract
Description
また、脂質の代謝等に起因して生成するリポ蛋白質中のコレステロールが動脈硬化症の危険因子としてLDL中のコレステロールより密接な指標となることが示されてきている。脂質の代謝等に起因して生成するリポ蛋白質としては、例えばRLPがあげられている。
また、試料の分離操作が不要なRLP−Cを簡便に感度良く測定する方法が知られている(特許文献1参照)。
(3) 還元型補酵素の定量が反応液の吸光度を測定することによって行われる前記(1)記載の方法。
(5) ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体が一般式(I)
(6) リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼD、ホスホリパーゼCまたはホスホリパーゼA2である前記(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(8) さらに過酸化水素定量用試薬を含有する前記(7)記載の試薬。
(10) さらに還元型補酵素定量用試薬を含有する前記(9)記載の試薬。
(12) リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼD、ホスホリパーゼCまたはホスホリパーゼA2である前記(7)〜(11)のいずれかに記載の試薬。
(14) 界面活性剤(d3)を含有する第1試薬と、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第2試薬とを含有し、かつ、界面活性剤(d4)を第1試薬および第2試薬の少なくとも一方に含有することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キット。
(16) 界面活性剤(d1)を含有する第1試薬と、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第2試薬とを含有し、界面活性剤(d2)を第1試薬および第2試薬の少なくとも一方に含有し、かつ、酸化型補酵素を第1試薬および第2試薬の少なくとも一方に含有することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キット。
(19) ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体が一般式(I)
(20) リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼD、ホスホリパーゼC、または、ホスホリパーゼA2である前記(13)〜(19)のいずれかに記載のキット。
本発明の定量方法によって全血、血漿、血清等の試料中のRLP−Cを定量できる。
本発明方法によれば試料中のRLP−Cは、水性媒体中、リン脂質を加水分解する酵素の存在下にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素もしくはコレステロール脱水素酵素をRLP−Cに特異的に作用させる界面活性剤の組み合わせ、すなわち、(i)界面活性剤(d1)と界面活性剤(d2)との組み合わせ、または、(ii)界面活性剤(d3)と界面活性剤(d4)との組み合わせの存在下、試料中のRLP−Cに、(c)コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素または(d)酸化型補酵素の存在下にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を作用させ、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を定量することにより定量することができる。
界面活性剤(d1)および界面活性剤(d2)の組み合わせ、および、界面活性剤(d3)および界面活性剤(d4)の組み合わせにおいては、界面活性剤(d1)、界面活性剤(d2)、界面活性剤(d3)、界面活性剤(d4)として、界面活性剤(d1)〜(d4)を構成する界面活性剤を一種または二種以上用いてもよい。
具体的には、第1表に記載されたPOE・POB共重合体と界面活性剤(d2)との組み合わせが好ましい。
POE・POB共重合体と界面活性剤(d2)との組み合わせの中でも、第8表に示す以下の組み合わせがより好ましい。
具体的には、第10表に示す以下の組み合わせが好ましい。
酵素反応の反応液中には、必要に応じて、シクロデキストリンもしくはその誘導体、アルブミンまたはリポ蛋白凝集剤の存在下に行うこともできる。シクロデキストリンもしくはその誘導体、アルブミンまたはリポ蛋白凝集剤によってレムナント様リポ蛋白以外のリポ蛋白コレステロールに酵素が作用するのを抑制することができるので好ましい。
水性媒体中、リン脂質を加水分解する酵素の濃度は、特に制限はないが、0.001〜400U/mLが好ましく、0.01〜200U/mLがより好ましく、0.05〜100U/mLが特に好ましい。
酵素反応は通常10〜50℃、好ましくは20〜40℃の温度で行われ、通常2〜30分で完了する。
コレステロールエステル加水分解酵素はコレステロールエステルを加水分解できる酵素、例えばコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等が用いられ、動物、植物または微生物由来または、遺伝子工学的な手法により製造される酵素、化学的に修飾された酵素等を使用することができる。化学的に修飾された酵素としては、例えばポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等の化学修飾基で修飾された酵素が含まれる。特にポリエチレングリコールを主成分とする基で修飾された酵素が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プルラン、可溶性デンプン等が含まれる。
まず、コレステロールエステル加水分解酵素をpH8.0以上の緩衝液、例えばHEPES緩衝液に溶解し、0〜55℃で0.01〜500倍モル量の化学修飾剤を添加し、5分〜5時間攪拌する。実際の酵素反応においては、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として、この反応液そのもののみならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去したものも、使用することもできる。
化学修飾酵素は、前述の化学修飾方法により作製することができる。
コレステロール脱水素酵素は、酸化型補酵素の存在下にコレステロールを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれば、動物、植物または微生物由来の酵素、遺伝子工学的な手法により製造される酵素、化学的に修飾された酵素を用いることができる。化学的に修飾された酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本発明のコレステロール脱水素酵素を用いる定量法において使用される酸化型補酵素の例は、NAD、NADP、チオ−NAD、チオ−NADPである。
化合物(I)における直鎖または分岐のアルキルは、炭素数が1〜30の、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、イソヘプチル、オクチル、イソオクチル、ノニル、イソノニル、デシル、イソデシル、ウンデシル、イソウンデシル、ドデシル、イソドデシル、トリデシル、イソトリデシル、テトラデシル、イソテトラデシル、ペンタデシル、イソペンタデシル、ヘキサデシル、イソヘキサデシル、ヘプタデシル、イソヘプタデシル、オクタデシル、イソオクタデシル、ノナデシル、イソノナデシル、イコシル、イソイコシル、ヘネイコシル、イソヘネイルコシル、ドコシル(ベヘニル)、イソドコシル、トリコシル、イソトリコシル、テトラコシル、イソテトラコシル、ペンタコシル、イソペンタコシル、ヘキサコシル、イソヘキサコシル、ヘプタコシル、イソヘプタコシル、オクタコシル、イソオクタコシル、ノナコシル、イソノナコシル、トリアコンシル、イソトリアコンシル、等を含む。
化合物(I)の具体例は、プロノンB−204、プロノンB−208(以上、日本油脂社製)を含む。
POEスチレン化フェニルエーテルの例は、BLAUNON DSP−9、BLAUNON DSP−12.5、BLAUNON DSP−20、BLAUNON DSP−10、BLAUNON TSP−5、BLAUNON TSP−7.5、BLAUNON TSP−16、BLAUNON TSP−20、BLAUNON TSP−50(以上、青木油脂社製)等であって、市販されている。
POE・POPアルキルアリールエーテルおよびPOEアルキルアリールエーテルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数8以上の、たとえばオクチル、ノニル等が挙げられる、アリールとしては、例えばフェニル、ナフチル等が挙げられる。アリールとしては、フェニルが好ましい。
POE・POP短鎖分岐アルキルエーテルにおける短鎖分岐アルキルとしては、炭素数6〜19の分岐アルキル、例えばイソヘキシル、イソヘプチル、イソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル等が挙げられる。
POEアルキルアリールエーテルとしては、例えばポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等が挙げられる。具体例は、エマルゲン911、エマルゲン810(以上、花王社製)、ノニオンHS−210、ノニオンHS−215、ノニオンNS−208.5、ノニオンHS−208(以上、日本油脂社製)等であって、市販されている。
化合物(II)における直鎖または分岐のアルキルは、前述の化合物(I)における直鎖または分岐のアルキルと同様のものが挙げられる。
具体例は、プルロニックF−108、プルロニックL−121、プルロニックL−122、プルロニックL−101、プルロニックL−103(以上、旭電化工業社製)、プロノン102、プロノン104、プロノン201、プロノン204、プロノン208、プロノン202B(以上、日本油脂社製)等であって、市販されている。
過酸化水素定量に用いられる色原体として、例えばパーオキシダーゼの存在下過酸化水素と酸化によって色素に変換される色原体が用いられる。その例はロイコ型色原体、酸化カップリング型色原体を含む。ロイコ型色原体は、過酸化水素およびパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。
還元型補酵素の定量に用いられる色原体として、例えばジアホラーゼまたは電子キャリアーの存在下還元型補酵素と還元によって色素に変換される色原体が用いられる。その例は、3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウム ブロミド(MTT)、2−(4−ヨードフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム モノナトリウム塩(WST−1)、2−(4−ヨードフェニル)−3−(2,4−ジニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルホフェニル)−2H−テトラゾリウム モノナトリウム塩(WST−3)を含む。
ジメチルシクロデキストリンの例はジメチル−α−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ジメチル−γ−シクロデキストリンである。
トリメチルシクロデキストリンの例はトリメチル−α−シクロデキストリン、トリメチル−β−シクロデキストリン、トリメチル−γ−シクロデキストリンである。
ヒドロキシプロピルシクロデキストリンの例はヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリンである。
グリコシルシクロデキストリンの例はグリコシル−α−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、グリコシル−γ−シクロデキストリンである。
シクロデキストリンスルフェートの例はα−シクロデキストリンスルフェート、β−シクロデキストリンスルフェート、γ−シクロデキストリンスルフェートである。
シクロデキストリンポリマーの例はβ−シクロデキストリンポリマーである。2種類以上のシクロデキストリンまたはその誘導体を組み合わせて使用することもできる。
アルブミンの例はウシ、ウマ、ヒツジ、ヒト由来のアルブミンを含み、ウシ血清アルブミン(BSA)が好ましい。遺伝子工学的な手法により製造されたアルブミンも用いることができる。2種類以上のアルブミンを組み合わせて使用することもできる。水性媒体中、アルブミンの濃度は、0.001〜5(w/v)%が好ましく、0.005〜2.5(w/v)%がより好ましく、0.01〜1(w/v)%が特に好ましい。
防腐剤の例は、アジ化ナトリウム、抗生物質を含む。
干渉抑制剤の例は、アスコルビン酸の影響を抑制するためのアスコルビン酸オキシダーゼ、ビリルビンの影響を抑制するためのフェロシアン化カリウムを含む。
本発明のRLP−Cの定量方法として、以下の具体的態様を例示することができる。
(1)水性媒体中、試料、リン脂質を加水分解する酵素、界面活性剤(d1)、界面活性剤(d2)、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素の存在下、酵素反応を行い、
(2)生成する過酸化水素を測定し、
(3)(2)で測定した値と、予め作成した検量線とから、試料中のRLP−C濃度を決定する方法。
(1)水性媒体中、試料、リン脂質を加水分解する酵素、界面活性剤(d3)、界面活性剤(d4)、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素の存在下、酵素反応を行い、
(2)生成する過酸化水素を測定し、
(3)(2)で測定した値と、予め作成した検量線とから、試料中のRLP−C濃度を決定する方法。
(1)水性媒体中、試料、リン脂質を加水分解する酵素、界面活性剤(d1)、界面活性剤(d2)、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素の存在下、酵素反応を行い、
(2)生成する還元型補酵素を測定し、
(3)(2)で測定した値と、予め作成した検量線とから、試料中のRLP−C濃度を決定する方法。
(1)水性媒体中、試料、リン脂質を加水分解する酵素、界面活性剤(d3)、界面活性剤(d4)、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素の存在下、酵素反応を行い、
(2)生成する還元型補酵素を測定し、
(3)(2)で測定した値と、予め作成した検量線とから、試料中のRLP−C濃度を決定する方法。
本発明のRLP−C定量用試薬は、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、および、界面活性剤(d1)と界面活性剤(d2)の組み合わせもしくは界面活性剤(d3)と界面活性剤(d4)の組み合わせを含有する。該試薬は、過酸化水素定量用試薬を含有することができる。過酸化水素定量用試薬の例は、パーオキシダーゼおよび前述のパーオキシダーゼの存在下過酸化水素と酸化によって色素に変換される色原体を含有する試薬が挙げられる。
試薬1
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、界面活性剤(d1)、界面活性剤(d2)および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
試薬2
コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、界面活性剤(d3)、界面活性剤(d4)および過酸化水素測定用試薬を含有する試薬。
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤(d1)および界面活性剤(d2)を含有する試薬。
試薬4
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤(d3)および界面活性剤(d4)を含有する試薬。
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤(d1)、界面活性剤(d2)および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
試薬6
コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤(d3)、界面活性剤(d4)および還元型補酵素測定用試薬を含有する試薬。
(RLP−C定量用キット)
本発明のRLP−C定量用試薬は、キットの形態で保存、流通および使用されるのが好ましい。キットの形態は、2試薬および3試薬が用いられるが、2試薬系が好ましい。
酸化型補酵素は、第1試薬、第2試薬の少なくとも一方に含有される。過酸化水素定量用試薬は、第1試薬、第2試薬の少なくとも一方に含有されるが、当該試薬が酸化カップリング型色原体を含有する場合には、酸化カップリング型色原体のそれぞれの化合物は好ましくは別々の試薬に含有される。還元型補酵素定量用試薬は、第1試薬、第2試薬の少なくとも一方に含有される。
キット1
第1試薬
界面活性剤(d1)および過酸化水素定量用試薬の一部を含有する試薬。
第2試薬
界面活性剤(d2)、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬の残りの一部を含有する試薬。
第1試薬
界面活性剤(d3)および過酸化水素定量用試薬の一部を含有する試薬。
第2試薬
界面活性剤(d4)、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素および過酸化水素定量用試薬の残りの一部を含有する試薬。
第1試薬
界面活性剤(d1)を含有する試薬。
第2試薬
界面活性剤(d2)、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
第1試薬
界面活性剤(d3)を含有する試薬。
第2試薬
界面活性剤(d4)、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する試薬。
第1試薬
界面活性剤(d1)を含有する試薬。
第2試薬
界面活性剤(d2)、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。
第1試薬
界面活性剤(d3)を含有する試薬。
第2試薬
界面活性剤(d4)、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素および還元型補酵素定量用試薬を含有する試薬。
本発明のRLP−C定量用試薬およびキットにおける各成分は、前述のRLP−C定量方法に記載のリン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、界面活性剤(d1)、界面活性剤(d2)、界面活性剤(d3)、界面活性剤(d4)、過酸化水素定量用試薬および還元型補酵素定量用試薬を用いることができる。
本発明のRLP−C定量用試薬およびキットにおける酵素、2種の界面活性剤は、水性媒体で溶解された状態でRLP−C定量方法の項に記載の濃度となる含量で構成される。
以下の第1試薬および第2試薬からなるRLP−C定量用キットを作製した。
・第1試薬
MOPS(pH6.8) 20 mmol/L
TOOS 0.3g/L
硫酸ナトリウム 2g/L
プロノンB−208 8g/L
ワンダサーフ RL−100 1g/L
パーオキシダーゼ(POD) 10U/mL
アスコルビン酸オキシダーゼ(AOD) 2U/mL
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5g/L
ワンダサーフRL−100 1g/L
パーオキシダーゼ 10U/mL
コレステロールエステル加水分解酵素(CHER) 1U/mL
コレステロール酸化酵素(CHOD) 3U/mL
ホスホリパーゼD 5U/mL
以下の第1試薬および第2試薬からなるRLP−C定量用キットを作製した。
・第1試薬
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
TOOS 0.3g/L
硫酸ナトリウム 2g/L
プロノンB−204 8g/L
ワンダサーフID−70 1g/L
パーオキシダーゼ(POD) 10U/mL
アスコルビン酸オキシダーゼ(AOD) 2U/mL
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5g/L
ワンダサーフID−70 1g/L
パーオキシダーゼ 10U/mL
コレステロールエステル加水分解酵素(CHER) 1U/mL
コレステロール酸化酵素(CHOD) 3U/mL
ホスホリパーゼD 5U/mL
以下の第1試薬および第2試薬からなるRLP−C定量用キットを作製した。
・第1試薬
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
TOOS 0.3g/L
硫酸ナトリウム 2g/L
プロノンB−208 8g/L
エマルゲンL−40 2g/L
パーオキシダーゼ(POD) 10U/mL
アスコルビン酸オキシダーゼ(AOD) 2U/mL
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5g/L
エマルゲンL−40 3g/L
パーオキシダーゼ 10U/mL
コレステロールエステル加水分解酵素(CHER) 1U/mL
コレステロール酸化酵素(CHOD) 3U/mL
ホスホリパーゼD 5U/mL
RLP−C定量用キット
以下の第1試薬および第2試薬からなるRLP−C定量用キットを作製した。当処方は、特開2001−231597号公報の実施例1に記載された処方である。
・第1試薬
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
TOOS 0.3g/L
硫酸ナトリウム 2g/L
プルロニックF−108 1g/L
パーオキシダーゼ(POD) 10U/mL
アスコルビン酸オキシダーゼ(AOD) 2U/mL
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5g/L
エマルゲンL−40 2g/L
パーオキシダーゼ 10U/mL
コレステロールエステル加水分解酵素(CHER) 1U/mL
コレステロール酸化酵素(CHOD) 2U/mL
ホスホリパーゼD 5U/mL
実施例1のキットを用いて、ヒト新鮮血清64検体について、各検体中のRLP−Cを日立7170型自動分析機により、以下の方法により定量した。
(1)検量線の作成
RLP−コレステロール「JIMRO」II(日本抗体研究所社製)を用いた測定より、RLP−C濃度が32.4mg/dLであることが判明している血清標準液を標準品として用いて、当該血清標準液を適宜希釈して調製した希釈血清を検量線作成用サンプルとした。
反応セルへ希釈血清(3.8μL)と第1試薬(0.18mL)とを添加し37℃で5分間加温し、反応液の吸光度(E1)を主波長600nm、副波長700nmで測定し(測光ポイント:16)、次いで、この反応液に、37℃に予め加温された第2試薬(0.06mL)を添加しさらに37℃で5分間加温し、反応液の吸光度(E2)を主波長600nm、副波長700nmで測定した(測光ポイント:32)。反応における吸光度変化(E2−E1)と希釈血清中のRLP−C濃度との関係から検量線を作成した。
(2)ヒト新鮮血清64検体中のRLP−Cの定量
血清標準液の代わりにヒト新鮮血清64検体を用いて、(1)と同様の方法により、該64検体各々について反応を行い、反応後の反応液の吸光度と(1)で作成した検量線とから、各検体中のRLP−C濃度を定量した。
実施例1のキットの代わりに実施例2のキットを用いる以外は実施例4の定量法と同様にして、日立7170型自動分析装置により、実施例4の定量において使用したヒト新鮮血清64検体の各検体中のRLP−C濃度を定量した。
実施例1のキットの代わりに実施例3のキットを用いる以外は実施例4の定量法と同様にして、日立7170型自動分析装置により、実施例4の定量において使用したヒト新鮮血清64検体の各検体中のRLP−C濃度を定量した。
RLP−Cの定量
実施例1のキットの代わりに比較例1のキットを用いる以外は実施例4の定量法と同様にして、日立7170型自動分析装置により、実施例4の定量において使用したヒト新鮮血清64検体の各検体中のRLP−C濃度を定量した。
RLP−コレステロール「JIMRO」II(日本抗体研究所社製)を用いた測定との相関
前述のヒト新鮮血清64検体について、RLP−コレステロール「JIMRO」II(日本抗体研究所社製)を用いて、各検体中のRLP−C濃度を定量した。
各検体について、実施例4〜6および比較例2の定量法とRLP−コレステロール「JIMRO」IIを用いた定量法との相関性を相関係数で評価した。その結果を第11表に示す。また、相関図を図1〜図4に示す。
III型高脂血症検体中のRLP−Cの定量
III型高脂血症患者の血清検体中のRLP−C濃度を、RLP−コレステロール「JIMRO」II(日本抗体研究所社製)、実施例1〜3および比較例1のキットを用いて決定した。なお、RLP−コレステロール「JIMRO」II(日本抗体研究所社製)を用いた測定より、RLP−C濃度が32.4mg/dLであることが判明している血清標準液を標準品として用いて、当該血清標準液を適宜希釈して調製した希釈血清を検量線作成用サンプルとした。その結果を第12表に示す。
以下の第1試薬および第2試薬からなるRLP−C定量用キットを作製した。
・第1試薬
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
TOOS 0.3g/L
硫酸ナトリウム 2g/L
プロノンB−208 8g/L
エマルゲンL−40 1g/L
ワンダサーフID−70 1g/L
パーオキシダーゼ(POD) 10U/mL
アスコルビン酸オキシダーゼ(AOD) 2U/mL
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5g/L
ワンダサーフID−70 1g/L
パーオキシダーゼ 10U/mL
コレステロールエステル加水分解酵素(CHER) 1U/mL
コレステロール酸化酵素(CHOD) 3U/mL
ホスホリパーゼD 5U/mL
以下の第1試薬および第2試薬からなるRLP−C定量用キットを作製した。
・第1試薬
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
TOOS 0.3g/L
硫酸ナトリウム 2g/L
プロノンB−208 8g/L
エマルゲンL−40 1g/L
ワンダサーフID−70 1g/L
パーオキシダーゼ(POD) 10U/mL
アスコルビン酸オキシダーゼ(AOD) 2U/mL
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5g/L
ワンダサーフID−70 1g/L
エマルゲンL−40 1g/L
パーオキシダーゼ 10U/mL
コレステロールエステル加水分解酵素(CHER) 1U/mL
コレステロール酸化酵素(CHOD) 3U/mL
ホスホリパーゼD 5U/mL
以下の第1試薬および第2試薬からなるRLP−C定量用キットを作製した。
・第1試薬
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
TOOS 0.3g/L
硫酸ナトリウム 2g/L
プロノンB−208 8g/L
エマルゲンL−40 1g/L
ワンダサーフID−90 1g/L
パーオキシダーゼ(POD) 10U/mL
アスコルビン酸オキシダーゼ(AOD) 2U/mL
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5g/L
ワンダサーフID−90 1g/L
パーオキシダーゼ 10U/mL
コレステロールエステル加水分解酵素(CHER) 1U/mL
コレステロール酸化酵素(CHOD) 3U/mL
ホスホリパーゼD 5U/mL
以下の第1試薬および第2試薬からなるRLP−C定量用キットを作製した。
・第1試薬
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
TOOS 0.3g/L
硫酸ナトリウム 2g/L
プロノンB−208 8g/L
エマルゲンL−40 1g/L
ワンダサーフID−90 1g/L
パーオキシダーゼ(POD) 10U/mL
アスコルビン酸オキシダーゼ(AOD) 2U/mL
MOPS(pH6.8) 20mmol/L
4−アミノアンチピリン 0.5g/L
ワンダサーフID−90 1g/L
エマルゲンL−40 1g/L
パーオキシダーゼ 10U/mL
コレステロールエステル加水分解酵素(CHER) 1U/mL
コレステロール酸化酵素(CHOD) 3U/mL
ホスホリパーゼD 5U/mL
定量用キットとして、実施例1のキットの代わりに実施例7のキットを、検体として、実施例5〜8で使用したヒト新鮮血清64検体の代わりにヒト新鮮血清35検体を用いる以外は実施例4の定量法と同様の方法により、日立7170型自動分析装置により、当該35検体の各検体中のRLP−C濃度を定量した。
実施例7のキットの代わりに実施例8のキットを用いる以外は実施例11の定量法と同様の方法により、日立7170型自動分析装置により、ヒト新鮮血清35検体の各検体中のRLP−C濃度を定量した。
実施例7のキットの代わりに実施例9のキットを用いる以外は実施例11の定量法と同様の方法により、日立7170型自動分析装置により、ヒト新鮮血清35検体の各検体中のRLP−C濃度を定量した。
実施例7のキットの代わりに実施例10のキットを用いる以外は実施例11の定量法と同様の方法により、日立7170型自動分析装置により、ヒト新鮮血清35検体の各検体中のRLP−C濃度を定量した。
RLP−コレステロール「JIMRO」II(日本抗体研究所社製)を用いた測定との相関
実施例11〜14で使用したヒト新鮮血清35検体について、RLP−コレステロール「JIMRO」II(日本抗体研究所社製)を用いて、各検体中のRLP−C濃度を定量した。
各検体について、実施例11〜14の定量法とRLP−コレステロール「JIMRO」IIを用いた定量法との相関性を相関係数で評価した。その結果を第13表に示す。また、相関図を図5〜図8に示す。
Claims (20)
- 試料を含有する水性媒体中、(a)(i)ポリオキシエチレンポリオキシブチレン共重合体、ポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレン長鎖分岐アルキルエーテルからなる群より選択される一種または二種以上の界面活性剤[以下、界面活性剤(d1)という]と、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレン短鎖分岐アルキルエーテルからなる群より選択される一種または二種以上の界面活性剤[以下、界面活性剤(d2)という]との組み合わせ、または、(ii)ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体[以下、界面活性剤(d3)という]と、ポリオキシエチレンアルキルアリールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンポリオキシプロピレン短鎖分岐アルキルエーテルからなる群より選択される一種または二種の界面活性剤[以下、界面活性剤(d4)という]との組み合わせ、並びに(b)リン脂質を加水分解する酵素の存在下、試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロールに、(c)コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素または(d)酸化型補酵素の存在下にコレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を作用させ、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素または還元型補酵素を定量することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロールの定量方法。
- 過酸化水素の定量がパーオキシダーゼの存在下、生成した過酸化水素を酸化発色型色原体と反応させ、生成した色素を定量することによって行われる請求項1記載の方法。
- 還元型補酵素の定量が反応液の吸光度を測定することによって行われる請求項1記載の方法。
- 還元型補酵素の定量が生成した還元型補酵素を還元発色型色原体と反応させ、生成した色素を定量することによって行われる請求項1記載の方法。
- リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼD、ホスホリパーゼCまたはホスホリパーゼA2である請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、および界面活性剤(d1)と界面活性剤(d2)との組み合わせ、または、界面活性剤(d3)と界面活性剤(d4)との組み合わせを含有することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用試薬。
- さらに過酸化水素定量用試薬を含有する請求項7記載の試薬。
- リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、および界面活性剤(d1)と界面活性剤(d2)との組み合わせまたは界面活性剤(d3)と界面活性剤(d4)との組み合わせを含有することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用試薬。
- さらに還元型補酵素定量用試薬を含有する請求項9記載の試薬。
- リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼD、ホスホリパーゼCまたはホスホリパーゼA2である請求項7〜11のいずれかに記載の試薬。
- 界面活性剤(d1)を含有する第1試薬と、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第2試薬とを含有し、かつ、界面活性剤(d2)を第1試薬および第2試薬の少なくとも一方に含有することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キット。
- 界面活性剤(d3)を含有する第1試薬と、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール酸化酵素を含有する第2試薬とを含有し、かつ、界面活性剤(d4)を第1試薬および第2試薬の少なくとも一方に含有することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キット。
- さらに過酸化水素定量用試薬を第1試薬、第2試薬の少なくとも一方に含有する請求項13または14記載のキット。
- 界面活性剤(d1)を含有する第1試薬と、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第2試薬とを含有し、界面活性剤(d2)を第1試薬および第2試薬の少なくとも一方に含有し、かつ、酸化型補酵素を第1試薬および第2試薬の少なくとも一方に含有することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キット。
- 界面活性剤(d3)を含有する第1試薬と、リン脂質を加水分解する酵素、コレステロールエステル加水分解酵素およびコレステロール脱水素酵素を含有する第2試薬とを含有し、界面活性剤(d4)を第1試薬および第2試薬の少なくとも一方に含有し、かつ、酸化型補酵素を第1試薬および第2試薬の少なくとも一方に含有することを特徴とする試料中のレムナント様リポ蛋白コレステロール定量用キット。
- さらに還元型補酵素定量用試薬を第1試薬、第2試薬の少なくとも一方に含有する請求項16または17記載のキット。
- リン脂質を加水分解する酵素がホスホリパーゼD、ホスホリパーゼC、または、ホスホリパーゼA2である請求項13〜19のいずれかに記載のキット。
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