KR20070107033A - 렘난트형 리포단백질 (ｒｌｐ) 중의 콜레스테롤의 정량방법, 시약 및 키트 - Google Patents

렘난트형 리포단백질 (ｒｌｐ) 중의 콜레스테롤의 정량방법, 시약 및 키트 Download PDF

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Abstract

시료의 분리 조작이 불필요한 렘난트형 리포단백질중의 콜레스테롤을 간편하게 감도 좋게 정량하는 정량방법, 시약 및 키트를 제공한다. 시료를 함유하는 수성 매체중, 특정의 계면활성제의 조합, 그리고, 인지질을 가수분해하는 효소의 존재하, 시료중의 렘난트형 입자 콜레스테롤을, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소 (산화형 조효소 공존)와 반응시키고, 생성한 과산화수소 또는 환원형 조효소를 정량하는 것을 특징으로 하는, 시료중의 렘난트형 입자 콜레스테롤의 정량 방법.
콜레스테롤, 렘난트형

Description

렘난트형 리포단백질 (ＲＬＰ) 중의 콜레스테롤의 정량 방법, 시약 및 키트 {METHOD, REAGENT AND KIT FOR QUANTIFYING CHOLESTEROL IN REMNANT-LIKE LIPOPROTEIN (RLP)}
본 발명은, 임상 검사에 있어서 동맥경화증 등의 위험인자로 여겨지는 렘난트형 (remnant-type) 입자 (이하, RLP 로 언급) 중의 콜레스테롤의 정량 방법, 시약 및 키트에 관한 것이다.
혈액중에는, 여러 가지의 리포단백질이 함유되고 있다. 이들의 리포단백질은 비중의 차이에 의해, 카일로미크론(chylomicron) (이하, CM 으로 언급), 초저밀도 리포단백질 (이하, VLDL 로 언급), 저밀도 리포단백질 (이하, LDL 로 언급), 고밀도 리포단백질 (이하, HDL 로 언급) 로 분류되고 있다. 각 리포단백질은, 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 인지질, 단백질 등의 구성 성분의 비율이 달라, 생체내에서 상이한 작용을 갖는다.
임상 검사에 있어서, HDL 중의 콜레스테롤은 동맥경화증의 위험 인자로서 부 (negative) 의 인자, LDL 중의 콜레스테롤은 동맥경화증의 위험 인자로서 정 (positive) 의 인자가 되어 있고, 임상 검사의 분야에서 빈번하게 측정되고 있다.
또, 지질의 대사 등에 기인해 생성하는 리포단백질 중의 콜레스테롤이 동맥 경화증의 위험 인자로서 LDL 중의 콜레스테롤보다 밀접한 지표가 되는 것이 나타나고 있다. 지질의 대사 등에 기인해 생성하는 리포단백질로서는, 예를 들어 RLP 를 들 수 있고 있다.
최근, 면역 흡착법에 따르는 RLP 중의 콜레스테롤 (이하, RLP-C 로 언급) 의 정량법이 개발되었다. 본 정량법에 있어서는, 항아포(anti-apo) A-I 모노클로날 항체 및 아포 B-48 을 인식하지 않는 특이적 항아포 B-100 모노클로날 항체를 함유하는 친화성 겔을 이용한 면역친화성 크로마토그래피에 의해 혈청으로부터 RLP 를 분리해, 이 분리한 RLP 에 포함되는 콜레스테롤이 정량된다. 본 정량법으로 적용되는 RLP 중의 콜레스테롤 정량용 시약이, JIMRO Co., Ltd. 로부터 판매되고 있다 [제품명: RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II] (비특허 문헌 1, 비특허 문헌 2 참조). 이 면역 흡착법에 따르는 RLP-C 의 정량법에 대해서는, 후생노동성에서 보험 점수가 부여되고 있다.
그러나 본 방법은 항체를 사용한 친화성 크로마토그래피 방법을 사용하는 것으로, 시료의 분리 조작을 필요로 하는 등 조작이 번잡해 시간이 걸린다.
또, 시료의 분리 조작이 불필요한 RLP-C 를 간편하게 감도 좋게 측정할 방법이 알려져 있다(특허 문헌 1 참조).
특허 문헌 1 : 일본 공개특허공보 2001-231597호
비특허 문헌 1 : 동맥 경화, 25(9,10), 371(1998)
비특허 문헌 2 : 클리니컬 케미스트리(Clinical Chemistry), 48(2), 217
본 발명의 목적은, 시료의 분리 조작이 불필요한 RLP-C 를 간편하게 감도 좋게 정량하는 정량 방법, 시약 및 키트를 제공하는 것에 있다.
본 발명은, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소가, 특정의 계면활성제의 조합 및 인지질을 가수분해하는 효소의 존재하, 렘난트형 입자 콜레스테롤에 특이적으로 작용한다고 하는 발견에 기초하여 완성되었다. 본 발명은, 하기 (1) 내지 (20) 에 관한 것이다.
(1) 시료를 함유하는 수성 매체중, (a) (i) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 공중합체, 폴리옥시에틸렌 스티렌화-페닐 에테르 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 장쇄 분기 알킬 에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 계면활성제 [이하, 계면활성제 (d1) 로 언급] 와, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 알킬아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 알킬 에테르 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 단쇄 분기 알킬 에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 계면활성제 [이하, 계면활성제 (d2) 로 언급] 와의 조합, 또는, (ii) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 [이하, 계면활성제 (d3) 으로 언급] 와, 폴리옥시에틸렌 알킬아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 알킬 에테르 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 단쇄 분기 알킬 에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종의 계면활성제 [이하, 계면활성제 (d4) 로 언급] 와의 조합, 및 (b) 인지질을 가수분해하는 효소의 존재하, 시료중의 렘난트형 입자 콜레스테롤에, (c) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 또는 (d) 산화형 조효소의 존재하에 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 작용시켜, 과산화수소 또는 환원형 조효소를 생성시키고, 생성한 과산화수소 또는 환원형 조효소를 정량하는 것을 포함하는, 시료 중의 렘난트형 콜레스테롤의 정량 방법.
(2) 과산화수소의 정량이 퍼옥시다제의 존재하, 생성한 과산화수소를 산화 발색형 색원체와 반응시켜, 생성한 색소를 정량함으로써 행해지는 상기 (1) 기재의 방법.
(3) 환원형 조효소의 정량이 반응액의 흡광도를 측정함으로써 행해지는 상기 (1) 기재의 방법.
(4) 환원형 조효소의 정량이 생성한 환원형 조효소를 환원 발색형 색원체와 반응시켜, 생성한 색소를 정량함으로써 행해지는 상기 (1) 기재의 방법.
(5) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 공중합체가 일반식 (I)
RO-(C2H4O)A-(C4H8O)B-(C2H4O)C-H (I)
(식 중, A, B 및 C 는 동일 또는 상이하게 1 내지 200 의 정수를 나타내고, R 은, 수소원자, 또는 직쇄 또는 분기의 알킬을 나타낸다) 로 표시되는 계면활성제인 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(6) 인지질을 가수분해하는 효소가 포스포리파제 D, 포스포리파제 C 또는 포스포리파제 A2 인 상기 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(7) 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 및 계면활성제 (d1) 과 계면활성제 (d2) 와의 조합, 또는, 계면활성제 (d3) 과 계면활성제 (d4) 와의 조합을 함유하는, 시료 중의 렘난트형 입자 콜레스테롤 정량용 시약.
(8) 추가로 과산화수소 정량용 시약을 함유하는 상기 (7) 기재의 시약.
(9) 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 산화형 조효소, 계면활성제 (d1) 과 계면활성제 (d2) 와의 조합 또는 계면활성제 (d3) 과 계면활성제 (d4) 와의 조합을 함유하는, 시료 중의 렘난트형 입자 콜레스테롤 정량용 시약.
(10) 추가로 환원형 조효소 정량용 시약을 함유하는 상기 (9) 기재의 시약.
(11) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 공중합체가 일반식 (I)
RO-(C2H4O)A-(C4H8O)B-(C2H4O)C-H (I)
(식 중, A, B 및 C 는 동일 또는 상이하게 1 내지 200 의 정수를 나타내고, R 은, 수소원자, 또는 직쇄 또는 분기의 알킬을 나타낸다) 로 표시되는 계면활성제인 상기 (7) 내지 (10) 중 어느 하나에 기재된 시약.
(12) 인지질을 가수분해하는 효소가 포스포리파제 D, 포스포리파제 C 또는 포스포리파제 A2 인 상기(7) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 시약.
(13) 계면활성제 (d1) 를 함유하는 제 1 시약과 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하고, 또한, 계면활성제 (d2) 를 제 1 시약 및 제 2 시약의 적어도 한쪽에 함유하는, 시료 중의 렘난트형 입자 콜레스테롤 정량용 키트.
(14) 계면활성제 (d3) 를 함유하는 제 1 시약과 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하고, 또한, 계면활성제 (d4) 를 제 1 시약 및 제 2 시약의 적어도 한쪽에 함유하는, 시료 중의 렘난트형 입자 콜레스테롤 정량용 키트.
(15) 추가로 과산화수소 정량용 시약을 제 1 시약 및 제 2 시약의 적어도 한쪽에 함유하는 상기 (13) 또는 (14) 기재의 키트.
(16) 계면활성제 (d1) 를 함유하는 제 1 시약과 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하는 시약을 함유하고, 계면활성제 (d2) 를 제 1 시약 및 제 2 시약의 적어도 한쪽에 함유하고, 또한, 산화형 조효소를 제 1 시약 및 제 2 시약의 적어도 한쪽에 함유하는, 시료 중의 렘난트형 입자 콜레스테롤 정량용 키트.
(17) 계면활성제 (d3) 를 함유하는 제 1 시약과 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하고, 계면활성제 (d4) 를 제 1 시약 및 제 2 시약의 적어도 한쪽에 함유하고, 또한, 산화형 조효소를 제 1 시약 및 제 2 시약의 적어도 한쪽에 함유하는, 시료 중의 렘난트형 입자 콜레스테롤 정량용 키트.
(18) 추가로 환원형 조효소 정량용 시약을 제 1 시약 및 제 2 시약의 적어도 한쪽에 함유하는 상기 (16) 또는 (17) 기재의 키트.
(19) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 공중합체가 일반식 (I)
RO-(C2H4O)A-(C4H8O)B-(C2H4O)C-H (I)
(식 중, A, B 및 C 는 동일 또는 상이하게 1 내지 200 의 정수를 나타내고, R 은, 수소원자, 또는 직쇄 또는 분기의 알킬을 나타낸다) 로 표시되는 계면활성제인 상기 (13), (15), (16) 또는 (18) 기재의 키트.
(20) 인지질을 가수분해하는 효소가 포스포리파제 D, 포스포리파제 C 또는 포스포리파제 A2 인 상기 (13) 내지 (19) 중 어느 하나에 기재된 키트.
발명의 효과
본 발명에 의해, 시료의 분리 조작이 불필요한 RLP-C 를 간편하게 감도 좋게 정량하는 방법, 시약 및 키트가 제공된다.
본 발명에 있어서, "렘난트형 입자 (RLP)" 용어는, VLDL 렘난트와 CM 렘난트를 종합적으로 언급한다. 또, "렘난트형 입자 콜레스테롤 (RLP-C)" 용어는, RLP 중의 에스테르형 콜레스테롤 및 유리형 콜레스테롤을 종합적으로 언급한다. 따라서, RLP-C 란, VLDL 렘난트 중의 에스테르형 콜레스테롤, VLDL 렘난트 중의 유리형 콜레스테롤, CM 렘난트 중의 에스테르형 콜레스테롤 및 CM 렘난트 중의 유리형 콜레스테롤을 포함한다.
본 발명의 정량 방법에 따라 전혈, 혈장, 혈청 등의 시료중의 RLP-C 를 정량할 수 있다.
본 발명의 특징은, 인지질을 가수분해하는 효소의 존재하에, RLP-C 에 특이적으로 콜레스테롤 정량 반응에 사용되는 효소를 작용시키는 계면활성제로서 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 공중합체 (이하, POE·POB 공중합체로 언급), 폴리옥시에틸렌 스티렌화-페닐 에테르(이하, POE 스티렌화-페닐 에테르로 언급) 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 장쇄 분기 알킬 에테르(이하, POE·POP 장쇄 분기 알킬 에테르로 언급) 로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 계면활성제 [이하, 계면활성제 (d1) 로 언급] 와, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 알킬아릴 에테르 (이하, POE·POP 알킬아릴 에테르로 언급), 폴리옥시에틸렌 알킬아릴 에테르 (이하, POE 알킬아릴 에테르로 언급), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 알킬 에테르 (이하, POE·POP 알킬 에테르로 언급) 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 단쇄 분기 알킬 에테르 (이하, POE·POP 단쇄 분기 알킬 에테르로 언급) 로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 계면활성제 [이하, 계면활성제 (d2) 로 언급] 와의 조합, 또는, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 (이하, POE·POP 공중합체로 언급) [이하, 계면활성제 (d3) 으로 언급] 와 폴리옥시에틸렌 알킬아릴 에테르 (이하, POE 알킬아릴 에테르로 언급), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 알킬 에테르 (이하, POE·POP 알킬 에테르로 언급) 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 단쇄 분기 알킬 에테르 (이하, POE·POP 단쇄 분기 알킬 에테르로 언급) 로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종의 계면활성제 [이하, 계면활성제 (d4) 로 언급] 와의 조합이 뛰어난 효과를 나타내는 것에 있다.
즉, 이들의 계면활성제의 조합은, 인지질을 가수분해하는 효소의 존재하, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소를 RLP-C 에 특이적으로 작용시킨다.
본 발명 방법에 의하면, 시료 중의 RLP-C 는, 수성 매체중, 인지질을 가수분해하는 효소의 존재하에 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소를 RLP-C 에 특이적으로 작용시키는 계면활성제의 조합, 즉, (i) 계면활성제 (d1) 와 계면활성제 (d2) 와의 조합, 또는, (ii) 계면활성제 (d3) 와 계면활성제 (d4) 와의 조합의 존재하, 시료 중의 RLP-C 에, (c) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 또는 (d) 산화형 조효소의 존재하에 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 작용시켜, 과산화수소 또는 환원형 조효소를 생성시켜, 생성한 과산화수소 또는 환원형 조효소를 정량함으로써 정량하는 것이 가능하다.
시료 중의 RLP-C 에, 산소의 존재하에 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소를 작용시킴으로써, 시료 중의 RLP 중의 에스테르형 콜레스테롤이 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소의 작용에 의해 유리형 콜레스테롤로 변환되어 그 변환되어 생성하는 유리형 콜레스테롤 및 RLP 중의 유리형 콜레스테롤과 산소로부터, 콜레스테롤 산화 효소의 작용에 의해 과산화수소가 생성된다.
또 시료중의 RLP-C 에, 산화형 조효소의 존재하에 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 작용시킴으로써, 시료 중의 RLP 중의 에스테르형 콜레스테롤이 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소의 작용에 의해 유리형 콜레스테롤로 변환되어, 그 변환되어 생성하는 유리형 콜레스테롤 및 RLP 중의 유리형 콜레스테롤과 산화형 조효소로부터 콜레스테롤 탈수소 효소의 작용에 의해 환원형 조효소가 생성한다.
효소 반응은, 계면활성제 (d1) 및 계면활성제 (d2) 의 조합, 또는, 계면활성제 (d3) 및 계면활성제 (d4) 의 조합, 그리고, 인지질을 가수분해하는 효소의 존재하, 콜레스테롤의 정량에 필요한 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소 (콜레스테롤 탈수소 효소를 이용하는 경우에는 산화형 조효소가 필요)를 함유하는 완충액 등의 수용액 중에서 행해진다.
계면활성제 (d1) 및 계면활성제 (d2) 의 조합, 및, 계면활성제 (d3) 및 계면활성제 (d4) 의 조합에 있어서는, 계면활성제 (d1), 계면활성제 (d2), 계면활성제 (d3), 계면활성제 (d4) 로서, 계면활성제 (d1) 내지 (d4) 를 구성하는 계면활성제를 1종 이상 이용해도 괜찮다.
계면활성제 (d1) 및 계면활성제 (d2) 의 조합으로서는, 표 1 내지 표 7 에 나타내는 조합이 예시된다.
계면활성제(d1) 계면활성제 (d2)
POE·POB 공중합체 POE·POP 공중합체
POE·POB 공중합체 POE 알킬아릴 에테르
POE·POB 공중합체 POE·POP 알킬 에테르
POE·POB 공중합체 POE·POP 단쇄 분지 알킬 에테르
POE·POB 공중합체 POE·POP 알킬아릴 에테르 POE 알킬아릴 에테르
POE·POB 공중합체 POE·POP 알킬아릴 에테르 POE·POP 알킬 에테르
POE·POB 공중합체 POE·POP 알킬아릴 에테르 POE·POP 단쇄 분지 알킬 에테르
POE·POB 공중합체 POE 알킬아릴 에테르 POE·POP 알킬 에테르
POE·POB 공중합체 POE 알킬아릴 에테르 POE·POP 단쇄 분지 알킬 에테르
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계면활성제 (d1) 및 계면활성제 (d2) 의 조합 중에서도, 인지질을 가수분해하는 효소의 존재 하에서 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소를 렘난트형 입자 콜레스테롤에 특이적으로 작용시키는 작용의 강한 조합이 바람직하다.
구체적으로, 표 1 에 기재된 POE·POB 공중합체와 계면활성제 (d2) 와의 조합이 바람직하다.
POE·POB 공중합체와 계면활성제 (d2) 와의 조합 중에서도, 표 8 에 나타내는 이하의 조합이 보다 바람직하다.
계면활성제 (d1) 계면활성제 (d2)
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계면활성제 (d3) 및 계면활성제 (d4) 의 조합으로서는, 다음의 표 9 에 나타내는 조합이 예시된다.
계면활성제 (d3) 계면활성제 (d2)
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계면활성제 (d3) 및 계면활성제 (d4) 의 조합 중에서도, 인지질을 가수분해하는 효소의 존재하에 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소를 RLP-C 에 특이적으로 작용시키는 작용의 강한 조합이 바람직하다.
구체적으로는, 표 10 에 나타내는 이하의 조합이 바람직하다.
계면활성제 (d3) 계면활성제 (d4)
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반응에 의해 생성하는 과산화수소 또는 환원형 조효소의 정량은 그 자체 공지의 방법에 따라 행해진다.
효소 반응의 반응액 중에는, 필요에 따라, 시클로덱스트린 혹은 그 유도체, 알부민 또는 리포단백질 응집제의 존재하에 실시할 수도 있다. 시클로덱스트린 또는 그 유도체, 알부민 또는 리포단백질 응집제에 의해 렘난트형 입자 이외의 리포단백질 콜레스테롤에 효소가 작용하는 것을 억제할 수 있는 것도 바람직하다.
또, 효소 반응의 반응액 중에는, 필요에 따라, RLP-C 의 정량 반응의 특이성에 영향을 미치지 않는 범위에서 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소를 활성화하기 위해서 자주 사용되는 효소 활성화제, 안정화제, 방부제, 간섭물 억제제, 생체 시료중의 글로블린 등의 단백질을 가용화하기 위한 여러 가지의 염류를 공존시킬 수도 있다.
콜레스테롤 에스테르 가수분해 반응, 유리 콜레스테롤의 산화 또는 탈수소 반응은, 인지질을 가수분해하는 효소, 및 계면활성제 (d1) 와 계면활성제 (d2) 와의 조합, 혹은, 계면활성제 (d3) 와 계면활성제 (d4) 와의 조합의 존재하에, 순차 실시할 수 있다. 또, 시료와 계면활성제를 미리 수용액 중 접촉시켜, 그 다음에, 이 용액에 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤의 반응에 관여하는 효소를 첨가해, 콜레스테롤의 반응을 실시할 수도 있다. 콜레스테롤의 반응은 RLP-C 의 정량에 필요한 성분을 모두 함유하는 수용액 중에서 실시하게 할 수도 있지만, RLP-C 의 정량에 필요한 성분을 2 내지 3의 그룹으로 나누어, 나눌 수 있었던 성분을 순차, 반응액에 첨가함으로써도 실시할 수가 있다. RLP-C 의 정량은, 바람직하게는, 후술의 RLP-C 정량용 키트를 이용해 행해진다.
수성 매체중, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소는, 통상 0.001 내지 400 U/mL 로, 바람직하게는 0.01 내지 200 U/mL, 보다 바람직하게는 0.05 내지 100 U/mL 의 농도로 사용된다.
수성 매체중, 인지질을 가수분해하는 효소의 농도는, 특히 제한은 없지만, 0.001 내지 400 U/mL 가 바람직하고, 0.01 내지 200 U/mL 가 보다 바람직하고, 0.05 내지 100 U/mL 가 특히 바람직하다.
수성 매체중, 계면활성제 (d1), 계면활성제 (d2), 계면활성제 (d3) 및 계면활성제 (d4) 의 농도는, 각각에, 0.001 내지 5 (w/v)% 가 바람직하고, 0.005 내지 2.5 (w/v)% 가 보다 바람직하고, 0.05 내지 1 (w/v)% 가 특히 바람직하다.
효소 반응은 통상 10 내지 50 ℃, 바람직하게는 20 내지 40 ℃ 의 온도로 행해져 통상 2 내지 30 분에 완료한다.
생성한 과산화수소는 예를 들어 퍼옥시다제의 존재하 과산화수소와 산화에 의해 색소로 변환되는 색원체와의 반응에 의해 색소를 생성시켜, 반응액의 흡광도의 변화를 예를 들어 생성한 색소의 흡수 극대 파장으로 측정함으로써 정량된다. 또 생성한 과산화수소는 예를 들어 화학 발광 물질, 예를 들어 루미놀, 이소루미놀, 루시게닌, 아크리디늄에스테르 등과 과산화수소를 반응시켜 포톤을 생성시켜, 생성한 포톤을 정량함으로써 정량된다.
환원형 조효소는 예를 들어 효소 반응에 의해 생성한 환원형 조효소 함유액의 흡광도를 300 내지 500 nm, 바람직하게는 330 내지 400 nm, 보다 바람직하게는 340 nm부근에서 측정함으로써 정량할 수 있다. 또, 생성한 환원형 조효소는 예를 들어 디아포라제 또는 전자 캐리어의 존재하 환원형 조효소와 환원에 의해 색소로 변환되는 색원체와의 반응에 의해 색소를 생성시켜, 반응액의 흡광도의 변화를 예를 들어 생성한 색소의 흡수 극대 파장으로 측정함으로써 정량된다. 전자 캐리어의 예는 1-메톡시-5-메틸페나지움 메틸 술페이트이다.
시료 중의 RLP-C 의 농도는, 예를 들어 기지의 농도의 RLP-C 를 함유하는 시료를 이용해, 콜레스테롤 농도와 과산화수소 또는 환원형 조효소의 양과의 관계를 나타내는 검량선을 작성해, 이 검량선으로부터 구할 수 있다.
콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소는 콜레스테롤 에스테르를 가수분해할 수 있는 효소, 예를 들어 콜레스테롤 에스테라아제, 리포프로테인리파제 등이 이용되어 동물, 식물 또는 미생물 유래 또는, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 효소, 화학적으로 변성된 효소 등을 사용할 수 있다. 화학적으로 변성된 효소로서는, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜을 주성분으로 하는 기, 폴리프로필렌 글리콜과 폴리에틸렌 글리콜의 공중합체를 갖는 기, 수용성 다당류를 함유하는 기, 술포프로필기, 술포부틸기, 폴리우레탄기, 킬레이트 기능을 갖는 기 등의 화학 변성기로 변성된 효소가 포함된다. 특히 폴리에틸렌 글리콜을 주성분으로 하는 기로 변성된 효소가 바람직하다. 수용성 다당류로서는, 예를 들어 덱스트란, 풀루란, 가용성 전분 등이 포함된다.
화학적으로 변성하기 위한 시약 (화학 변성제) 은, 상기의 화학 변성기와 효소의 아미노기, 카르복실기, 술프히드릴기 등을 반응할 수 있는 관능기 또는 구조를 합친 화합물 등이 포함된다. 효소 중의 아미노기와 반응할 수 있는 관능기 또는 구조는, 예를 들어 카르복실기, 활성 에스테르 기 (N-히드록시숙신이미드기등), 산무수물, 산염화물, 알데히드, 에폭시드기, 1,3-프로판술톤, 1,4-부탄술톤 등이 포함된다. 효소 중의 카르복실기와 반응할 수 있는 관능기 또는 구조는, 예를 들어 아미노기를 포함한다. 효소 중의 술프히드릴기와 반응성이 있는 기 또는 구조는, 예를 들어 말레이미드기, 디술피드, α-할로에스테르(α-요오도에스테르 등) 등을 포함한다.
화학 변성제의 예는, 폴리에틸렌 글리콜을 주성분으로 하는 기와 N-히드록시숙신이미드기를 갖는 Sunbright VFM-4101, Sunbright MEAC-50 HS, Sunbright MEC-50 HS (모두 NOF Corporation 제조), 폴리알킬렌 글리콜을 주성분으로 하는 기와 산무수물 구조를 갖는 Sunbright AKM 시리즈 (예를 들어, Sunbright (KM-1510 등), Sunbright ADM 시리즈 및 Sunbright ACM 시리즈 (모두 NOF Corporation 제조), 폴리에틸렌 글리콜을 주성분으로 하는 기와 에폭시드기를 갖는 EPOX-3400 및 M-EPOX-5000 (모두 Sheawater Polymers 제조), 킬레이트 기능을 갖는 기와 산무수물 구조를 갖는 디에틸렌트리아민-N,N,N',N'',N''-펜타무수아세트산 (DTPA anhydride; Dojindo Laboratories), 폴리우레탄 변성용의 활성화 폴리우레탄 P4000 (Boehringer Mannheim), 덱스트란 변성용의 덱스트란 T40, 활성화 TCT (Boehringer Mannheim) 등을 포함한다.
효소의 화학 변성은, 예를 들어 이하의 방법으로 실시할 수가 있다.
우선, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소를 pH 8.0 이상의 완충액, 예를 들어 HEPES 완충액에 용해해, 0 내지 55 ℃ 로 0.01 내지 500 배 몰량의 화학 변성제를 첨가하고, 5 분 내지 5 시간 교반한다. 실제의 효소 반응에 있어서는, 화학적으로 변성된 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소로서 이 반응액 그것 뿐만 아니라, 필요에 따라 한외여과막 등에 의해 미반응의 화학 변성제 등을 제거한 것도, 사용할 수 있다.
콜레스테롤 산화 효소는 동물, 식물 또는 미생물 유래 효소, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 효소, 화학적으로 변성된 효소 등을 이용할 수가 있다.
화학 변성 효소는, 상기 기술한 화학 변성 방법에 의해 제작할 수 있다.
콜레스테롤 탈수소 효소는, 산화형 조효소의 존재하에 콜레스테롤을 산화해 환원형 조효소를 생성하는 능력을 갖는 효소이며, 동물, 식물 또는 미생물 유래의 효소, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 효소, 화학적으로 변성된 효소를 이용할 수 있다. 화학적으로 변성된 효소는, 예를 들어 상기 기술한 화학 변성제를 이용해, 상기 기술한 화학 변성 방법에 의해 제작할 수 있다.
인지질을 가수분해하는 효소로서는, 인지질을 분해하는 능력을 갖는 효소이면 특히 제한되지 않는다. 예를 들어 동물, 식물 및 미생물 유래의 인지질을 분해하는 효소를 들 수 있다. 구체적인 인지질을 분해하는 효소로서는, 예를 들어 포스포리파제 D, 포스포리파제 C, 포스포리파제 A2, 리소포스포리파제 등을 들 수 있다.
본 발명의 콜레스테롤 탈수소 효소를 이용하는 정량법에 있어서 사용되는 산화형 조효소의 예는, NAD, NADP, 티오-NAD, 티오-NADP 이다.
본 발명에 있어서 사용되는 계면활성제 (d1) 는, 본 발명에 있어서 사용되는 계면활성제 (d2) 와 조합되어, 인지질을 가수분해하는 효소의 존재하, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소를 RLP-C 에 특이적으로 작용시키는 기능을 갖는다. 계면활성제 (d1) 및 계면활성제 (d2) 는, 각각 단독으로 사용되었을 경우에는, 반드시, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소를 RLP-C 에 특이적으로 작용시키는 기능이 높을 필요는 없다.
본 발명에 있어서 사용되는 계면활성제 (d3) 는, 본 발명에 있어서 사용되는 계면활성제 (d4) 와 조합되어, 인지질을 가수분해하는 효소의 존재하, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소를 RLP-C 에 특이적으로 작용시키는 기능을 갖는다. 계면활성제 (d3) 및 계면활성제 (d4) 는, 각각 단독으로 사용되었을 경우에는, 반드시, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 혹은 콜레스테롤 탈수소 효소를 RLP-C 에 특이적으로 작용시키는 기능이 높을 필요는 없다.
POE·POB 공중합체는, 폴리옥시에틸렌과 폴리옥시부틸렌과의 랜덤 중합체, 블록 중합체를 포함해, 예를 들어 일반식 (I)
RO-(C2H4O)A-(C4H8O)B-(C2H4O)C-H (I)
(식 중, A, B 및 C 는 동일 또는 상이하게 1 내지 200 의 정수를 나타내고, R 은 수소원자, 직쇄 또는 분기의 알킬을 나타낸다) 로 표시되는 화합물 [이하, 화합물 (I) 로 언급됨] 등을 들 수 있다. 일반식 (I) 중, R 는 수소원자가 바람직하다.
화합물 (I) 에 있어서의 직쇄 또는 분기의 알킬은, 탄소수가 1 내지 30 의, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 이소헥실, 헵틸, 이소헵틸, 옥틸, 이소옥틸, 노닐, 이소노닐, 데실, 이소데실, 운데실, 이소운데실, 도데실, 이소도데실, 트리데실, 이소트리데실, 테트라데실, 이소테트라데실, 펜타데실, 이소펜타데실, 헥사데실, 이소헥사데실, 헵타데실, 이소헵타데실, 옥타데실, 이소옥타데실, 노나데실, 이소노나데실, 이코실, 이소이코실, 헤네이코실, 이소헤네이코실, 도코실(베헤닐), 이소도코실, 트리코실, 이소트리코실, 테트라코실, 이소테트라코실, 펜타코실, 이소펜타코실, 헥사코실, 이소헥사코실, 헵타코실, 이소헵타코실, 옥타코실, 이소옥타코실, 노나코실, 이소노나코실, 트리아콘틸, 이소트리아콘틸 등을 포함한다.
폴리옥시부틸렌 부분의 분자량으로서는, 700 이상이 바람직하고, 1,000 이상이 보다 바람직하고, 1,500 이상이 특히 바람직하다.
화합물 (I) 의 구체예는, Pronon B-204, Pronon B-208 (이상, NOF Corporation 제조)을 포함한다.
POE 스티렌화-페닐 에테르의 예는, BLAUNON DSP-9, BLAUNON DSP-12.5, BLAUNON DSP-20, BLAUNON DSP-10, BLAUNON TSP-5, BLAUNON TSP-7.5, BLAUNON TSP-16, BLAUNON TSP-20 및 BLAUNON TSP-50 (모두 Aoki Oil Industrial Co., Ltd. 제조) 등이고, 시판되고 있다.
POE·POP 장쇄 분기 알킬 에테르에 있어서의 장쇄 분기 알킬로서는, 예를 들어 탄소수 20 내지 30 의 분기 알킬, 예를 들어 이소이코실, 옥틸도데실, 이소헤네이코실, 이소도코실, 이소트리코실, 이소테트라코실, 데실테트라데실, 이소펜타코실, 이소헥사코실, 도데실테트라데실, 이소헵타코실, 이소옥타코실, 이소노나코실, 이소트리아콘틸 등을 들 수 있다. POE·POP 장쇄 분기 알킬 에테르의 구체예는, UNILUB MT-0620 B (NOF Corporation 제조) 등이며, 시판되고 있다.
POE·POP 알킬아릴 에테르 및 POE 알킬아릴 에테르에 있어서의 알킬로서는, 예를 들어 탄소수 8 이상의, 예를 들어 옥틸 및 노닐 등을 들 수 있고, 아릴로서는, 예를 들어 페닐 및 나프틸 등을 들 수 있다. 아릴로서는, 페닐이 바람직하다.
POE·POP 알킬 에테르에 있어서의 알킬로서는, 탄소수 6 내지 30 의, 예를 들어 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실(라우릴), 도데실, 테트라데실(미리스틸), 펜타데실, 헥사데실(세틸), 헵타데실, 옥타데실(스테아릴), 노나데실, 이코실, 헤네이코실, 도코실(베헤닐), 트리코실, 테트라코실, 펜타코실, 헥사코실, 헵타코실, 옥타코실, 노나코실, 트리아콘틸 등을 들 수 있다.
POE·POP 단쇄 분기 알킬 에테르에 있어서의 단쇄 분기 알킬로서는, 탄소수 6 내지 19 의 분기 알킬, 예를 들어 이소헥실, 이소헵틸, 이소옥틸, 이소노닐, 이소데실, 이소운데실, 이소도데실, 이소트리데실, 이소테트라데실, 이소펜타데실, 이소헥사데실, 이소헵타데실, 이소옥타데실 및 이소노나데실 등을 들 수 있다.
POE·POP 알킬아릴 에테르로서는, 예를 들어 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 알킬페닐 에테르 등을 들 수 있다. 구체예는, Emulgen L-40 (Kao Corporation 제조), Acroneces KP-189 R (NOF Corporation 제조) 등이고, 시판되고 있다.
POE 알킬아릴 에테르로서는, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 알킬페닐 에테르 등을 들 수 있다. 구체예는, Emulgen 911, Emulgen 810 (Kao Corporation 제조), Nonion HS-210, Nonion HS-215, Nonion NS-208.5 및 Nonion HS-208 (모두 NOF Corporation 제조) 등이고, 시판되고 있다.
POE·POP 알킬 에테르 및 POE·POP 분기 알킬 에테르로서는, 친수성 - 친유성 밸런스 (HLB) 가 9 내지 20 의 POE·POP 알킬 에테르 및 POE·POP 분기 알킬 에테르가 바람직하다. POE·POP 알킬 에테르의 구체예는, Wondersurf RL-100 및 Wondersurf S-1000 (모두 Aoki Oil Industrial Co., Ltd. 제조) 등이고, 시판되고 있다. POE·POP 단쇄 분기 알킬 에테르의 구체예는, Wondersurf ID-70 및 Wondersurf ID-90 (모두 Aoki Oil Industrial Co., Ltd. 제조) 등이고, 시판되고 있다.
POE·POP 공중합체로서는, 폴리옥시에틸렌과 폴리옥시프로필렌과의 랜덤 중합체 및 블록 중합체를 포함해, 예를 들어 일반식 (II)
RO-(C2H4O)A-(C3H6O)B-(C2H4O)C-H (II)
(식 중, A, B 및 C 는 동일 또는 상이하게 1 내지 200 의 정수를 나타내고, R 은 수소원자, 직쇄 또는 분기의 알킬을 나타낸다) 로 표시되는 화합물 등을 들 수 있다. 일반식 (II) 중, R 은 수소원자가 바람직하다.
화합물 (II) 에 있어서의 직쇄 또는 분기의 알킬은, 상기 기술한 화합물 (I) 에 있어서의 직쇄 또는 분기의 알킬과 동일한 것을 들 수 있다.
본 화합물에 있어서의 폴리옥시프로필렌 부분의 분자량으로서는, 2,050 이상이 바람직하고, 2,750 이상이 보다 바람직하고, 3,250 이상이 특히 바람직하다.
구체예는, Pluronic F-108, Pluronic L-121, Pluronic L-122, Pluronic L-101 및 Pluronic L-103 (모두 Adeka Corporation 제조), Pronon 102, Pronon 104, Pronon 201, Pronon 204, Pronon 208 및 Pronon 202 B (모두 NOF Corporation 제조) 등이고, 시판되고 있다.
수성 매체는, 예를 들어 탈이온수, 증류수, 완충액 등을 포함해, 완충액이 바람직하다. 완충액에 이용하는 완충제의 예는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 완충제, 인산 완충제, 붕산 완충제, 굿(Good)의 완충제 등을 들 수 있다.
굿의 완충제로서는, 예를 들어 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES), 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시메틸)메탄 (Bis-Tris), N-(2-아세트아미도)이미노2아세트산 (ADA), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (PIPES), N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄술폰산 (ACES), 3-모르폴리노-2-히드록시프로판술폰산 (MOPSO), N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산 (BES), 3-모르폴리노프로판술폰산 (MOPS), N-[트리스(히드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄술폰산 (TES), 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 (HEPES), 3-[N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]-2-히드록시프로판술폰산 (DIPSO), N-[트리스(히드록시메틸)메틸]-2-히드록시-3-아미노프로판술폰산 (TAPSO), 피페라진-N,N'-비스(2-히드록시프로판술폰산) (POPSO), 3-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-히드록시프로판술폰산 (HEPPSO), 3-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라지닐]프로판술폰산 [(H)EPPS], N-[트리스(히드록시메틸)메틸]글리신 (Tricine), N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신 (Bicine), N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산 (TAPS), N-시클로헥실-2-아미노에탄술폰산 (CHES), N-시클로헥실-3-아미노-2-히드록시프로판술폰산 (CAPSO), N-시클로헥실-3-아미노프로판술폰산 (CAPS) 을 포함한다.
완충액은 통상 4 내지 10, 바람직하게는 5 내지 9 의 pH 로, 통상 0.001 내지 0.5 mol/L, 바람직하게는 0.005 내지 0.2 mol/L, 보다 바람직하게는 0.01 내지 0.1 mol/L 의 농도로 사용되다.
과산화수소 정량에 사용되는 색원체로서 예를 들어 퍼옥시다제의 존재하 과산화수소와 산화에 의해 색소로 변환되는 색원체가 사용된다. 그 예는 류코(leuco)형 색원체 및 산화 커플링형 색원체를 포함한다. 류코형 색원체는, 과산화수소 및 퍼옥시다제 등의 과산화 활성 물질의 존재하, 단독으로 색소로 변환되는 물질이다.
류코형 색원체의 예는 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (CCAP), 10-(N-메틸카르바모일)-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (MCDP), N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 나트륨 염 (DA-64), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민 및 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민 (BCMA) 이다.
산화 커플링형 색원체는, 과산화수소 퍼옥시다제 등의 과산화 활성 물질의 존재하, 2개의 화합물이 산화에 의해 커플링하여 색소로 변환되는 색원체이다. 2개의 화합물의 조합의 예는 커플러와 아닐린류와의 조합, 커플러와 페놀류와의 조합을 포함한다.
커플러의 예는, 4-아미노안티피린 (4-AA) 및 3-메틸-2-벤조티아졸리논 히드라진이다. 아닐린류의 예는 N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린 (MAOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (DAOS), N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOPS), N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (HDAOS), N,N-디메틸-3-메틸아닐린, N,N-디(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌디아민 (EMSE), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-아세틸에틸렌디아민, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-4-플루오로-3,5-디메톡시아닐린 (F-DAOS) 을 포함한다. 페놀 종류의 예는 페놀, 4-클로로페놀, 3-메틸페놀, 3-히드록시-2,4,6-트리요오도벤조산 (HTIB) 을 포함한다.
퍼옥시다제는, 통상 1 내지 100 kU/L 의 농도로 사용된다. 색원체는, 통상 0.01 내지 10 g/L 의 농도로 사용된다.
환원형 조효소의 정량에 사용되는 색원체로서 예를 들어 디아포라제 또는 전자 캐리어의 존재하 환원형 조효소와 환원에 의해 색소로 변환되는 색원체가 사용된다. 그 예는,3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로미드 (MTT), 2-(4-요오도페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨 모노나트륨 염 (WST-1), 2-(4-요오도페닐)-3-(2,4-디니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸륨 모노나트륨 염 (WST-3)을 포함한다.
디아포라제 및 전자 캐리어는, 통상 1 내지 100 kU/L 의 농도로 사용된다. 색원체는, 통상 0.01 내지 10 g/L 의 농도로 사용된다.
시클로덱스트린 또는 그 유도체의 예는 시클로덱스트린, 디메틸시클로덱스트린, 트리메틸시클로덱스트린, 히드록시에틸시클로덱스트린, 히드록시프로필시클로덱스트린, 카르복시메틸시클로덱스트린, 글리코실시클로덱스트린, 말토실시클로덱스트린, 시클로덱스트린 술페이트, 시클로덱스트린 폴리머이고, 히드록시에틸시클로덱스트린 및 히드록시프로필시클로덱스트린이 바람직하다.
시클로덱스트린의 예는 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린이다.
디메틸시클로덱스트린의 예는 디메틸-α-시클로덱스트린, 디메틸-β-시클로덱스트린, 디메틸-γ-시클로덱스트린이다.
트리메틸시클로덱스트린의 예는 트리메틸-α-시클로덱스트린, 트리메틸-β-시클로덱스트린, 트리메틸-γ-시클로덱스트린이다.
히드록시에틸시클로덱스트린의 예는 히드록시에틸-α-시클로덱스트린, 히드록시에틸-β-시클로덱스트린, 히드록시에틸-γ-시클로덱스트린이다.
히드록시프로필시클로덱스트린의 예는 히드록시프로필-α-시클로덱스트린, 히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 히드록시프로필-γ-시클로덱스트린이다.
카르복시메틸시클로덱스트린의 예는 카르복시메틸-α-시클로덱스트린, 카르복시메틸-β-시클로덱스트린, 카르복시메틸-γ-시클로덱스트린이다.
글리코실시클로덱스트린의 예는 글리코실-α-시클로덱스트린, 글리코실-β-시클로덱스트린, 글리코실-γ-시클로덱스트린이다.
말토실시클로덱스트린의 예는 말토실-α-시클로덱스트린, 말토실-β-시클로덱스트린, 말토실γ-시클로덱스트린이다.
시클로덱스트린 술페이트의 예는 α-시클로덱스트린 술페이트, β-시클로덱스트린 술페이트, γ-시클로덱스트린 술페이트이다.
시클로덱스트린 폴리머의 예는 β-시클로덱스트린 폴리머이다. 2 종류 이상의 시클로덱스트린 또는 그 유도체를 조합하여 사용할 수도 있다.
수성 매체중, 시클로덱스트린 혹은 그 유도체의 농도는, 0.001 내지 5 (w/v)% 가 바람직하고, 0.005 내지 2.5 (w/v)% 가 보다 바람직하고, 0.01 내지 1 (w/v)% 가 특히 바람직하다.
알부민의 예는 소, 말, 양, 인간 유래의 알부민을 포함해, 소 혈청 알부민 (BSA) 이 바람직하다. 유전자 공학적인 수법에 의해 제조된 알부민도 이용할 수가 있다. 2 종류 이상의 알부민을 조합하여 사용할 수도 있다. 수성 매체중, 알부민의 농도는, 0.001 내지 5 (w/v)% 가 바람직하고, 0.005 내지 2.5 (w/v)% 가 보다 바람직하고, 0.01 내지 1 (w/v)% 가 특히 바람직하다.
리포단백질 응집제로서는 인 텅스텐산염, 덱스트란 황산염, 헤파린 등의 폴리음이온이, 마그네슘, 칼슘, 코발트 등의 2가의 금속염이 제공할 수 있다. 수성 매체중, 리포단백질 응집제의 농도는, 각각 독립적으로 0.001 내지 5 (w/v)% 가 바람직하고, 0.005 내지 2.5 (w/v)% 가 보다 바람직하고, 0.01 내지 1 (w/v)% 가 특히 바람직하다.
효소 활성화제의 예는, 담즙산류, 알킬 술폰산염 등의 음이온성 계면활성제를 포함한다. 담즙산류의 예는, 콜산, 데옥시콜산, 타우로콜산, 케노데옥시콜산을 포함한다. 알킬술폰산염의 예는 1-펜타술폰산염, 1-헥사술폰산염, 1-헵타술폰산염, 1-옥타술폰산염을 포함한다. 알킬술폰산염에 있어서의 염의 예는 암모늄 염, 리튬 염, 나트륨 염, 칼륨 염, 마그네슘 염, 칼슘 염을 포함한다.
안정화제의 예는, 에틸렌디아민 4아세트산(EDTA), 수크로스, 염화 칼슘을 포함한다.
방부제의 예는, 아지화 나트륨, 항생 물질을 포함한다.
간섭 억제제의 예는, 아스코르브산의 영향을 억제하기 위한 아스코르브산 옥시다제, 빌리루빈의 영향을 억제하기 위한 페로시안화 칼륨을 포함한다.
염류의 예는, 염화 리튬, 황산 리튬, 염화 나트륨, 황산 나트륨, 염화 칼륨, 황산 칼륨, 염화 마그네슘, 황산 마그네슘, 아세트산 마그네슘, 염화 암모늄, 황산 마그네슘, 질산 마그네슘, 질산 칼슘을 포함한다.
본 발명의 RLP-C 의 정량 방법으로서 이하의 구체적 양태를 예시할 수 있다.
정량방법 1
(1) 수성 매체중, 시료, 인지질을 가수분해하는 효소, 계면활성제 (d1), 계면활성제 (d2), 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소의 존재하, 효소 반응을 실시하고,
(2) 생성하는 과산화수소를 측정하고,
(3) (2) 에서 측정한 값과 미리 작성한 검량선으로부터, 시료 중의 RLP-C 농도를 결정하는 방법.
정량방법 2
(1) 수성 매체중, 시료, 인지질을 가수분해하는 효소, 계면활성제 (d3), 계면활성제 (d4), 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소의 존재하, 효소 반응을 실시하고,
(2) 생성하는 과산화수소를 측정하고,
(3) (2) 에서 측정한 값과 미리 작성한 검량선으로부터, 시료 중의 RLP-C 농도를 결정하는 방법.
정량방법 3
(1) 수성 매체중, 시료, 인지질을 가수분해하는 효소, 계면활성제 (d1), 계면활성제 (d2), 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소의 존재하, 효소 반응을 실시하고,
(2) 생성하는 환원형 조효소를 측정하고,
(3) (2) 에서 측정한 값과 미리 작성한 검량선으로부터, 시료 중의 RLP-C 농도를 결정하는 방법.
정량방법 4
(1) 수성 매체중, 시료, 인지질을 가수분해하는 효소, 계면활성제 (d3), 계면활성제 (d4), 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소의 존재하, 효소 반응을 실시하고,
(2) 생성하는 환원형 조효소를 측정하고,
(3) (2) 에서 측정한 값과 미리 작성한 검량선으로부터, 시료 중의 RLP-C 농도를 결정하는 방법.
(RLP-C 정량용 시약)
본 발명의 RLP-C 정량용 시약은, 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 및, 계면활성제 (d1) 와 계면활성제 (d2) 의 조합 혹은 계면활성제 (d3) 와 계면활성제 (d4) 의 조합을 함유한다. 그 시약은, 과산화수소 정량용 시약을 함유할 수 있다. 과산화수소 정량용 시약의 예는, 퍼옥시다제 및 상기 기술한 퍼옥시다제의 존재하 과산화수소와 산화에 의해 색소로 변환되는 색원체를 함유하는 시약을 들 수 있다.
또, 본 발명의 기타 RLP-C 정량용 시약은, 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 및, 계면활성제 (d1) 와 계면활성제 (d2) 의 조합 혹은 계면활성제 (d3) 와 계면활성제 (d4) 의 조합을 함유한다. 그 시약은, 환원형 조효소 정량용 시약을 함유할 수 있다.
환원형 조효소 정량용 시약의 예는, 디아포라제 또는 전자 캐리어 및 상기 기술한 디아포라제 또는 전자 캐리어의 존재하 환원형 조효소와 환원에 의해 색소로 변환되는 색원체를 함유하는 시약을 들 수 있다.
본 발명의 RLP-C 정량용 시약으로서 이하의 구체적 양태를 예시할 수 있다.
시약 1
콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 계면활성제 (d1), 계면활성제 (d2) 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
시약 2
콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 계면활성제 (d3), 계면활성제 (d4) 및 과산화수소 측정용 시약을 함유하는 시약.
시약 3
콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 계면활성제 (d1) 및 계면활성제 (d2) 를 함유하는 시약.
시약 4
콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 계면활성제 (d3) 및 계면활성제 (d4) 를 함유하는 시약.
시약 5
콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 계면활성제 (d1), 계면활성제 (d2) 및 환원형 조효소 측정용 시약을 함유하는 시약.
시약 6
콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 계면활성제 (d3), 계면활성제 (d4) 및 환원형 조효소 측정용 시약을 함유하는 시약.
(RLP-C 정량용 키트)
본 발명의 RLP-C 정량용 시약은, 키트의 형태로 보존, 유통 및 사용되는 것이 바람직하다. 키트의 형태는, 2 시약 및 3 시약이 사용되지만, 2 시약 계가 바람직하다.
2 시약 계 (제 1 시약 및 제 2 시약) 의 키트에 있어서, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소와 콜레스테롤 산화 효소 또는 콜레스테롤 탈수소 효소와는 다른 시약에 함유되어도 괜찮지만, 동일 시약에 함유되는 키트가 바람직하고, 특히, 제 2 시약에 함유되는 키트가 바람직하다. 인지질을 가수분해하는 효소는, 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 한쪽 또는 양쪽 모두에 함유되지만, 제 2 시약에 함유되는 것이 바람직하다.
계면활성제 (d1) 과 계면활성제 (d2) 는, 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 한쪽 또는 양쪽 모두에 함유되지만, 계면활성제 (d1) 는 제 1 시약에 함유되는 것이 바람직하다. 계면활성제 (d3) 와 계면활성제 (d4) 는, 제 1 시약, 제 2 시약의 어느 한쪽 또는 양쪽 모두에 함유되지만, 계면활성제 (d3) 는 제 1 시약에 함유되는 것이 바람직하다.
산화형 조효소는, 제 1 시약, 제 2 시약의 적어도 한쪽에 함유된다. 과산화수소 정량용 시약은, 제 1 시약, 제 2 시약의 적어도 한쪽에 함유되지만, 당해 시약이 산화 커플링형 색원체를 함유하는 경우에는, 산화 커플링형 색원체의 각각의 화합물은 바람직하게는 다른 시약에 함유된다. 환원형 조효소 정량용 시약은, 제 1 시약, 제 2 시약의 적어도 한쪽에 함유된다.
본 발명의 RLP-C 정량용 키트로서 이하의 구체적 양태를 예시할 수 있다.
키트 1
제 1 시약
계면활성제 (d1) 및 과산화수소 정량용 시약의 일부를 함유하는 시약.
제 2 시약
계면활성제 (d2), 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 정량용 시약의 나머지의 일부를 함유하는 시약.
키트 2
제 1 시약
계면활성제 (d3) 및 과산화수소 정량용 시약의 일부를 함유하는 시약.
제 2 시약
계면활성제 (d4), 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소 및 과산화수소 정량용 시약의 나머지의 일부를 함유하는 시약.
키트 3
제 1 시약
계면활성제 (d1) 를 함유하는 시약.
제 2 시약
계면활성제 (d2), 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하는 시약.
키트 4
제 1 시약
계면활성제 (d3) 를 함유하는 시약.
제 2 시약
계면활성제 (d4), 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤 에스테르 가수 분해 효소, 산화형 조효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하는 시약.
키트 5
제 1 시약
계면활성제 (d1) 를 함유하는 시약.
제 2 시약
계면활성제 (d2), 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 환원형 조효소 정량용 시약을 함유하는 시약.
키트 6
제 1 시약
계면활성제 (d3) 를 함유하는 시약.
제 2 시약
계면활성제 (d4), 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소 및 환원형 조효소 정량용 시약을 함유하는 시약.
본 발명의 RLP-C 정량용 시약 및 키트는, 시료 중의 RLP-C 의 정량에 사용할 수 있다.
본 발명의 RLP-C 정량용 시약 및 키트에 있어서의 각 성분은, 상기 기술한 RLP-C 정량 방법으로 기재의 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 산화형 조효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 계면활성제 (d1), 계면활성제 (d2), 계면활성제 (d3), 계면활성제 (d4), 과산화수소 정량용 시약 및 환원형 조효소 정량용 시약을 이용할 수 있다.
본 발명의 RLP-C 정량용 시약 및 키트에는, 필요에 따라, 상기 기술한 수성 매체, 시클로덱스트린 혹은 그 유도체, 알부민, 리포단백질 응집제, 효소 활성화제, 안정화제, 방부제, 간섭물 억제제, 생체 시료 중의 글로블린 등의 단백질을 가용화하기 위한 여러 가지의 염류 등이 함유되어도 괜찮다.
본 발명의 RLP-C 정량용 시약 및 키트에 있어서의 효소, 2종의 계면활성제는, 수성 매체로 용해된 상태로 RLP-C 정량 방법의 항에 기재의 농도가 되는 함량으로 구성된다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 어떠한 한정하는 것은 아니다. 또한, 본 실시예에 있어서는, 하기 메이커의 시약 및 기기를 사용했다.
MOPS (굿의 완충제; Dojindo Laboratories), TOOS [트린더 시약 (산화 커플링형 색원체); Dojindo Laboratories], 4-아미노안티피린 (Nakalai Tesque, Inc.), 황산 나트륨 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Pronon B-208 {POE·POB 공중합체 [계면활성제 (d1); NOF Corporation}, Pronon B-204 {POE·POB 공중합체 [계면활성제 (d1); NOF Corporation}, Wondersurf RL-100 {POE·POP 알킬 에테르[계면활성제 (d2); Aoki Oil Industrial Co., Ltd.}, Wondersurf ID-70 {POE·POP 단쇄 분기 알킬 에테르 [계면활성제 (d2); Aoki Oil Industrial Co., Ltd.}, Wondersurf ID-90 {POE·POP 단쇄 분기 알킬 에테르 [계면활성제 (d2)]; Aoki Oil Industrial Co., Ltd.}, Emulgen L-40 {POE·POP 알킬아릴 에테르 [계면활성제 (d2); Kao Corporation}, Pluronic F-108 (POE·POP 공중합체; Adeka Corporation), 포스포리파제 D (Asahi Kasei Corporation), 콜레스테롤 산화 효소 (CHOD; Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.), 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 (CHER; Toyobo Co., Ltd.), 퍼옥시다제 (POD) (Toyobo Co., Ltd.), 아스코르브산옥시다제 (AOD) (Asahi Kasei Corporation).
도 1 은 RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II (JIMRO Co., Ltd.) 를 이용한 정량법과 실시예 4 의 정량법과의 상관도를 나타낸다.
도 2 는 RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II (JIMRO Co., Ltd.) 를 이용한 정량법과 실시예 5 의 정량법과의 상관도를 나타낸다.
도 3 은 RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II (JIMRO Co., Ltd.) 를 이용한 정량법과 실시예 6 의 정량법과의 상관도를 나타낸다.
도 4 는 RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II (JIMRO Co., Ltd.) 를 이용한 정량법과 비교예 2 의 정량법과의 상관도를 나타낸다.
도 5 는 RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II (JIMRO Co., Ltd.) 를 이용한 정량법과 실시예 11 의 정량법과의 상관도를 나타낸다.
도 6 은 RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II (JIMRO Co., Ltd.) 를 이용한 정량법과 실시예 12 의 정량법과의 상관도를 나타낸다.
도 7 은 RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II (JIMRO Co., Ltd.) 를 이용한 정량법과 실시예 13 의 정량법과의 상관도를 나타낸다.
도 8 은 RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II (JIMRO Co., Ltd.) 를 이용한 정량법과 실시예 14 의 정량법과의 상관도를 나타낸다.
실시예 1
RLP-C 정량용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 RLP-C 정량용 키트를 제작했다.
제 1 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/L
TOOS 0.3 g/L
황산 나트륨 2 g/L
Pronon B-208 8 g/L
Wondersurf RL-100 1 g/L
퍼옥시다제 (POD) 10 U/mL
아스코르브산옥시다제 (AOD) 2 U/mL
제 2 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/L
4-아미노안티피린 0.5 g/L
Wondersurf RL-100 1 g/L
퍼옥시다제 10 U/mL
콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 (CHER) 1 U/mL
콜레스테롤 산화 효소 (CHOD) 3 U/mL
포스포리파제 D 5 U/mL
실시예 2
RLP-C 정량용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 RLP-C 정량용 키트를 제작했다.
제 1 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/L
TOOS 0.3 g/L
황산 나트륨 2 g/L
Pronon B-204 8 g/L
Wondersurf ID-70 1 g/L
퍼옥시다제(POD) 10 U/mL
아스코르브산옥시다제 (AOD) 2 U/mL
제 2 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/L
4-아미노안티피린 0.5 g/L
Wondersurf ID-70 1 g/L
퍼옥시다제 10 U/mL
콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 (CHER) 1 U/mL
콜레스테롤 산화 효소 (CHOD) 3 U/mL
포스포리파제 D 5 U/mL
실시예 3
RLP-C 정량용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 RLP-C 정량용 키트를 제작했다.
제 1 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/L
TOOS 0.3 g/L
황산 나트륨 2 g/L
Pronon B-208 8 g/L
Emulgen L-40 2 g/L
퍼옥시다제 (POD) 10 U/mL
아스코르브산옥시다제 (AOD) 2 U/mL
제 2 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/L
4-아미노안티피린 0.5 g/L
Emulgen L-40 3 g/L
퍼옥시다제 10 U/mL
콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 (CHER) 1 U/mL
콜레스테롤 산화 효소(CHOD) 3 U/mL
포스포리파제 D 5 U/mL
비교예 1
RLP-C 정량용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 RLP-C 정량용 키트를 제작했다. 당 처방은, 일본 공개특허공보 2001-231597 호의 실시예 1 에 기재된 처방이다.
제 1 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/L
TOOS 0.3 g/L
황산 나트륨 2 g/L
Pluronic F-108 1 g/L
퍼옥시다제 (POD) 10 U/mL
아스코르브산옥시다제 (AOD) 2 U/mL
제 2 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/L
4-아미노안티피린 0.5 g/L
Emulgen L-40 2 g/L
퍼옥시다제 10 U/mL
콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소(CHER) 1 U/mL
콜레스테롤 산화 효소 (CHOD) 2 U/mL
포스포리파제 D 5 U/mL
실시예 4
RLP-C 의 정량
실시예 1 의 키트를 이용해, 인간 신선 혈청 64 검체에 대해, 각 검체 중의 RLP-C 를 Hitachi-7170형 자동 분석기에 의해, 이하의 방법에 의해 정량했다.
(1) 검량선의 작성
RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II (JIMRO Co., Ltd.)를 이용한 측정보다, RLP-C 농도가 32.4 mg/dL 인 것이 판명하고 있는 혈청 표준액을 표준품으로 이용해, 당해 혈청 표준액을 적절하게 희석해 조제한 희석 혈청을 검량선 작성용 샘플로 했다.
측정용 키트로서 실시예 1 의 키트를 이용해, 이하의 순서에 따라, Hitachi-7170형 자동 분석기에서, 각 희석 혈청 중의 RLP-C 농도를 측정해, 검량선을 작성했다.
반응 셀에 희석 혈청 (3.8μL) 과 제 1 시약 (0.18 mL) 을 첨가하여 37 ℃ 로 5분간 가온해, 반응액의 흡광도 (E1) 를 주파장 600 nm, 부파장 700 nm 로 측정해 (측광 포인트 : 16), 그 다음에, 이 반응액에, 37 ℃ 에 미리 가온된 제 2 시약 (0.06 mL) 을 첨가해 추가로 37 ℃ 로 5분간 가온해, 반응액의 흡광도 (E2) 를 주파장 600 nm, 부파장 700 nm 로 측정했다 (측광 포인트 : 32). 반응에 있어서의 흡광도 변화 (E2 - E1) 와 희석 혈청 중의 RLP-C 농도와의 관계로부터 검량선을 작성했다.
(2) 인간 신선 혈청 64 검체 중의 RLP-C 의 정량
혈청 표준액 대신에 인간 신선 혈청 64 검체를 이용해, (1) 과 동일한 방법에 의해, 그 64 검체 각각에 대해 반응을 실시해, 반응 후의 반응액의 흡광도와 (1) 로 작성한 검량선으로부터, 각 검체 중의 RLP-C 농도를 정량했다.
실시예 5
RLP-C 의 정량
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 2 의 키트를 이용하는 이외에는 실시예 4 의 정량법과 마찬가지로 해, Hitachi-7170형 자동 분석 장치에 의해, 실시예 4 의 정량에 있어서 사용한 인간 신선 혈청 64 검체의 각 검체 중의 RLP-C 농도를 정량했다.
실시예 6
RLP-C 의 정량
실시예 1 의 키트 대신에 실시예 3 의 키트를 이용하는 이외에는 실시예 4 의 정량법과 마찬가지로 해, Hitachi-7170형 자동 분석 장치에 의해, 실시예 4 의 정량에 있어서 사용한 인간 신선 혈청 64 검체의 각 검체 중의 RLP-C 농도를 정량했다.
비교예 2
RLP-C 의 정량
실시예 1 의 키트 대신에 비교예 1 의 키트를 이용하는 이외에는 실시예 4 의 정량법과 마찬가지로 해, Hitachi-7170형 자동 분석 장치에 의해, 실시예 4 의 정량에 있어서 사용한 인간 신선 혈청 64 검체의 각 검체 중의 RLP-C 농도를 정량했다.
시험예 1
RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II (JIMRO Co., Ltd.) 를 이용한 측정과의 상관
상기 기술한 인간 신선 혈청 64 검체에 대해, RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II (JIMRO Co., Ltd.) 를 이용해, 각 검체 중의 RLP-C 농도를 정량했다.
각 검체에 대해, 실시예 4 내지 6 및 비교예 2 의 정량법 RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II 를 이용한 정량법과의 상관성을 상관계수로 평가했다. 그 결과를 표 11 에 나타낸다. 또, 상관도를 도 1 내지 도 4 에 나타낸다.
정량법 RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II 를 이용한 정량법과의 상관에 있어서의 상관계수
실시예 4 0.9513
실시예 5 0.9447
실시예 6 0.9319
비교예 2 0.9253
표 11 에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 방법은, 비교예 2 (일본 공개특허공보 2001-231597 호의 실시예 1 에 기재된 키트를 이용한 정량) 와 비교해, 모두 RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II 를 이용한 정량법과의 상관이 양호한 처방인 것이 판명되었다.
시험예 2
III형 고지혈증 검체 중의 RLP-C 의 정량
III형 고지혈증 환자의 혈청 검체 중의 RLP-C 농도를, RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II (JIMRO Co., Ltd.), 실시예 1 내지 3 및 비교예 1 의 키트를 이용해 결정했다. 또한, RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II (JIMRO Co., Ltd.) 를 이용한 측정보다, RLP-C 농도가 32.4 mg/dL 인 것이 판명하고 있는 혈청 표준액을 표준품으로 이용해, 당해 혈청 표준액을 적절하게 희석해 조제한 희석 혈청을 검량선 작성용 샘플로 했다. 그 결과를 표 12 에 나타낸다.
키트 III형 고지혈증 검체 중의 RLP-C 농도(mg/dL)
실시예 1 28.6
실시예 2 31.4
실시예 3 26.5
비교예 1 20.0
JIMRO 18.8
III형 고지혈증 환자의 혈청에는, 특히 VLDL 렘난트가 많이 존재하는 것이 알려져 있다. 따라서, 표 12 의 결과로부터, 본 발명의 정량법에 있어서는, 비교예 1 의 키트(일본 공개특허공보 2001-231597 호의 실시예 1 에 기재된 키트) 와 비교해, VLDL 렘난트 중의 콜레스테롤의 반응성이 향상하고 있는 것을 알 수 있다. 또 RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II 를 이용한 정량법과 비교해도, 본 발명의 정량법에 있어서는 RLP-C 에 대한 반응성이 높은 것을 안다.
실시예 7
RLP-C 정량용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 RLP-C 정량용 키트를 제작했다.
제 1 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/L
TOOS 0.3 g/L
황산 나트륨 2 g/L
Pronon B-208 8 g/L
Emulgen L-40 1 g/L
Wondersurf ID-70 1 g/L
퍼옥시다제 (POD) 10 U/mL
아스코르브산옥시다제 (AOD) 2 U/mL
제 2 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/L
4-아미노안티피린 0.5 g/L
Wondersurf ID-70 1 g/L
퍼옥시다제 10 U/mL
콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 (CHER) 1 U/mL
콜레스테롤 산화 효소 (CHOD) 3 U/mL
포스포리파제 D 5 U/mL
실시예 8
RLP-C 정량용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 RLP-C 정량용 키트를 제작했다.
제 1 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/L
TOOS 0.3 g/L
황산 나트륨 2 g/L
Pronon B-208 8 g/L
Emulgen L-40 1 g/L
Wondersurf ID-70 1 g/L
퍼옥시다제 (POD) 10 U/mL
아스코르브산옥시다제 (AOD) 2 U/mL
제 2 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/L
4-아미노안티피린 0.5 g/L
Wondersurf ID-70 1 g/L
Emulgen L-40 1g/L
퍼옥시다제 10 U/mL
콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 (CHER) 1 U/mL
콜레스테롤 산화 효소 (CHOD) 3 U/mL
포스포리파제 D 5 U/mL
실시예 9
RLP-C 정량용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 RLP-C 정량용 키트를 제작했다.
제 1 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/L
TOOS 0.3 g/L
황산 나트륨 2 g/L
Pronon B-208 8 g/L
Emulgen L-40 1 g/L
Wondersurf ID-90 1 g/L
퍼옥시다제 (POD) 10 U/mL
아스코르브산옥시다제 (AOD) 2 U/mL
제 2 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/L
4-아미노안티피린 0.5 g/L
Wondersurf ID-90 1 g/L
퍼옥시다제 10 U/mL
콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 (CHER) 1 U/mL
콜레스테롤 산화 효소 (CHOD) 3 U/mL
포스포리파제 D 5 U/mL
실시예 10
RLP-C 정량용 키트
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 RLP-C 정량용 키트를 제작했다.
제 1 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/L
TOOS 0.3 g/L
황산 나트륨 2 g/L
Pronon B-208 8 g/L
Emulgen L-40 1 g/L
Wondersurf ID-90 1 g/L
퍼옥시다제(POD) 10 U/mL
아스코르브산옥시다아제 (AOD) 2 U/mL
제 2 시약
MOPS (pH 6.8) 20 mmol/L
4-아미노안티피린 0.5 g/L
Wondersurf ID-90 1 g/L
Emulgen L-40 1 g/L
퍼옥시다제 10 U/mL
콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 (CHER) 1 U/mL
콜레스테롤 산화 효소(CHOD) 3 U/mL
포스포리파제 D 5 U/mL
실시예 11
RLP-C 의 정량
정량용 키트로서 실시예 1 의 키트 대신에 실시예 7 의 키트를, 검체로서 실시예 5 내지 8 로 사용한 인간 신선 혈청 64 검체 대신에 인간 신선 혈청 35 검체를 이용하는 이외에는 실시예 4 의 정량법과 동일한 방법에 의해, Hitachi-7170형 자동 분석 장치에 의해, 당해 35 검체의 각 검체 중의 RLP-C 농도를 정량했다.
실시예 12
RLP-C 의 정량
실시예 7 의 키트 대신에 실시예 8의 키트를 이용하는 이외에는 실시예 11 의 정량법과 동일한 방법에 의해, Hitachi-7170형 자동 분석 장치에 의해, 인간 신선 혈청 35 검체의 각 검체 중의 RLP-C 농도를 정량했다.
실시예 13
RLP-C 의 정량
실시예 7 의 키트 대신에 실시예 9 의 키트를 이용하는 이외에는 실시예 11 의 정량법과 동일한 방법에 의해, Hitachi-7170형 자동 분석 장치에 의해, 인간 신선 혈청 35 검체의 각 검체 중의 RLP-C 농도를 정량했다.
실시예 14
RLP-C 의 정량
실시예 7 의 키트 대신에 실시예 10 의 키트를 이용하는 이외에는 실시예 11 의 정량법과 동일한 방법에 의해, Hitachi-7170형 자동 분석 장치에 의해, 인간 신선 혈청 35 검체의 각 검체 중의 RLP-C 농도를 정량했다.
시험예 3
RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II (JIMRO Co., Ltd.) 를 이용한 측정과의 상관
실시예 11 내지 14 로 사용한 인간 신선 혈청 35 검체에 대해서, RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II (JIMRO Co., Ltd.) 를 이용해, 각 검체 중의 RLP-C 농도를 정량했다.
각 검체에 대해, 실시예 11 내지 14 의 정량법과 RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II 를 이용한 정량법과의 상관성을 상관계수로 평가했다. 그 결과를 표 13 에 나타낸다. 또, 상관도를 도 5 내지 도 8 에 나타낸다.
정량법 RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II 를 이용한 정량법과의 상관에 있어서의 상관계수
실시예 11 0.9764
실시예 12 0.9826
실시예 13 0.9756
실시예 14 0.9745
표 13 에 나타내는 바와 같이, 계면활성제 (d2) 로서 2 종류의 계면활성제를 사용한 키트에 있어서도, RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II 를 이용한 정량법과의 사이에 양호한 상관관계가 인정되었다. 또, 표 11 에 나타낸 실시예 4 내지 6 과의 비교로부터, 계면활성제 (d2) 를 1종류 사용한 키트보다, 2종류 사용한 키트를 이용한 정량이, RLP-콜레스테롤 "JIMRO" II 를 이용한 정량법과의 사이에 의해 좋은 상관이 인정되었다.
본 발명에 의해, 동맥 경화성 질환의 진단에 유용한 RLP-C 의 정량 방법, 시약 및 키트가 제공된다.

Claims (20)

  1. 시료를 함유하는 수성 매체중, (a) (i) 폴리옥시에틸렌 폴리옥시부틸렌 공중합체, 폴리옥시에틸렌 스티렌화-페닐 에테르 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 장쇄 분기 알킬 에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 계면활성제 [이하, 계면활성제 (d1) 로 언급] 와 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 알킬아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 알킬 에테르 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 단쇄 분기 알킬 에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 계면활성제 [이하, 계면활성제 (d2) 로 언급] 와의 조합, 또는, (ii) 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체 [이하, 계면활성제 (d3) 으로 언급] 와 폴리옥시에틸렌 알킬아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 알킬 에테르 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 단쇄 분기 알킬 에테르로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 또는 2종의 계면활성제 [이하, 계면활성제 (d4) 로 언급] 와의 조합, 그리고 (b) 인지질을 가수분해하는 효소의 존재하, 시료 중의 렘난트형 입자 콜레스테롤에, (c) 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소 또는 (d) 산화형 조효소의 존재하에 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 작용시켜, 과산화수소 또는 환원형 조효소를 생성시키고, 생성한 과산화수소 또는 환원형 조효소를 정량하는 것을 포함하는, 시료 중의 렘난트형 (remnant-type) 입자 콜레스테롤의 정량 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 과산화수소의 정량이 퍼옥시다제의 존재하, 생성한 과산화수소를 산화 발색형 색원체와 반응시켜, 생성한 색소를 정량함으로써 행해지는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 환원형 조효소의 정량이 반응액의 흡광도를 측정함으로써 행해지는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 환원형 조효소의 정량이 생성한 환원형 조효소를 환원 발색형 색원체와 반응시켜, 생성한 색소를 정량함으로써 행해지는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 공중합체가 일반식 (I)
    RO-(C2H4O)A-(C4H8O)B-(C2H4O)C-H (I)
    (식 중, A, B 및 C 는 동일 또는 상이하게 1 내지 200 의 정수를 나타내고, R 은, 수소원자, 또는 직쇄 또는 분기의 알킬을 나타낸다) 로 표시되는 계면활성제인 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 인지질을 가수분해하는 효소가 포스포리파제 D, 포스포리파제 C 또는 포스포리파제 A2 인 방법.
  7. 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 산화 효소, 및 계면활성제 (d1) 과 계면활성제 (d2) 와의 조합, 또는, 계면활성제 (d3) 과 계면활성제 (d4) 와의 조합을 함유하는, 시료 중의 렘난트형 입자 콜레스테롤 정량용 시약.
  8. 제 7 항에 있어서, 추가로 과산화수소 정량용 시약을 함유하는 시약.
  9. 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소, 콜레스테롤 탈수소 효소, 산화형 조효소, 및 계면활성제 (d1) 과 계면활성제 (d2) 와의 조합 또는 계면활성제 (d3) 과 계면활성제 (d4) 와의 조합을 함유하는, 시료중의 렘난트형 입자 콜레스테롤 정량용 시약.
  10. 제 9 항에 있어서, 추가로 환원형 조효소 정량용 시약을 함유하는 시약.
  11. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 공중합체가 일반식 (I)
    RO-(C2H4O)A-(C4H8O)B-(C2H4O)C-H (I)
    (식 중, A, B 및 C 는 동일 또는 상이하게 1 내지 200 의 정수를 나타내고, R 은, 수소원자, 또는 직쇄 또는 분기의 알킬을 나타낸다) 로 표시되는 계면활성제인 시약.
  12. 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 인지질을 가수분해하는 효소가 포스포리파제 D, 포스포리파제 C 또는 포스포리파제 A2 인 시약.
  13. 계면활성제 (d1) 을 함유하는 제 1 시약과, 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하고, 또한, 계면활성제 (d2) 를 제 1 시약 및 제 2 시약의 적어도 한쪽에 함유하는, 시료 중의 렘난트형 입자 콜레스테롤 정량용 키트.
  14. 계면활성제 (d3) 를 함유하는 제 1 시약과, 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 산화 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하고, 또한, 계면활성제 (d4) 를 제 1 시약 및 제 2 시약의 적어도 한쪽에 함유하는, 시료 중의 렘난트형 입자 콜레스테롤 정량용 키트.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 추가로 과산화수소 정량용 시약을 제 1 시약 및 제 2 시약의 적어도 한쪽에 함유하는 키트.
  16. 계면활성제 (d1) 를 함유하는 제 1 시약과, 인지질을 가수분해하는 효소, 콜 레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하고, 계면활성제 (d2) 를 제 1 시약 및 제 2 시약의 적어도 한쪽에 함유 하고, 또한, 산화형 조효소를 제 1 시약 및 제 2 시약의 적어도 한쪽에 함유하는, 시료 중의 렘난트형 입자 콜레스테롤 정량용 키트.
  17. 계면활성제 (d3) 를 함유하는 제 1 시약과, 인지질을 가수분해하는 효소, 콜레스테롤 에스테르 가수분해 효소 및 콜레스테롤 탈수소 효소를 함유하는 제 2 시약을 함유하고, 계면활성제 (d4) 를 제 1 시약 및 제 2 시약의 적어도 한쪽에 함유하고, 또한, 산화형 조효소를 제 1 시약 및 제 2 시약의 적어도 한쪽에 함유하는, 시료 중의 렘난트형 입자 콜레스테롤 정량용 키트.
  18. 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 추가로 환원형 조효소 정량용 시약을 제 1 시약 및 제 2 시약의 적어도 한쪽에 함유하는 키트.
  19. 제 13 항, 제 15 항, 제 16 항 또는 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시부틸렌 공중합체가 일반식 (I)
    RO-(C2H4O)A-(C4H8O)B-(C2H4O)C-H (I)
    (식 중, A, B 및 C 는 동일 또는 상이하게 1 내지 200 의 정수를 나타내고, R 은, 수소원자, 또는 직쇄 또는 분기의 알킬을 나타낸다) 로 표시되는 계면활성제 인 키트.
  20. 제 13 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 인지질을 가수분해하는 효소가 포스포리파제 D, 포스포리파제 C 또는 포스포리파제 A2 인 키트.
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