TWI379904B - A method for quantifying cholesterol of remnant-like particles lipoprotein, reagent and kit - Google Patents

Description

1379904 九、發明說明： . 【發明所屬之技術領域】 - 本發明係關於臨床檢查中作爲動脈硬化症等之危險因子 . 之殘粒樣脂蛋白質（以下，略記爲RL P )中之膽固醇之定 量方法、試藥及套組。 【先前技術】

血液中含有各種脂蛋白，由於此等脂蛋白之比重不同，而 將其分類爲乳糜微粒（以下略記爲CM)、超低密度脂蛋白 • (以下略記爲V L D L )、低密度脂蛋白（以略記爲L D L)、高密度脂蛋白（以下略記爲HDL)。各脂蛋白於膽 固醇、三酸甘油酯、磷脂質、蛋白質等之構成成分的比例上 不同，而於生體内具有不同作用。 於臨床檢查中，H D L中之膽固醇爲動脈硬化症危險因子 之負因子，L D L中之膽固醇爲動脈硬化症危險因子之正因 子，因而於臨床檢查領域中被頻繁地測定。 又，因脂質代謝等生成之脂蛋白質中之膽固醇較作爲動脈 ® 硬化症危險因子之LD L中的膽固醇顯示更爲密接的指 標。由於脂質代謝等生成之脂蛋白質可列舉例如R L Ρ。 最近，已開發依免疫吸著法之RL.P中膽固醇（以下略記 爲RL Ρ — C)之定量法。本定量法中，經由使用含有不會 _ 識別抗apo A - I單株抗體及apoB - 4 8之特異性抗apo . B — 1 0 0單株抗體之親和性膠體之免疫親和性色層分析 法，由血清分離出RLP，而定量含有此經分離之RLP之 膽固醇。適用本定量法之RL P中之膽固醇定量用試藥爲由 1379904 • 用，生成過氧化氫或還原型輔酶，而可定量生成之過氧化氫 . 或還原型輔酶之定量》 ♦ 對於試料中之R L P — C，於氧存在下與膽固醇酯水解酶 及膽固醇氧化酶作用，經由試料中R L P中之醋型膽固醇以 膽固醇酯水解酶作用而變換成遊離型膽固醇，該變換生成之 遊離型膽固醇及R L P中之遊離型膽固醇與酸素，經由膽固 醇氧化酶之作用而生成過氧化氫。 又對於試料中之R L P - C，於氧化型輔酶之存在下，使 Φ 膽固醇酯水解酶及膽固醇脫氫酵素作用，試料中之RLP中 之酯型膽固醇經由膽固醇酯水解酶之作用而變換成遊離型 膽固醇，由該經變換生成之遊離型膽固醇及R L P中之遊離 型膽固醇與氧化型輔酶以膽固醇脫氫酵素作用而生成還原 型輔酶。 此酵素反應’係於界面活性劑（d 1 )及界面活性劑（d 2 )之組合，或’界面活性劑（d 3 )及界面活性劑（d 4 ) 之組合’與水解磷脂質之酵素存在下，含有膽固醇定量上必 ® 要的膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酵素（使 用膽固醇脫氫酵素時氧化型輔酶爲必要的）之緩衝液等水溶 液中進行。 作爲界面活性劑（d 1 )及界面活性劑（d 2 )之組合， 及界面活性劑（d 3 )及界面活性劑（d 4 )之組合中，作 爲界面活性劑（d 1 )、界面活性劑（d 2 )、界面活性劑 (d3)、界面活性劑（d4)，亦可使用一種或二種以上 界面活性劑（d 1 )〜（d 4 )所構成之界面活性劑。 1379904 界面活性劑（d 1 )及界面活性劑（d 2 )之組合，示例 於表1〜表7所示組合。 【表1】 界面活性劑（dl) 界面活性劑（d 2) POE . PO哄聚合物 POE · POP烷基芳基醚 P0E · P0哄聚合物 POE院基芳基醚 POE . P0B共聚合物 P0E · POP院基醚 POE . P0哄聚合物 P0E . ΡΟΡ^鏈分支烷基醚 P0E · POg聚合物 P0E · POP院基芳基醚 P0E烷基芳基醚 P0E · P0B共聚合物 P0E · POP烷基芳基醚 P0E · POP院基醚 POE . P0B共聚合物 P0E · POP烷基芳基醚 P0E . Ρ0Γ短鏈分支烷基醚 Ρ0Ε · P0B共聚合物 P0E院基芳基醚 POE . POP院基醚 P0E · P0B共聚合物 P0E院基芳基醚 P0E · POi^g鏈分支烷基醚 POE . P0B共聚合物 POE . POP院基醚 P0E · 鏈分支烷基醚 P0E · P0B共聚合物 P0E · POP院基芳基醚 P0E院基芳基醚 POE . POP院基醚 POE . P0B共聚合物 P0E · POP烷基芳基醚 P0E烷基芳基醚 P0E · P〇m鏈分支烷基醚 POE . P0B共聚合物 POE . POP院基芳基醚 POE . POP院基醚 POE _ POP短鏈分支烷基醚 P0E · P0B共聚合物 P0E烷基芳基醚 POE . POP院基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 POE . P0B共聚合物 POE . POP院基芳基醚 P0E烷基芳基醚 POE . POP烷基醚 P0E · P〇m鏈分支烷基醚 1379904 【表2】 界面活性劑（d1) 界面活性劑（d 2) POE苯乙烯化苯基醚 POE · POP烷基芳基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 POE院基芳基醚 Ρ0Ε苯乙烯化苯基醚 POE . POP院基醚 P0E苯乙燃化苯基酸 P0E · P〇m鏈分支烷基醚 Ρ0Ε苯乙烯化苯基醚 P0E · POP烷基芳基醚 P0E院基芳基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP烷基芳基醚 POE . POP院基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP院基芳基醚 P0E · POP®鏈分支烷基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E院基芳基醚 POE . POP烷基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E院基芳基醚 P0E · P〇m鏈分支烷基醚 Ρ0Ε苯乙烯化苯基醚 P0E · POP院基醚 P0E · ΡΟΜ鏈分支烷基醚 Ρ0Ε苯乙烯化苯基醚 Ρ0Ε · POP院基芳基醚 P0E垸基芳基醚 POE . POP烷基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP院基芳基醚 P0E院基芳基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP烷基芳基醚 POE . POP烷基醚 P0E · POP®鏈分支烷基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E烷基芳基醚 P0E · POP烷基醚 POE . POP短鏈分支烷基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP烷基芳基醚 P0E烷基芳基醚 POE . POP烷基醚 poe · pom鏈分支烷基醚 1379904

【表3】 界面活性劑（d1) 界面活性劑（d 2) POE_POP長鏈分支烷基醚 POE · POP烷基芳基醚 POE· POP長鏈分支烷基醚 POE院基芳基醚 POE· POP長鏈分支烷基醚 P0E · POP院基醚 POE· POP長鏈分支烷基醚 poe · rom鏈分支烷基醚 Ρ0Ε·Ρ0Ρ長鏈分支烷基醚 P0E · POP垸基芳基醚 P0E燒基芳基醚 Ρ0Ε_Ρ0Ρ長鏈分支烷基醚 P0E · POP院基芳基醚 POE . POP院基醚 Ρ0Ε_Ρ0Ρ長鏈分支烷基醚 P0E · POP垸基芳基醚 POE . P0晚鏈分支烷基醚 POE· POP長鏈分支烷基醚 P0E烷基芳基醚 POE . POP院基醚 Ρ0Ε·Ρ0Ρ長鏈分支烷基醚 P0E院基芳基醚 P0E · P〇m鏈分支烷基醚 POE· POP長鏈分支烷基醚 ίΌΕ . POP烷基醚 POE . POP短鏈分支烷基醚 POE· POP長鏈分支烷基醚 Ρ0Ε · POP院基芳基醚 P0E院基芳基醚 POE . POP烷基醚 Ρ0Ε·Ρ0Ρ長鏈分支烷基醚 P0E · POP烷基芳基醚 P0E烷基芳基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 POE· POP長鏈分支烷基醚 P0E · POP烷基芳基醚 POE . POP烷基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 Ρ0Ε_Ρ0Ρ長鏈分支烷基醚 KB完基芳基醚 POE . POP烷基醚 P0E · POP®鏈分支烷基醚 POE· POP長鏈分支烷基醚 P0E · POP院基芳基醚 P0E烷基芳基醚 POE . POP烷基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 -16- 1379904 【表4】 界面活性劑（d1) 界面活性劑（d 2) POE-PO哄聚合物 POE苯乙烯化苯基醚 POE · POP院基芳基醚 POE.PO哄聚合物 POE苯乙烯化苯基醚 POE院基芳基醚 POE-PO拱聚合物 POE苯乙烯化苯基醚 POE . POP院基醚 POE.POB共聚合物 POE苯乙烯化苯基醚 POE . P0嗯鏈分支烷基醚 POE.PO哄聚合物 P0E苯乙烯化苯基醚 POE . POP烷基芳基醚 P0E院基芳基醚 P ΡΟΕ-ΡΟΒ共聚合物 Ρ0Ε苯乙烯化苯基醚 P0E · POP烷基芳基醚 POE . POP烷基醚 POE.POB共聚合物 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP烷基芳基醚 POE . P0晚鏈分支烷基醚 POE.POB共聚合物 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E院基芳基醚 POE . POP烷基醚 Ρ0Ε-Ρ0Β共聚合物 P0E苯乙烯化苯基醚 Ρ0Ε烷基芳基醚 POE . POP短鏈分支烷基醚 P POE.PO哄聚合物 P0E苯乙烯化苯基醚 POE . POP烷基醚 P0E · P〇m鏈分支烷基醚 Ρ0Ε-Ρ0Β共聚合物 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP烷基芳基醚 P0E烷基芳基醚 POE . POP烷基醚 Ρ0Ε·Ρ0Β共聚合物 Ρ0Ε苯乙烯化苯基醚 P0E · POP烷基芳基醚 Ρ0Ε垸基芳基醚 POE . POP短鏈分支烷基醚 POE.POB共聚合物 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP烷基芳基酸 POE . POP垸基醚 Ρ0Ε · P〇m鏈分支烷基醚 Ρ0Ε-Ρ0Β共聚合物 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E院基芳基醚 POE . POP院基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 Ρ0Ε-Ρ0Β共聚合物 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP院基芳基醚 P0E院基芳基醚 POE . POP烷基醚 POE . POP短鏈分支烷基醚 1379904

【表5】 界面活性劑（d1) 界面活性劑（d 2) POE-PO哄聚合物 POE · POP長鏈分支烷基醚 POE · POP烷基芳基醚 POE.PO缺聚合物 POE . POP長鏈分支烷基醚 POE烷基芳基醚 Ρ0Ε·Ρ0Β^聚合物 Ρ0Ε · POP長鏈分支烷基醚 POE . POP垸基醚 Ρ0Ε.Ρ0Β共聚合物 P0E · POP長鏈分支烷基醚 POE . POP短鏈分支烷基醚 Ρ0Ε-Ρ0哄聚合物 P0E · POP長鏈分支烷基醚 P0E · POP烷基芳基醚 Ρ0Ε烷基芳基醚 Ρ Ρ0Ε.Ρ0哄聚合物 P0E · POP長鏈分支烷基醚 P0E · POP烷基芳基醚 POE . POP烷基醚 Ρ0Ε.Ρ0Β共聚合物 POE . POP長鏈分支烷基醚 P0E · POP烷基芳基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 Ρ0Ε.Ρ0Β共聚合物 P0E · POP長鏈分支烷基醚 P0E院基芳基醚 P0E · POP烷基醚 Ρ0Ε.Ρ0Β共聚合物 POE . POP長鏈分支烷基醚 P0E烷基芳基醚 POE . POP短鏈分支烷基醚 Ρ Ρ0Ε.Ρ0Β共聚合物 P0E · POP長鏈分支烷基醚 P0E · POP烷基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 Ρ0Ε-Ρ0Β共聚合物 P0E · POP長鏈分支烷基醚 P0E · POP院基芳基醚 P0E院基芳基醚 POE . POP烷基醚 Ρ0Ε.Ρ0Β共聚合物 POE . POP長鏈分支烷基醚 POE . POP院基芳基醚 P0E院基芳基醚 P0E · Ρ0ΡΜ鏈分支烷基醚 Ρ0Ε.Ρ0Β共聚合物 P0E · POP長鏈分支烷基醚 P0E · POP烷基芳基醚 P0E · POP烷基醚 POE . P0嗯鏈分支烷基醚 Ρ Ρ0Ε-Ρ0Β共聚合物 P0E · POP長鏈分支烷基醚 P0E院基芳基醚 POE . POP院基醚 POE . POP短鏈分支烷基醚 Ρ0Ε.Ρ0Β共聚合物 P0E · POP長鏈分支烷基醚 POE . POP院基芳基醚 P0E垸基芳基醚 POE . POP烷基醚 POE . POP短鏈分支烷基醚 1379904 【表6】 界面活性劑（d1) 界面活性劑（d 2) POE苯乙烯化苯基醚 POE . POP長鏈分支烷基醚 POE · POP烷基芳基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 Ρ0Ε · POP長鏈分支烷基醚 POE垸基芳基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP長鏈分支烷基醚 Ρ0Ε · POP院基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP長鏈分支烷基醚 POE . P0應鏈分支烷基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP長鏈分支烷基醚 Ρ0Ε · POP院基芳基醚 Ρ0Ε垸基芳基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP長鏈分支烷基醚 POE . POP院基芳基醚 POE . POP烷基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP長鏈分支烷基醚 Ρ0Ε · POP院基芳基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP長鏈分支烷基醚 P0E垸基芳基醚 P0E · POP烷基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP長鏈分支烷基醚 Ρ0Ε院基芳基醚 Ρ0Ε · POHg鏈分支烷基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP長鏈分支烷基醚 POE . POP烷基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP長鏈分支烷基醚 P0E · POP烷基芳基醚 Ρ0Ε烷基芳基醚 POE . POP烷基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP長鏈分支烷基醚 P0E · POP烷基芳基醚 P0E烷基芳基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP長鏈分支烷基醚 P0E · POP烷基芳基醚 P0E · POP院基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP長鏈分支烷基醚 Ρ0Ε烷基芳基醚 P0E · POP烷基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP長鏈分支烷基醚 P0E · POP烷基芳基醚 P0E烷基芳基醚 POE . POP烷基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 1379904 【表7】 界面活性劑（d1) 界面活性劑（d 2) POE · P0哄聚合物 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP長鏈分支烷基醚 POE . POP烷基芳基醚 POE . P0哄聚合物 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP長鏈分支烷基醚 POE院基芳基醚 POE . P0B共聚合物 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP長鏈分支烷基醚 Ρ0Ε · POP院基醚 P0E · P0哄聚合物 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP長鏈分支烷基醚 ΡΟΕ · Ρ0@鏈分支烷基醚 ΡΟΕ · P0B共聚合物 P0E苯乙嫌化苯基醚 P0E · POP長鏈分支烷基醚 POE . POP院基芳基醚 P0E烷基芳基醚 ΡΟΕ · Ρ0Β共聚合物 Ρ0Ε苯乙烯化苯基醚 P0E · POP長鏈分支烷基醚 P0E · POP院基芳基醚 POE . POP烷基醚 ΡΟΕ · P0B共聚合物 P0E苯乙烯化苯基醚 Ρ0Ε · POP長鏈分支烷基醚 P0E · POP烷基芳基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 ΡΟΕ · P0哄聚合物 P0E苯乙烯化苯基醚 P0E · POP長鏈分支烷基醚 Ρ0Ε烷基芳基醚 P0E · POP烷基醚 ΡΟΕ · P0B共聚合物 P0E苯乙烯化苯基醚 Ρ0Ε · POP長鏈分支烷基醚 P0E烷基芳基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 POE . P0B共聚合物 Ρ0Ε苯乙烯化苯基醚 Ρ0Ε · POP長鏈分支烷基醚 POE . POP烷基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 POE . Ρ0Β共聚合物 Ρ0Ε苯乙烯化苯基醚 P0E · POP長鍵分支烷基醚 P0E · POP烷基芳基醚 P0E烷基芳基醚 POE . POP烷基醚 POE . Ρ0Β共聚合物 Ρ0Ε苯乙烯化苯基醚 Ρ0Ε · POP長鏈分支烷基醚 P0E · POP烷基芳基醚 P0E院基芳基醚 POE . POP短鏈分支烷基醚 ΡΟΕ · Ρ0Β共聚合物 Ρ0Ε苯乙烯化苯基醚 Ρ0Ε · POP長鏈分支烷基醚 P0E · POP烷基芳基醚 POE . POP院基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 POE . Ρ0Β共聚合物 Ρ0Ε苯乙烯化苯基醚 Ρ0Ε · POP長鏈分支烷基醚 P0E烷基芳基醚 P0E · POP烷基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 -20- 1379904 POE . PO哄聚合物 POE苯乙烯化苯基醚 POE · POP長鏈分支烷基醚 P0E · POP烷基芳基醚 Ρ0Ε院基芳基醚 P〇£ . POP烷基醚 POE · P〇m鏈分支烷基醚 . 界面活性劑（d 1 )及界面活性劑（d 2 )之組合中，於 水解磷脂質之酵素存在下，膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶 或膽固醇脫氫酵素對於殘粒樣脂蛋白膽固醇會產生特異性 作用之強組合爲較佳。 具體而言，表1中記載之POE · POB共聚合物與界面 ®活性劑（d 2 ) 2組合爲較佳。 Ρ Ο Ε ·Ρ OB共聚合物與界面活性劑（d 2 )之組合中， 例如以表8所示之以下組合爲更佳。 【表8】 界面活性劑（d1) 界面活性劑（d 2) POE. POB共聚合物 POE . POP烷基芳基醚 POE· POB共聚合物 POE . POP烷基醚 POE· POB共聚合物 POE · POP短鏈分支烷基醚 POE· POB共聚合物 POE · POP垸基芳基醚 POE · POP烷基醚 POE· POB共聚合物 POE.· POP烷基芳基醚 POE · POP短鏈分支烷基醚 POE _ FOB共聚合物 POE · POP烷基醚 POE · P〇m鏈分支烷基醚 POE· POB共聚合物 POE · POP烷基芳基醚 POE . POP院基醚 POE . POP短鏈分支烷基醚 作爲界面活性劑（d 3 )及界面活性劑（d 4 )之組合， 以下列表9所示之組合爲示例。 -21- '仏 1379904 【表9】 界面活性劑（d 3) 界面活性劑（d 4) POE-POP共聚合物 POE POP院基芳基醚 POE· POP共聚合物 POE . POP院基醚 POE· POP共聚合物 POE · POP^鏈分支烷基醚 POE _ POP共聚合物 POE垸基芳基醚 POE . POP烷基醚 POE· POP共聚合物 POE院基芳基醚 POE · POP^鏈分支烷基醚 POE· POP共聚合物 POE . POP烷基醚 POE · POM鏈分支烷基醚 POE. POP共聚合物 POE院基芳基醚 POE . POP院基醚 POE · POP短鏈分支烷基醚 界面活性劑（d 3 )及界面活性劑（d 4 )之組合中，於 水解磷脂質之酵素存在下，膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶 或膽固醇脫氬酵素對於RLP - C會特異性作用之強組合爲較 佳。 具體而言，表1 0所示以下之組合爲較佳。 【表1 0】 界面活性劑（d 3) 界面活性劑（d 4) POE-POP共聚合物 POE · POP烷基醚 POE· POP共聚合物 POE · POP短鏈分支烷基醚 POE· POP共聚合物 POE烷基芳基醚 POE . POP烷基醚 POE· POP共聚合物 P0E烷基芳基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 POE· POP共聚合物 POE . POP烷基醚 P0E · POP短鏈分支烷基醚 反應所生成之過氧化氫或還原型輔酶之定量係依一般公 認之方法進行。 -22- 1379904 - 酵素反應之反應液中，按照其必要性，可 . 生物、白蛋白或脂蛋白凝集劑之存在下進行 • 生物、白蛋白或脂蛋白凝集劑中可抑制對殘 w 之脂蛋白膽固醇之酵素作用者爲佳。 又，酵素反應之反應液中，按照其必要性 c定量反應之特異性上不影響之範圍內，爲 水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酵素經 酵素活性化劑、安定化劑、防腐劑、干渉物 ® 料中之球蛋白等之蛋白質之種種鹽類共同存 膽固醇酯水解反應、遊離膽固醇之氧化或 水解磷脂質之酵素及界面活性劑（d1)與 2 )之組合或界面活性劑（d 3 )與界面活 組合存在下依次進行。又，預先將試料與界 液中接觸，接著添加與此溶液中水解磷脂質 反應有關之酵素，可進行膽固醇之反應。膽 含有全部R L P _ C定量上必要的成分之冰 亦可將R L P - C定量上必要的成分分成2 分群的成分添加至反應液中。RL P _ C之 述之R L P — C定量用套組進行。 水性媒劑中，膽固醇酯水解酶、膽固醇氧 氫酵素之濃度通常使用0.0 0 1〜4 0 0 爲0·01〜200U/mL，更佳爲〇.〇 m L 。 於環糊精或其衍 。環糊精或其衍 粒樣脂蛋白以外 ，在對R L P — 了活化膽固醇酯 丨常使用可溶化 抑制劑、生體試 :在。 脫氫反應，可於 界面活性劑（d 性劑（d 4 )之 面活性劑於水溶 之酵素、膽固醇 固醇之反應可於 :溶液中進行，但 〜3群，依次將 定量較佳使用下 化酶及膽固醇脫 U / m L，較佳 5 〜1 0 0 U / -23- 1379904 - 水性媒劑中，水解磷脂質之酵素濃度並未特別制限，但以 0.00 1 〜400U/mL 爲較佳，0.0 1 〜200U/ * mL爲更佳，〇.〇5〜100U/mL爲特佳。 水性媒劑中，界面活性劑（d 1 )、界面活性劑（d 2 )、

W 界面活性劑（d 3)、界面活性劑（d4)之濃度各自以0· 00 1 〜5 (w/v)% 爲較佳，0.005 〜2.5 (w/ v ) %爲更佳，〇.〇 5〜1 (w/ v) %爲特佳。 酵素反應通常於1 0〜5 0°C，較佳爲2 0〜4 CTC之溫 # 度下進行，通常於2〜30分鐘內完成。 生成之過氧化氬可例如於過氧化酶存在下將過氧化氫與 氧化而使色素變換之色原體反應所生成之色素，由測定之反 應液之吸光度之變化例如測定生成色素之吸收極大波長而 定量。又生成之過氧化氫可例如使化學發光物質，例如將魯 米諾（luminol)、異魯米諾、亮光素（lucigenin)、吖D定 鑰酯等與過氧化氫反應而生成光子，依據定量生成之光子而 定量。 ® 還原型輔酶可例如依酵素反應生成之還原型輔酶含有液 之吸光度於300〜500nm，較佳於330〜400η m，更佳爲34 〇nm附近下測定而定量。又，生成之還原 型輔酶可例如於心肌黃酶（di a pho rase )或電子載體存在下 將還原型輔酶還原而使色素變換之色原體之反應而生成色 素，測定反應液之吸光度變化例如生成色素之吸收極大波長 而定量。電子載體之例爲1 一甲氧基一5 -甲基啡阱鑰甲基 硫酸鹽。 -24- 1379904 試料中之RL P _ C之濃度可例如使用預先含有已知濃 度之R L P - C之試料，作成膽固醇濃度與過氧化氫或還原 • 型輔酶之量之關係所示校正曲線，由此校正曲線求出其濃 度。 <4 膽固醇酯水解酶爲可水解膽固醇酯之酵素，例如使用膽固 醇酯酶、脂蛋白脂肪酶等，可使用由動物、植物或微生物由 來，或依遺傳工程之手法所製造之酵素，化學性修飾之酵素 等。化學性修飾之酵素，例如含有以聚乙二醇或聚丙二醇爲 • 主成分之基、具有聚丙二醇與聚乙二醇共聚合物之基、含有 水溶性多糖類之基、具有磺丙基、磺丁基、聚胺甲酸酯基、 螯合物機能之基等化學修飾基修飾之酵素。特別以聚乙二醇 爲主成分之基修飾之酵素爲佳。水溶性多糖類，例如爲含右 旋糖、普魯蘭多醣、可溶性澱粉等。 化學性修飾用之試藥（化學修飾劑）爲含有合倂上述化學 修飾基與酵素之肢基、羧基 '毓基等反應所得官能基或構造 之化合物等。酵素中之胺基與反應所得之官能基或構造，例 ® 如含有羧基、活性酯基（N -羥基琥珀醯亞胺基等）、酸酐、 酸氯化物 '醛、環氧基、1,3 —丙烷磺內酯、1，4 — 丁烷 磺內酯等。與酵素中之羧基反應所得官能基或構造，例如含 有胺基，與酵素中之毓基有反應性之基或構造例如爲含有順 丁烯二醯亞胺基 '二硫化物、α -鹵酯（α —碘酯等）等。

化學修飾劑之例爲含有具聚乙二醇作爲主成分之基與Ν -羥基琥珀醯亞胺基之SUNBRIGHT V F Μ - 4 1 Ol'SUNBRIGHT MEAC-50HS ' SUN -25- 1379904 - BRIGHTMEC — 50HS (皆爲日本油脂社製）、

, 具有聚伸烷基二醇爲主成分之基與酸酐構造之S U N B R - IGHT AKM 系（例如爲 SUNBRIGHT A K Μ

-1510 等）、SUNBRIGHT ADM 系、SUN BRIGHT ACM系（皆爲日本油脂社製）、具有以乙

二醇爲主成分之基與環氧基之E POX — 3 4 0 Ο、M— E POX— 5000 (皆爲 Sheawa t e r Po lym e r s社製）、具有螯合物機能之基與酸酐構造之二伸乙基

_ 三胺—N，N，N’ ，N’ ’ ，N’ ’ 一五無水乙酸（DTPA

酐；同仁化學硏究所社製）、聚胺甲酸酯修飾用之活性化聚 I 胺甲酸醋丨P40(J0(Boehr i nge r M a η n h e im社製）、右旋糖修飾用之右旋糖Τ4 0、活性化TC T (Boehr inger Mannhe im 社製）等。 酵素之化學修飾可以以下列舉之方法進行。 首先，將膽固醇酯水解酶溶解於p Η 8 ·0以上之緩衝 液’例如HEPES緩衝液，於〇〜55。(：添加0.01〜 ® 5 0 0倍莫耳量之化學修飾劑，攪拌5分鐘〜5小時。實際 的酵素反應中，可使用作爲經化學性修飾的膽固醇酯水解 酶，不僅於此反應液，依據必要性之外，亦除去濾過膜等之 未反應的化學修飾劑等》 膽固醇氧化酶可使用由動物'植物或微生物由來之酵素、 遺傳子工程的手法所製造之酵素、化學性修飾的酵素等。 化學修飾酵素可爲依據前述化學修飾方法製作者。 -26- 1379904 - 膽固醇脫氫酵素，若爲可於氧化型輔酶存在下氧化膽固醇 . 而具有生成還原型輔酶能力的酵素，可使用動物'植物或微 - 生物由來之酵素、依遺傳子工程手法製造之酵素、化學性修 , 飾之酵素。化學性修飾之酵素例如可使用前述化學修飾劑， 依前述化學修飾方法製作。 水解磷脂質之酵素只要爲具有磷脂質分解能力之酵素而 並未特別限制，例如爲動物、植物及微生物由來之磷脂質分 解酵素。具體地分解磷脂質之酵素例如爲磷脂酶D、磷脂酶 ® C、磷脂酶A2、溶血磷脂酶等。 於本發明使用之膽固醇脫氫酵素定量法中使用之氧化型 輔酶之例爲 NAD、NADP、thio— NAD、thio—NA DP。 本發明中使用之界面活性劑（d 1 )與本發明使用之界面 活性劑（d 2 )之組合，於水解磷脂質之酵素存在下，具有 對R L P - C特異性作用機能之膽固醇酯水解酶及膽固醇 氧化酶或膽固醇脫氫酵素。各自單獨使用界面活性劑（d 1 ) ® 及界面活性劑（d 2 )時，膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶 或膽固醇脫氫酵素對於R L P - C特異性作用之機能爲高 者未必是必要的。 本發明所使用之界面活性劑（d 3 )與本發明使用之界面 活性劑（d 4 )之組合，於水解磷脂質之酵素存在下，膽固 醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酵素具有對R L P — C特異性作用之機能。界面活性劑（d 3 )及界面活性 劑（d4)，各自單獨使用時，膽固醇酯水解酶及膽固醇氧 -27- 1379904

• Good’ s緩衝劑例如爲含有2 —嗎啉基乙烷磺酸（Μ E

. S)、雙（2 -羥基乙基）亞胺基參（羥基甲基）甲烷（B * i s_Tr i s)、N — (2 —乙醯胺基）亞胺基二乙酸（A 〇 DA)、哌畊- N，N’ 一雙（2 —乙烷磺酸）（PIPE S) 、N — (2 —乙醯胺基）一 2 —胺基乙烷磺酸（ACE S) 、3 -嗎啉基—2—羥基丙烷磺酸（MOPS 0 ) 、N，N 一雙（2 —羥基乙基）一 2 —胺基乙烷磺酸（BES) 、3 一嗎啉基丙烷磺酸（MOPS ) 、N —〔三（羥基甲基）甲基〕 • 一 2 —胺基乙烷磺酸（TES) 、2-〔4-(2 —羥基乙 基）一1—哌阱基〕乙烷磺酸（HEPES) 、3 —〔N， N —雙（2 —羥基乙基）胺基〕一 2 —羥基丙烷磺酸（D I PSO) 、N —〔三（羥基甲基）甲基〕一2 —羥基—3-胺基丙烷磺酸（TAPS0)、哌畊一 N，N’ —雙（2 — 羥基丙烷磺酸）（P〇PSO)、3—〔4 一（2 —羥基乙 基）一1 一哌阱基〕—2—羥基丙烷磺酸（HEPPS0)、 3 —〔 4 一（ 2 —羥基乙基）一1 —哌阱基〕丙烷磺酸〔（H) ® EPPS〕、N —〔三（羥基甲基）甲基〕甘胺酸（Tr i cine) 、N,N -雙（2 —羥基乙基）甘胺酸（Bic i n e )、N —三（經基甲基）甲基—3_胺基丙院磺酸（T APS) 、N —環己基一2 —胺基乙烷磺酸（CHES)、 N -環己基—3 -胺基—2 —羥基丙烷磺酸（CAPS 0) 、N—環己基—3 -胺基丙烷磺酸（CAPS)。 -32- 1379904 緩衝液通常使用pH4〜1 Ο、較佳爲5〜9,通常爲0. 〇01 〜0.5mo 1/L，較佳爲 〇.〇〇5〜0.2mo 1/L，更佳爲〇.〇 1〜O.lmo 1/L之濃度。 過氧化氫定量用之色原體可舉例爲過氧化酶之存在下使 用過氧化氫由於氧化而變換色素之色原體，其例爲含有無色 型（leuco type)色原體、酸化偶合型（coupling type) 色原體。無色型色原體於過氧化氫及過氧化酶等之過氧化活 性物質之存在下，單獨變換色素之物質。 無色型色原體之例爲1 0-N—羧基甲基胺甲醯基-3 , 7 —雙（二甲基胺基）一1〇Η —啡噻阱（CCAP) 、1 0— (N —甲基胺甲醯基）一3, 7 —雙（二甲基胺基）一 1 0H-啡噻哄（MCDP) 、N —(羧基甲基胺基羰基） -4,4' 一雙（二甲基胺基）二苯基胺鈉鹽（DA—64)、 4,4' 一雙（二甲基胺基）二苯基胺、雙〔3_雙（4 一 氯苯基）甲基-4 一二甲基胺基苯基〕胺（BCMA)。 氧化偶合型色原體爲於過氧化氫及過氧化酶等之過酸化 活性物質存在下，由2個化合物氧化偶合而變換偶合色素之 色原體。2個化合物之組合例爲含有偶合物（coupler)與 苯胺類之組合、偶合物與苯酚類之組合。 偶合物之例爲4 -胺基安替比林（a n t i py r i n e ) ( 4 — A A) ' 3 —甲基一2 —苯并噻唑啉肼。苯胺類之例爲包含N —(3-磺丙基）苯胺、N-乙基一N—(2-羥基一3— 磺丙基）一3 -甲基苯胺T00S ) 、N -乙基- n_(2 — 輕基—3 —擴丙基）一3,5 —二甲基苯胺（ma〇S)、 -33- 1379904 - N_乙基一N— (2 —羥基一3 —磺丙基）一3,5 —二甲 . 氧基苯胺（DAOS) 、N —乙基一 N—(3_磺丙基）— • 3 —甲基苯胺（T0PS)、N-(2-羥基一3-磺丙基） —3,5 —二甲氧基苯胺（HDA0S) 'Ν,Ν —二甲基一 «· 3 —甲基苯胺、Ν，Ν_二（3 -磺丙基）—3，5 —二甲氧 基苯胺、Ν-乙基_Ν-( 3 —磺丙基）一3 —甲氧基苯胺、 Ν —乙基—Ν— (3_磺丙基）苯胺、Ν —乙基—Ν— (3 一磺丙基）_3,5 —二甲氧基苯胺、Ν— (3_磺丙基） • 一3,5_二甲氧基苯胺、Ν —乙基—Ν— (3 —磺丙基） —3, 5 —二甲基苯胺、Ν-乙基一 Ν - (2 —羥基—3-磺丙基）_ 3-甲氧基苯胺、Ν —乙基一 Ν— ( 2 —羥基— 3 -磺丙基）苯胺、Ν —乙基一Ν-( 3 —甲基苯基）-Ν’ —琥珀醯基伸乙基二胺（EMSE) 、Ν —乙基- Ν-(3 —甲基苯基）-Ν’ 一乙醯基伸乙基二胺、Ν —乙基一Ν — (2 —羥基_3 —磺丙基）—4 —氟一 3, 5 —二甲氧基苯 胺（F — DAOS)。苯酚類之例包含苯酚、4 -氯苯酚、 ® 3_甲基苯酚、3_羥基一 2,4,6_三碘安息香酸（11丁 I B )。 過氧化酶通常使用1〜1 0 OkU/L之濃度。色原體通 常使用0.0 1〜1 Og/L之濃度。 還原型輔酶之定量用色原體可使用例如心肌黃酶或電子 載體存在下之還原型輔酶與還原而色素變換的色原體，其例 爲3—（4,5_二甲基一2—噻唑基）一2,5-二苯基一 2H —四唑鑰溴化物（MTT) 、2— (4-碘苯基）—3 -34- 1379904 —(4-硝基苯基）一5 - (2, 4 —二磺基苯基）-2H 一四唑鎗單鈉鹽（WST - 1) 、2— (4—碘苯基）—3 —(2，4_二硝基苯基）一5_ ( 2，4~二磺基苯基）— 2H —四唑鎰單鈉鹽（WST — 3)。 心肌黃酶及電子載體通常使用1〜1 〇 〇 kU/L之濃 度。色原體通常使用Ο ·0 1〜1 0 g/L之濃度。 環糊精或其衍生物之例爲環糊精、二甲基環糊精、三甲基 環糊精、羥基乙基環糊精、羥基丙基環糊精、较基甲基環糊 精、糖基環糊精、麥芽糖基環糊精、環糊精硫酸鹽、環糊精 聚合物，以羥基乙基環糊精及羥基丙基環糊精爲較佳。。 環糊精之例爲α —環糊精、点-環糊精、r_環糊精。 二甲基環糊精之例爲二甲基一α —環糊精、二甲基一沒一 環糊精、二甲基一γ—環糊精。 三甲基環糊精之例爲三甲基一α-環糊精、三甲基一泠-環糊精、三甲基一7 —環糊精。 羥基乙基環糊精之例爲羥基乙基_ α —環糊精、羥基乙基 —/3 —環糊精、羥基乙基—7_環糊精。 羥基丙基環糊精之例爲羥基丙基- α -環糊精、羥基丙基 一冷一環糊精 '羥基丙基一 r —環糊精。 羧基甲基環糊精之例爲羧基甲基一α -環糊精、羧基甲基 一冷一環糊精、羧基甲基一 r_環糊精。 糖基環糊精之例爲糖基一 α -環糊精、糖基-/3 —環糊 精、糖基_τ一環糊精。 -35- 1379904 麥芽糖基環糊精之例爲麥芽糖基- α -環糊精、麥芽糖基 - —沒一環糊精、麥芽糖基一 r 一環糊精。 ^ 環糊精硫酸鹽之例爲α _環糊精硫酸鹽、々-環糊精硫酸 • 鹽、τ 一環糊精硫酸鹽。 環糊精聚合物之例爲石-環糊精聚合物。可組合2種類以 上之環糊精或其衍生物來使用。 水性媒劑中環糊精或其衍生物之濃度以0 .0 0 1〜5 (w/v )% 爲佳，較佳爲 〇 .〇 〇 5 〜2 .5(w/v)%， ® 特佳爲 0_01 〜1 (w/v)%。 白蛋白之例包含牛、馬、羊、人由來之白蛋白，以牛血清 白蛋白（B SA )爲較佳。亦可使用遺傳子工程手法所製造 之白蛋白，亦可組合2種類以上之白蛋白來使用。’水性媒劑 中，白蛋白之濃度爲0.00 1〜5 (w/v) %爲較佳， 0.00 5 〜2.5 (w/v) % 爲更佳，0.01 〜1 (w / v ) %爲特佳。 脂蛋白凝集劑爲磷鎢酸酸鹽、右旋糖硫酸鹽、肝素等之聚 ® 陰離子，或鎂、鈣、鈷等2價金屬鹽。水性媒劑中、脂蛋白 凝集劑之濃度各自獨立以0.00 1〜5 (w/v) %爲較 佳、0.005 〜2·5 (w/v)% 更佳，、0.01 〜1 (w / v ) %爲特佳。 酵素活性化劑之例包含膽汁酸類、烷基磺酸鹽等之陰離子 性界面活性劑。膽汁酸類之例包含膽酸、去氧膽酸、牛磺膽 酸、鵝去氧膽酸。烷基磺酸鹽之例包含1 一戊磺酸鹽、1 - 1379904 " 己磺酸鹽、1-庚磺酸鹽、1 -辛磺酸鹽。烷基磺酸鹽中鹽 - 之例包含銨鹽、鋰鹽、鈉鹽 '鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽。 ^ 安定化劑之例包含伸乙基二胺四乙酸（E D T A )、蔗糖、 . 氯化鈣。 防腐劑之例包含重氮化鈉、抗生物質。 干渉抑制劑之例包含抗抑制壞血酸影響用之抗壞血酸氧 化酶、抑制膽紅素之影響用之亞鐵氰化鉀。 鹽類之例包含氯化鋰、硫酸鋰、氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、 ® 硫酸鉀'氯化鎂、硫酸鎂、乙酸鎂、氯化銨、硫酸鎂、硝酸 鎂、硝酸鈣。 本發明之R L P _ C之定量方法可以下列具體的態樣作 爲例示。 定量方法1 (1 )於水性媒劑中，試料、水解磷脂質之酵素、界面活 性劑（d 1 )、界面活性劑（d 2 )、膽固醇酯水解酶及膽 固醇氧化酶之存在下進行酵素反應， ® ( 2 )測定生成之過氧化氫， (3 )由（2 )所測定之値與預先作成之校正曲線，決定 試料中之RLP-C濃度之方法。 定量方法2 (1 )於水性媒劑中，試料、水解磷脂質之酵素、界面活 性劑（d 3 )、界面活性劑（d 4 )、膽固醇酯水解酶及膽 固醇氧化酶之存在下，進行酵素反應， (2 )測定生成之過氧化氫， -37- 1379904 - (3 )由（2 )測定之値與預先作成之校正曲線決定試料 中之RLP—C濃度之方法。 , 定量方法3 (1 )水性媒劑中 '試料、水解磷脂質之酵素、界面活性 «* 劑（d 1 )、界面活性劑（d 2 )、膽固醇酯水解酶、氧化 型輔酶及膽固醇脫氫酵素之存在下進行酵素反應， (2)測定生成之還原型輔酶， (3 )由（2 )測定之値與預先作成之校正曲線，決定試 • 料中之RLP-C濃度之方法。 定量方法4 (1 )水性媒劑中，試料、水解磷脂質之酵素、界面活性 劑（d 3 )、界面活性劑（d 4 )、膽固醇酯水解酶、氧化 型輔酶及膽固醇脫氫酵素之存在下進行酵素反應， (2 )測定生成之還原型輔酶， (3 )由（2 )測定之値與預先作成之校正曲線，決定試 料中之RL P—C濃度之方法。 • (RLP—C定量用試藥） 本發明之R L P - C定量用試藥含有水解磷脂質之酵 素、膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、及界面活性劑（d 1 ) 與界面活性劑（d 2 )之組合或界面活性劑（d 3 )與界面 活性劑（d 4 )之組合。該試藥可含有過氧化氫定量用試藥。 過氧化氫定量用試藥之例可列舉過氧化酶及前述過氧化酶 存在下過氧化氫與氧化之變換色素的色原體之試藥。 1379904 又，本發明之宜他r l P - C定量用試藥爲含有水解磷脂 - 質之酵素、膽固醇醋水解酶、氧化型輔酶'膽固醇脫氫酵素、 ^ 及界面活性劑（d 1 )與界面活性劑（d 2 )之組合或界面 • 活性劑（d 3 )與界面活性劑（d 4 )之組合。該試藥可含 有還原型輔酶定量用試藥。還原型輔酶定量用試藥之例可列 舉心肌黃酶或電子載體及前述心肌黃酶或電子載體存在下 還原型輔酶與還原而變換色素之色原體之試藥。 本發明之RL P - C定量用試藥可以下列具體的態様作 •爲例示。 試藥1 含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、界面活性劑（d 1) '界面活性劑（d2)及過氧化氫測定用試藥之試藥。 試藥？. 含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、界面活性劑（d 3 )、界面活性劑（d 4 )及過氧化氫測定用試藥之試藥。 試藥3 ® 含有膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酵素、界 面活性劑（d 1 )及界面活性劑（d 2 )之試藥。 試藥4 含有膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酵素、界 面活性劑（d 3 )及界面活性劑（d 4 )之試藥。 試藥5 -39- 1379904 含有膽固醇酯水解酶'氧化型輔酶、膽固醇脫氫酵素、界 面活性劑（d 1 )、界面活性劑（d 2 )及還原型輔酶測定 - 用試藥之試藥。 . 試藥6 含有膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶 '膽固醇脫氫酵素、界 面活性劑（d 3 )、界面活性劑（d 4 )及還原型輔酶測定 用試藥之試藥。 (RLP—C定量用套組） 1 本發明之RL P — C定量用試藥爲以套組形態保存、流通 及使用者爲較佳。套組之形態爲使用2種試藥及3種試藥， 但以2種試藥系爲較佳。 於第1試藥與第2試藥之2種試藥系套組中，膽固醇酯水 解酶與膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酵素可含於個別試藥 中，但於同一試藥中含有之套組爲較佳，特別是於第2試藥 中含有之套組爲佳。水解磷脂質之酵素含於第1試藥、第2 試藥中任一者或兩方中，但於第2試藥中含有者爲較佳。 界面活性劑（d 1 )與界面活性劑（d 2 )含於第1試藥、 第2試藥中任一者或兩方中，但界面活性劑（d i )於第j 試藥中含有者爲較佳。界面活性劑（d 3 )與界面活性劑（d 4 )含於第1試藥、第2試藥中任一者或兩方中，但界面活 性劑（d3)含於第1試藥中爲較佳。 氧化型輔酶含於第1試藥 '第2試藥中至少一方。過氧化 氫定量用試藥含於第1試藥 '第2試藥中至少一方，但當該 試藥爲含有氧化偶合型色原體時，氧化偶合型色原體之個別 -40- 1379904 化合物較佳爲含於個別試藥中。還原型輔酶定量用試藥含於 第1試藥、第2試藥中至少一方。 本發明之R L P — C定量用套組可以下列具體的態様作 爲例示。 套組1 •第1試藥 含有界面活性劑（d1)及過氧化氫定量用試藥之一部份 的試藥。 第2試藥 含有界面活性劑（d 2 )、水解磷脂質之酵素 '膽固醇酯 水解酶、膽固醇氧化酶及過氧化氫定量用試藥之殘餘一部分 之試藥。 套組2 第1試藥 含有界面活性劑（d 3 )及過氧化氫定釁用試藥之—部份 之試藥。 第2試藥 含有界面活性劑（¢34)、水解磷脂質之酵素、膽固醇醋 水解酶'膽固醇氧化酶及過氧化氫定量用試藥之殘餘之一部 份的試藥。 套組3_ 第1試藥 含有界面活性劑（d 1 )之試藥。 第2試藥 -41- 1379904 含有界面活性劑（d2)、水解磷脂質之酵素、膽固醇酯 水解酶、氧化型輔酶及膽固醇脫氫酵素之試藥。 套組4 第1試藥 含有界面活性劑（d 3)之試藥。 第2試藥 含有界面活性劑（d 4 )、水解磷脂質之酵素、膽固醇酯 水_酶、氧化型輔酶及膽固醇脫氫酵素之試藥。 套組？5 第1試藥 含有界面活性劑（d 1 )之試藥。 第2試藥 含有界面活性劑（d2)、水解磷脂質之酵素 '膽固醇酯 水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酵素及還原型輔酶定量用 試藥之試藥。 套組6 第1試藥 含有界面活性劑（d 3 )之試藥。 第2試藥 含有界面活性劑（d 4 )、水解磷脂質之酵素、膽固醇酯 水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酵素及還原型輔酶定量用 試藥之試藥。

本發明之RL P - C定量用試藥及套組可於試料中RL P — C之定量使用 -42- 1379904

第2試藥 MOPS ( ρ Η 6.8 ) 2 0mm ο 1/L 4 _胺基安替比林 0.5g/L WONDERSURF RL-100 1 g/L 過氧化酶 1〇U/mL 膽固醇酯水解酶（CHER) lU/mL 膽固醇氧化酶（CHOD) 3 U/mL 磷脂酶ϋ 【實施例2】 RLP—C定量用套組 5 U/mL 製作以下之第1試藥及第2試藥所形成的R L P - C定 量用套組。

•第1試藥 MOPS ( p H 6.8 ) 2 0 mm o 1/L T00S 0.3 g/L 硫酸鈉 2g/L Pronon B — 204 8g/L WONDERSURF ID-70 1 g/L 過氧化酶（P〇D) 10 U/mL 抗壞血酸氧化酶（AOD) _ 2U/mL -45- 1379904

•第2試藥 MOPS ( ρ Η 6.8 ) 4 一胺基安替比林 WONDERSURF ID-70 過氧化酶 膽固醇酯水解酶（CHER) 膽固醇氧化酶（CHOD)

磷脂酶D 【實施例3】 RLP—C定量用套組 製作以下第1試藥及第2 用套組。 •第1試藥 MOPS ( ρ Η 6.8 )

TOOS 硫酸鈉

Pronon B — 208 EMULGEN L-4 0 過氧化酶（P〇D) 抗壞血酸氧化酶（AOD) 2 0 mm o 1/L .

0.5g/L 1 g/L 1OU/mL

1 U/mL 3U/mL 5 U/mL 藥所形成之RLP — C定量

2 0mm o 1/L 0.3g/L 2g/L 8g/L 2g/L

1OU/mL 2 U/mL -46- 1379904

•第2試藥 MOPS ( ρ Η 6.8 ) 2 0 mm ο 1/L 4 —胺基安替比林 0.5 g/L EMULGEN L-40 3g/L 過氧化酶 1〇U/mL 膽固醇酯水解酶（CHER) 1 U/mL 膽固醇氧化酶（CH〇D) 3U/mL 磷脂酶D 比較例1 RLP—C定量用套組 5 U/mL 製作以下之第1試藥及第2試藥所形成之R L P - C定 量用套組。該處方爲特開2 0 0 1 — 2 3 1 5 9 7號公報之

實施例1中記載之處方。 •第1試藥 MOPS ( ρ Η 6.8 ) 2 0mm ο 1/L T00S 0.3 g/L 硫酸鈉 2g/L Pluronic F—108 1 g/L 過氧化酶（Ρ 0 D) 1OU/mL 抗壞血酸氧化酶（A〇D) 2 U/mL -47- 1379904 •第2試藥 MOPS ( p Η 6.8 ) 2 0 mm ο 1/L 4-胺基安替比林 0.5 g/L EMULGEN L-40 2g/L 過氧化酶 1OU/mL 膽固醇酯水解酶（CHER) 1 U/m L 膽固醇氧化酶（CHOD) 2U/mL 磷脂酶D 5 U/m L 【實施例4】 RLP—C之定量 使用實施例1之套組’於人類新鮮血清6 4個檢體中，藉 由日立7170型自動分析機將各檢體中之RLP—C以 下列方法定量。 (1 )校正曲線之作成 經由使用RLP-膽固醇「J IMR〇」I I (日本抗體 硏究所社製）的測定，使用判定R L P — C濃度爲3 2 . 4 ® m g / d L之血清標準液作爲標準品，將適當地稀釋該血清 標準液而調製的稀釋血清作爲校正曲線作成用樣品。 使用作爲測定用套組之實施例1之套組，依以下順序之步 驟，於日立7170型自動分析機，測定各稀釋血清中之R LP—C濃度而作成校正曲線。 於反應細胞中添加稀釋血清（3 .8 // L )與第1試藥（0 · 1 8mL)而於37°C加熱5分鐘，於主波長600nm、 副波長7 0 0 n m下測定反應液之吸光度（E 1 )(測光 -48- 1379904 點：16)，其次，於此反應液中，添加於37 °C下預加熱 之第2試藥（0.〇6mL)而於37°C下加熱5分鐘，於 主波長6 0 Onm、副波長700nm下測定反應液之吸光 度（E 2 )(測光點：3 2 )。由反應中吸光度變化（E 2 ~E1)與稀釋血清中之RLP—C濃度之關係作爲校正曲 線。 (2)人類新鮮血清64個檢體中之RLP—C之定量 使用人類新鮮血清6 4個檢體代替血清標準液，依據（1 ) 之相同方法，個別進行該6 4個檢體之反應，由反應後之反 應液吸光度與（1 )作成之校正曲線，定量各檢體中之RL P — C濃度。 【實施例5】 RLP—C之定量 除了使用實施例2之套組替代實施例1之套組之外，依實 施例4之定量法而同樣地藉由日立7 1 7 0型自動分析裝 置，定量實施例4中所使用之人類新鮮血清6 4個檢體中各 檢體中的RLP — C濃度。 【實施例6】 RLP — C之定量 除了使用實施例3之套組替代實施例1之套組之外，依實 施例4之定量法而同樣地藉由日立7 1 7 0型自動分析裝 置’定量實施例4中所使用之人類新鮮血清6 4個檢體中各 檢體中的R LP - C濃度。 比較例2 -49- 1379904 RLP — C之定量 除了使用比較例1之套組替代實施例1之套組之外，依實 施例4之定量法而同樣地藉由日立7 1 7 0型自動分析裝 置，定量實施例4中所使用之人類新鮮血清6 4個檢體中各 檢體中的RLP — C濃度》 試驗例1 使用RLP —膽固醇「J IMRO」I I (日本抗體硏究 所社製）測定其相關 前述人類新鮮血清6 4個檢體中，使用R L P —膽固醇 「J IMRO」I I (日本抗體硏究所社製），定量各檢體 中之RLP—C濃度。 各檢體中，以實施例4〜6及比較例2之定量法使用R L P _膽固醇「J I M R 0 j I I之定量法間的相關性評價其 相關係數。其結果示於1 1表。又，相關圖示於第1圖〜第 4圖中。 【表1 1】 定量法 使用RLP—膽固醇「JIMROjII之定量法間之相關 的相關係數 實施例4 0.9513 實施例5 0.9447 實施例6 0.9319 比較例2 , 0.9253 如表1 1所示，本發明之方法與比較例2 (使用特開2 0 0 1 — 2 3 1 5 9 7號公報之實施例1中記載的套組之定 量）比較，判定全部使用R L Ρ —膽固醇「j I μ R 0」I I之定量法間之相關性爲良好的處方。 -50- 1379904 試驗例2 III型高脂血症檢體中之RLP- C之定量 使用RLP-膽固醇「J IMROj I I (日本抗體硏究 - 所社製）、實施例1〜3及比較例1之套組決定111型高脂 . 血症患者之血清檢體中之RLP—C濃度。又，依使用RL P -膽固醇「〗IMRO」I I (日本抗體硏究所社製）測 定’將判明RL P — C濃度爲3 2 .4mg/d L之血清標 準液作爲標準品，適宜稀釋該血清標準液而調製之稀釋血清 作爲校正曲線作成用樣品。其結果示於表1 2中。 【表1 2】 定量法 III型高脂血症檢體中之H L P —C濃度 (mg/dL) 實施例1 28.6 實施例2 31.4 實施例3 26.5 比較例1 20.0 JIMR0 18.8 I I I型高脂血症患者之血清中，已知特別存有較多V L D L殘粒，因此，由表1 2之結果，於本發明之定量法中，與 比較例1之套組（特開2 0 0 1 — 2 3 1 5 9 7號公報之實 # 施例1中記載的套組）比較，VLDL殘粒中之膽固醇之反 應性係向上提升。又，即使與使用RLP -膽固醇「J IM ROj I I之定量法比較，本發明之定量法中對於RLP — C之反應性爲高的。 【實施例7】 RLP — C定量用套組 製作以下之第1試藥及第2試藥所形成的RL P- C定 量用套組。 -51- 1379904

2◦mm ο 1/L

0.3g/L 2g/L 8g/L 1 g/L 1 g/L 10 U/mL 2 U/mL 2 0 mm o 1/L 0.5 g/L 1 g/L 1 0 U/mL 1 U/mL 3 U/mL 5 U/mL •第1試藥 MOPS ( ρ Η 6.8 )

T00S 硫酸鈉

Pronon B — 208 EMULGEN L-40 WONDERSURF ID-70 過氧化酶（P〇D)

抗壞血酸氧化酶（A O D) •第2試藥 MOPS ( p H 6.8 ) 4 —胺基安替比林 WONDERSURF ID-70 過氧化酶 膽固醇酯水解酶（CHER) 膽固醇氧化酶（CHOD)

磷脂酶D 【實施例8】 RLP—C定量用套組 製作以下之第1試藥及第2試藥所形成之R L Ρ - C定 量用套組。 -52- 1379904 •第1試藥

2 0 mm ο 1/L 0.3g/L 2g/L 8 g/L 1 g/L 1 g/L 10 U/mL 2 U/mL 2 0 mm o 1/L 0.5g/L 1 g/L 1 g/L 10 U/mL 1 U/mL 3 U/mL 5U/mL

MOPS ( ρ Η 6.8 ) T00S 硫酸鈉

Pronon B — 208 EMULGEN L-40 WONDERSURF I D—7 0 過氧化酶（P◦D) 抗壞血酸氧化酶（A 0 D ) •第2試藥 MOPS ( ρ Η 6.8 ) 4 一胺基安替比林 WONDERSURF ID-70 EMULGEN L-40 過氧化酶 膽固醇酯水解酶（CHER) 膽固醇氧化ϋ (CHOD)

磷脂酶D 【實施例9】 RL P_C定量用套組 製作以下之第1試藥及第2試藥所形成之RL P_C定 量用套組。 -53- 1379904

2 0 mm o 1/L 0.3g/L 2g/L 8g/L 1 g/L 1 g/L 10 U/mL

2 U/mL 2 0 mm ο 1/L 0.5g/L 1 g/L 1OU/mL 1 U/mL 3 U/mL 5 U/mL •第1試藥 MOPS ( ρ Η 6.8 )

TOOS 硫酸鈉

Pronon B — 208 EMUL GEN L-4 0 WOND E RSURF ID-90 過氧化酶（P 0 D)

抗壞血酸氧化酶（AOD) •第2試藥 MOPS ( ρ Η 6.8 ) 4 -胺基安替比林 WONDERSURF I D—9 0 過氧化酶 膽固醇酯水解酶（CHER) 膽固醇氧化酶（CHOD)

磷脂酶D 【實施例1 0】 RLP — C定量用套組 製作以下之第1試藥及第2試藥所形成R L P — C定量 用套組。

-54- 1379904

•第1試藥 MOPS ( ρ Η 6.8 ) 2 0 mm ο 1/L T00S 〇.3g/L 硫酸鈉 2g/L Pronon B — 208 8 g/L EMULGEN L-40 1 g/L WONDERSURF ID—90 1 g/L 過氧化酶（P〇D) 1OU/mL 抗壞血酸氧化酶（AOD) 2U/mL •第2試藥 MOPS ( ρ Η 6 · 8 ) 2 0 mm o 1/L 4 _胺基安替比林 0.5 g/L WONDERSURF ID—90 1 g/L EMULGEN L-40 1 g/L 過氧化酶 1OU/mL 膽固醇醋水解酶（CHER) 1 U/mL 膽固醇氧化酶（CHOD) 3 U/mL 磷脂酶D 5 U/mL 【實施例1 1】 RLP—C之定量 作爲定量用套組，以實施例7之套組替換實施例1之套 組，作爲檢體，使用人類新鮮血清3 5個檢體替換實施例5 〜8所使用之人類新鮮血清6 4個檢體之外’以實施例4定 -55- 1379904 量法相同之方法，藉由日立7 1 7 0型自動分析裝置，定量 該3 5個檢體之各檢體中之RLP — C濃度。 【實施例1 2】 RLP-C之定量 使用實施例8之套組替換實施例7之套組之外，以實施例 1 1定量法之相同方法，藉由日立7 1 7 0型自動分析裝置 定量人類新鮮血清3乇個檢體之各檢體中之R L Ρ _ C濃 度。 【實施例1 3】 RLP-C之定量 使用實施例9之套組替換實施例7之套組之外，以實施例 1 1定量法之同様方法，藉由曰立7 1 7 0型自動分析裝置 定量人類新鮮血清3 5個檢體之各檢體中之R L Ρ - C濃 度。 【實施例1 4】 RLP — C之定量 使用實施例1 0之套組替換實施例7之套組之外，以實施 例1 1定量法之同樣方法，藉由日立7 1 7 0型自動分析裝 置定量人類新鮮血清3 5個檢體之各檢體中之RLP — C 濃度。 試驗例3 使用RLP —膽固醇「J IMRO」I I (日本抗體硏究 所社製）測定其相關性 -56- 1379904 以實施例1 1〜1 4使用之人類新鮮血清3 5個檢體 中，使用RLP -膽固醇「J IMRO」I I (曰本抗體硏 究所社製），而定量各檢體中之RLP — C濃度。 各檢體中，將實施例11〜14之定量法與使用RLP-膽固醇「J IMR〇」I I之定量法之相關性以相關係數評 價’其結果示於表1 3。又，相關圖示於第5圖〜第8圖(C 示1"。 【表1 3】 定量法 便用RLP—膽固醇「JIMROjII之定量法間之相關 的相關係數 實施例11 0.9764 實施例12 0.9826 實施例13 0.9756 實施例14 0.9745 如表1 3所示，使用作爲界面活性劑（d 2 )作爲2種類 界面活性劑之套組，與使用R L P -膽固醇「J I M R 0」 I I之定量法間被認爲有良好的相關關係。又，由表1 1所 示之實施例4〜6間之比較，使用1種界面活性劑（d 2 ) 之套組，亦較使用2種類使用的套組的定量之一方，被認爲 與使用RLP—膽固醇「J IMRO」I I的定量法間更具 相關性。 【産業上之利用可能性】 依據本發明，提供對於動脈硬化性疾患診断上有用的R L P — C之定量方法、試藥及套組。 【圖式簡單說明】 -57- 1379904 【第1圖】表示使用RLP —膽固醇「J IMROj I I (曰本抗體硏究所社製）之定量法與實施例4之定量法之相 - 關圖。 【第2圖】表示使用RLP-膽固醇「J IMROj I I (曰本抗體硏究所社製）之定量法與實施例5之定量法之相 關圖。 【第3圖】表示使用RLP-膽固醇「J IMROj I I (日本抗體硏究所社製）之定量法與實施例6之定量法之相 1關圖。 【第4圖】表示使用RLP —膽固醇「J IMR〇」I I (日本抗體硏究所社製）之定量法與比較例2之定量法之相 關圖。 【第5圖】表示使用RLP —膽固醇「J IMROj I I (曰本抗體硏究所社製）之定量法與實施例11之定量法之 相關圖。 【第6圖】表示使用RLP —膽固醇「J IMRO」I I 1 (日本抗體硏究所社製）之定量法與實施例12之定量法之 相關圖。 【第7圖】表示使用RLP—膽固醇「J IMROj I I (日本抗體硏究所社製）之定量法與實施例13之定量法之 相關圖。 【第8圖】表示使用RLP—膽固醇「J IMRO」I I (曰本抗體研究所社製）之定量法與實施例14之定量法之 相關圖。 -58-

Claims (1)

1011? 1011?1379904 修正本 第095 1048 17號「殘粒樣脂蛋白（RLP)中膽固醇之定量 方法、試藥及套組」專利案 (2011年12月30曰修正） 十、申請專利範圍： I〜種試料中殘粒樣脂蛋白膽固醇之定量方法，其特徵爲： 於含有試料之水性媒劑中，於（a)聚氧乙烯聚氧丁烯共聚合 物、與运自聚氧乙稀聚氧丙稀院基芳基酸、聚氧乙稀聚氧 丙烯烷基醚及聚氧乙烯聚氧丙烯短鏈分支烷基醚所組成 之群組之一種或二種以上之界面活性劑之組合，以及（b) 水解磷脂質之酵素存在下，對於試料中之殘粒樣脂蛋白膽 固醇，於（c)膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶或（d)氧化型 輔酶之存在下使膽固醇酯水解酶及膽固醇脫氫酵素作用 ’產生過氧化氫或還原型輔酶，而定量生成之過氧化氫或 還原型輔酶。 2 如申請專利範圍第！項之方法，其中過氧化氫之定量係於 過氧化酶存在下，將生成之過氧化氫與氧化發色型色原體 反應，而定量生成之色素。 3 _如申請專利範圍第〗項之方法，其中還原型輔酶之定量係 進行測定反應液之吸光度。 4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中還原型輔酶之定量係 使生成之還原型輔酶與還原發色型色原體反應，而進行定 量生成之色素。 5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其中聚氧乙 烯聚氧丁烯共聚合物爲一般式（I)所示之界面活性劑 RO- (C2H4〇) a- (c4H8〇) b- (c2h4o) c-h (I) 1379904 修正本 (式中’A、B及C代表相同或相異之1〜200之整數 ’ R代表氫原子、直鏈或分支院基）。 6.如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其中水解磷 脂質之酵素爲磷脂酶D、磷脂酶C或磷脂酶Α2» 如申請專利範圍第5項之方法’其中水解磷脂質之酵素爲 磷脂酶D、磷脂酶C或磷脂酶A2。 8·—種試料中之殘粒樣脂蛋白膽固醇定量用試藥，其特徵爲 含有水解磷脂質之酵素、膽固醇醋水解酶、膽固醇氧化酶 、及聚氧乙烯聚氧丁烯共聚合物、與選自聚氧乙烯聚氧丙 烯烷基芳基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚及聚氧乙烯聚氧 丙烯短鏈分支烷基醚所組成之群組之一種或二種以上的 界面活性劑之組合。 9.如申請專利範圍第8項之試藥，其進一步含有過氧化氫定 量用試藥。 10. —種試料中之殘粒樣脂蛋白膽固醇定量用試藥，其特徵爲 含有水解磷脂質之酵素、膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酵 .素、氧化型輔酶、及聚氧乙烯聚氧丁烯共聚合物、與選自 聚氧乙烯聚氧丙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚 及聚氧乙烯聚氧丙烯短鏈分支烷基醚所組成之群組之一 種或二種以上的界面活性劑之組合。 11. 如申請專利範圍第10項之試藥，其進一步含有還原型輔 酶定量用試藥。 12. 如申請專利範圍第8至11項中任一項之試藥，其中聚氧 乙烯聚氧丁烯共聚合物爲一般式（I)表示之界面活性劑 -2- 1379904 修正本 R〇- (c2h4o) a- (c4h8o) b- (c2h4o) c-h (i) (式中，A、B及c代表相同或相異之1〜200之整數 ’ R代表氫原子、直鏈或分支烷基）。 13. 如申請專利範圍第8至11項中任—項之試藥，其中水解 隣脂質之酵素爲磷脂酶D、憐脂酶c或磷脂酶A2。 14. 如申請專利範圍第12項之試藥，其中水解磷脂質之酵素 爲磷脂酶D、磷脂酶C或磷脂酶A2。 15. —種試料中之殘粒樣脂蛋白膽固醇定量用套組，其特徵爲 含有：含聚氧乙燒聚氧丁稀共聚合物之第1試藥，與含有 水解磷脂質之酵素、膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶之第 2試藥，而且第1試藥及第2試藥之至少一者中含選自聚 氧乙烯聚氧丙烯烷基芳基酸、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚及 聚氧乙烯聚氧丙烯短鏈分支烷基醚所組成之群組的一種 或二種以上之界面活性劑。 16. 如申請專利範圍第15項之套組，又第1試藥、第2試藥 之至少一者含有過氧化氫定量用試藥。 P·-種試料中之殘粒樣脂蛋白膽固醇定量用套組，其特徵爲 含有：含聚氧乙烯聚氧丁烯共聚合物之第1試藥，與含水 解磷脂質之酵素、膽固醇酯水解酶及膽固醇脫氫酵素之第 2試藥，第1試藥、第2試藥之至少一者含選自聚氧乙烯 聚氧丙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚及聚氧乙 烯聚氧丙烯短鏈分支烷基醚所組成之群組的一種或二種 以上之界面活性劑，而且第1試藥、第2試藥之至少一者 含有氧化型輔酶。 -3- 1379904 修正本 18. 申請專利範圍第17項之套組，又第1試藥、第2試藥 之至少一者含有還原型輔酶定量用試藥。 19. 如申請專利範圍第15至18項中任一項之套組，其中聚氧 乙烯聚氧丁烯共聚合物爲一般式（I)所示之界面活性劑 RO- (c2h4o) a- (c4h8o) b- (C2H4〇) c-H (I) (A、B及C代表相同或相異之1〜200之整數，R代表 氫原子、直鏈或分支烷基）。 2 0.如申請專利範圍第15至1 8項中任一項之套組，其中水解 磷脂質之酵素爲磷脂酶D、磷脂酶C'或磷脂酶A2。 2 1 .如申請專利範圍第1 9項之試藥，其中水解磷脂質之酵素 爲磷脂酶D、磷脂酶C或磷脂酶A2。

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