CN106282313B - 一种用于低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的稳定剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体地说是一种用于低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的稳定剂，其特征在于该稳定剂由明胶、MgSO4、甘油、甜菜碱、海藻糖、聚乙二醇、EDTA组成，用于低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的稳定剂，可以显著延长低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的有效期至2年，开瓶稳定性达到3个月，且明显降低空白吸光度值，试剂操作简单，结果准确，稳定性好。

Description

一种用于低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的稳定剂
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体地说是一种配置简单、试剂有效期增长、开瓶稳定性高的用于低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的稳定剂。
背景技术
众所周知，低密度脂蛋白胆固醇用于冠心病和动脉粥样硬化的诊断。动脉粥样硬化(AS)斑块中沉淀的脂质主要是低密度脂蛋白(LDL),在各类脂质中，LDL被认为是主要的致病因素，而高密度脂蛋白（HDL）可能起保护作用，血清总胆固醇(TC)大，致反映LDL胆固醇(LDL-CHO)水平，但也受HDL-C水平的影响，因此在AS脂类危险因素判别中，TC偏高时，测定LDL-C有重要临床意义。
目前，低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒多采用直接法-表面活性剂清除法，由于其高灵敏度，高准确性、高精密性及适用性而在临床上广泛使用，但因为酶的活性会受到PH、温度、化学试剂的干扰，从而导致检测试剂存在稳定性差的问题，影响临床使用，目前市场上的低密度脂蛋白胆固醇检测试剂的保存条件及期限为，未开封试剂避光保存于2~8℃，有效期12个月；试剂开封后避光保存于2~8℃，在无污染情况下有效期1个月。
发明内容
本发明的目的是解决上述现有技术的不足，提供一种配置简单、试剂有效期增长、开瓶稳定性高的用于低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的稳定剂。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的稳定剂，其特征在于该稳定剂由明胶 、MgSO4 、甘油 、甜菜碱、海藻糖 、聚乙二醇、EDTA 组成，其重量组分为：明胶 1～10ml/L，MgSO4 0.1～5g/L,甘油 1～15ml/L，甜菜碱0.1～1mol/L，海藻糖 0.1g/L～20 g/L，聚乙二醇 0.5～2g/L,EDTA 0.5～2.0g/L。
本发明中用于低密度脂蛋白胆固醇检测试剂，由试剂1和试剂2组成：
R1：PIPES-Na 80mmol/L，胆固醇酯酶 2KU/L，胆固醇氧化酶 2KU/L，过氧化氢酶200LU/L，4-氨基安替比林 200mmol/L，三甲基-β-环糊精 5g/L，环氧乙烷十八烷胺 3g/L，亚铁氰化钾 50μmol/L，氯化钠 25ml/L，Proclin300 0.05%。
R2： PIPES-Na 80mmol/L，过氧化物酶 2KU/L，氯化钠 0.9g/L，BSA 1.5g/L，叠氮钠 2.0g/L，TritonX-100 18g/L。
本发明所述稳定剂的使用量在试剂中的体积为5 ml/L。
本发明所述的稳定剂的PH为6.8-7.0，PH对于酶的活性有很大的影响，影响机制很复杂，主要有下列几个方面：1.pH过小（过酸）、过大（过碱）都能使酶蛋白变性而失活.2.pH的改变能影响酶活性中心上必须基团的解离程度，同时也可以影响底物和辅酶的解离程度，从而影响酶分子对底物分子的结合和催化，只有在特定的pH下，酶、底物和辅酶的解离状态，最适宜它们相互结合，并发生催化作用，从而使酶反应速度达到最大值。这个pH称为酶的最适PH（optimun pH）酶的最适pH不是一个常数，它的大小与底物的种类和浓度、缓冲液的性质和浓度、介质的离子浓度、温度、反应时间有关，在测定某种酶的活力时，采用该酶的最适pH，并用适当的缓冲液维持最适pH。
本发明由于该稳定剂由明胶 、MgSO4 、甘油 、甜菜碱、海藻糖 、聚乙二醇、EDTA组成，用于低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的稳定剂，可以显著延长低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的有效期至2年，开瓶稳定性达到3个月，且明显降低空白吸光度值，试剂操作简单，结果准确，稳定性好。
具体实施方式
一种用于低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的稳定剂，其特征在于该稳定剂由明胶 、MgSO4 、甘油 、甜菜碱、海藻糖 、聚乙二醇、EDTA 组成，其重量组分为：明胶 1～10ml/L，MgSO4 0.1～5g/L,甘油 1～15ml/L，甜菜碱0.1～1mol/L，海藻糖 0.1g/L～20 g/L，聚乙二醇 0.5～2g/L,EDTA 0.5～2.0g/L，所述的用于低密度脂蛋白胆固醇检测试剂，由试剂1和试剂2组成：R1：PIPES-Na 80mmol/L，胆固醇酯酶 2KU/L，胆固醇氧化酶 2KU/L，过氧化氢酶200LU/L，4-氨基安替比林 200mmol/L，三甲基-β-环糊精 5g/L，环氧乙烷十八烷胺 3g/L，亚铁氰化钾 50μmol/L，氯化钠 25ml/L，Proclin300 0.05%，R2： PIPES-Na 80mmol/L，过氧化物酶 2KU/L，氯化钠 0.9g/L，BSA 1.5g/L，叠氮钠 2.0g/L，TritonX-100 18g/L，所述稳定剂的使用量在试剂中的体积为5 ml/L，所述的试剂的PH为6.8-7.0，这个PH值是胆固醇酯酶，胆固醇氧化酶及过氧化氢酶的最适PH值，在此PH值的条件下，可以有效的保护酶不发生变性而失活，以延长酶的活性，从而有效的延长试剂的稳定性。在此PH值范围内，加入样品后，酶可以最大程度的催化反应，从而使酶反应速度达到最大值。
低密度脂蛋白胆固醇检测试剂的反应原理为：
（1）具有特异选择性的缓冲液作用于血清中CM、VLDL、HDL，并在胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的催化下反应生成H2O2，H2O2被过氧化氢酶分解为H2O和O2，此时由于缺少Trinder反应的其中一个色原，测定体系不显色；
（2）在表面活性剂的作用下，胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶催化LDL-C反应并显色，用生化分析仪比色定量。
反应一：CM VLDL HDL + 选择性抑制剂 + CHER + CHOD→ 4-胆甾烯酮 + H2O2
H2O2 + CAT→H2O + O2
反应二：LDL+叠氮钠+表面活性剂+ CHER+CHOD→ 4-胆甾烯酮+H2O2
H2O2 + 4-AAP +HRP→苯醌亚胺色素
本发明高/低密度脂蛋白胆固醇检测试剂，适用于各类自动、半自动生化仪，以奥林巴斯AU400全自动生化仪为例，其操作如下：
Figure 741482DEST_PATH_IMAGE002
分析方法：终点法，试剂的用量为R1 225ul，样本量为3ul，将样本加入试剂1于37℃孵育3～5分钟后读取吸光度值A1，然后加入试剂2，加样量为75 ul，于37℃孵育5分钟后读取吸光度值A2，检测波长主波长为546nm，副波长为700nm。
本实验的目的是检测试剂的空白吸光度值、开瓶稳定性、长效稳定性。
操作步骤：使用定标液定标，取三个水平的质控各测定10次，取平均值，计算相对偏差。质控采用朗道质控（CAT.NO.LE2663 LOT.NO.2162CH LOT.NO.2220CHLOT.NO.2141CH）,三个水平的靶值范围分别为
Figure 658622DEST_PATH_IMAGE004
结果分析：根据检测数据，计算测定值均值、相对偏差。
表一结果显示，本发明试剂空白本地明显低于对比试剂，表明试剂的准确度高，精密性好，测试误差小，干扰因素少。
表二结果显示，对比试剂仅在一个月内表现出良好的测试结果，后期偏离靶值幅度较大，而本发明试剂在开瓶后3个月，对同一质控测定10次，相对偏差均小于6%，表明试剂在开瓶后非常稳定，准确性良好，为测试人员提供了方便快捷的检测试剂。
表三结果显示，对比试剂仅在一年内内表现出良好的测试结果，后期偏离靶值幅度较大，而本发明试剂在规定的储存条件下放置两年后，试剂依然非常稳定，相对偏差均小于6%，准确性好。显著延长了试剂的使用期限。
表1：低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒
空白吸光度值 不加稳定剂 加入稳定剂
OD（均值） 0.1513 0.0481
表2：低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒
Figure 500676DEST_PATH_IMAGE006
表3：低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒
Figure 82836DEST_PATH_IMAGE008
本发明试剂中一定比例的MgSO4及过氧化氢酶起到了降低空白本底的作用，其中过氧化氢酶通过催化过氧化氢反应生成水和氧气从而减少因4-氨基安替比林被氧化而产生的颜色反应，达到降低空白本底的效果。 MgSO4的硫酸根离子可以降低4-氨基安替比林被氧化的速度而减少因4-氨基安替比林被氧化而产生的颜色反应，从而降低空白本底。
含有MgSO4及过氧化氢酶与不含有MgSO4及过氧化氢酶的对比试验实验数据：
Figure 834892DEST_PATH_IMAGE010
本发明试剂中一定比例的明胶可以减缓有机试剂对酶的失活作用。甘油及甜菜碱起到抑制酶分子间聚集的作用，维持酶分子的二级结构，增强酶的稳定性。海藻糖即可通过氢键与酶表面分子结合，稳定酶活性，也可抑制酶分子间聚集，有效阻止酶分子变性失活。聚乙二醇具有疏水亲水的双重特性，可以提高酶的稳定性。酶分子易受到蛋白水解酶的影响，一旦条件适宜，就会发生水解反应，EDTA可避免水解现象，维持酶分子的活性。
Figure 867742DEST_PATH_IMAGE012
Figure 72459DEST_PATH_IMAGE014
本发明的用于低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的稳定剂，可以显著延长高/低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的有效期至2年，开瓶稳定性达到3个月，且明显降低空白吸光度值，试剂操作简单，结果准确，稳定性好，实验采用奥林巴斯AU400全自动生化仪进行，但本发明的试剂不限于上述仪器，还适用于其他半自动或全自动生化分析仪。
现有的低密度脂蛋白胆固醇检测试剂的成分有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶、tween-80、曲拉通x-100、4-氨基安替比林、缓冲液，没有稳定剂，所以开瓶稳定性仅一个月，开瓶效期仅一年。

Claims (3)

1.一种用于低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的稳定剂，其特征在于该稳定剂由明胶 、MgSO4 、甘油 、甜菜碱、海藻糖 、聚乙二醇、EDTA 组成，其重量组分为：明胶 1～10ml/L，MgSO4 0.1～5g/L,甘油 1～15ml/L，甜菜碱0.1～1mol/L，海藻糖 0.1g/L～20 g/L，聚乙二醇 0.5～2g/L,EDTA 0.5～2.0g/L，所述的用于低密度脂蛋白胆固醇检测试剂，由试剂1和试剂2组成：
R1：PIPES-Na 80mmol/L，胆固醇酯酶 2KU/L，胆固醇氧化酶 2KU/L，过氧化氢酶200LU/L，4-氨基安替比林 200mmol/L，三甲基-β-环糊精 5g/L，环氧乙烷十八烷胺 3g/L，亚铁氰化钾 50μmol/L，氯化钠 25ml/L，Proclin300 0.05%；
R2： PIPES-Na 80mmol/L，过氧化物酶 2KU/L，氯化钠 0.9g/L，BSA 1.5g/L，叠氮钠2.0g/L，TritonX-100 18g/L。
2.根据权利要求1所述的一种用于低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的稳定剂，其特征在于所述的稳定剂的使用量在试剂中的体积为5 ml/L。
3.根据权利要求1所述的一种用于低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的稳定剂，其特征在于所述的稳定剂的PH为6.8-7.0。
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