CN106191211B - 一种用于高密度脂蛋白胆固醇检测试剂的稳定剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及体外诊断试剂技术领域,具体地说是一种用于高密度脂蛋白胆固醇检测试剂的稳定剂,其特征在于该稳定剂由明胶、MgSO4、甘油、甜菜碱、海藻糖、聚乙二醇、EDTA、聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚组成,用于高密度脂蛋白胆固醇测定试剂的稳定剂,可以显著延长高密度脂蛋白胆固醇测定试剂的有效期至2年,开瓶稳定性达到3个月,且明显降低空白吸光度值,试剂操作简单,结果准确,稳定性好。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂技术领域,具体地说是一种配置简单、试剂有效期增长、开瓶稳定性高的用于高密度脂蛋白胆固醇检测试剂的稳定剂。
背景技术
众所周知,高密度脂蛋白胆固醇的主要生理功能是转运磷脂和胆固醇,它是一种抗动脉粥样硬化的脂蛋白,是冠心病的保护因子,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量与动脉管腔狭窄程度呈显著的负相关,临床上以不同种类脂蛋白比例的分析作为不同类型的高脂蛋白症的鉴别诊断,高密度脂蛋白胆固醇增高常见于:饮酒、长期体力活动等,高密度脂蛋白胆固醇降低常见于:冠心病、脑血管病、糖尿病、肝炎、肝硬化等。
目前,高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒多采用直接法-选择抑制法,由于其高灵敏度,高准确性、高精密性及适用性而在临床上广泛使用,但因为酶的活性会受到PH、温度、化学试剂的干扰,从而导致检测试剂存在稳定性差的问题,影响临床使用,目前市场上的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂的保存条件及期限为,未开封试剂避光保存于2~8℃,有效期12个月;试剂开封后避光保存于2~8℃,在无污染情况下有效期1个月。
发明内容
本发明的目的是解决上述现有技术的不足,提供一种配置简单、试剂有效期增长、开瓶稳定性高的用于高密度脂蛋白胆固醇检测试剂的稳定剂。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
一种用于高密度脂蛋白胆固醇检测试剂的稳定剂,其特征在于该稳定剂由明胶、MgSO4 、甘油 、甜菜碱、海藻糖、聚乙二醇、EDTA 、聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚组成,各组分的成分比为:明胶 1~10ml/L,MgSO4 0.1~5g/L,甘油 1~15ml/L,甜菜碱0.1~1mol/L,海藻糖 0.1g/L~20 g/L,聚乙二醇 0.5~2g/L,EDTA 0.5~2.0g/L,聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚 1~5g/L。
本发明所述的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂由试剂1和试剂2组成,其中:
R1:PIPES-Na 80mmol/L,胆固醇酯酶 2KU/L,胆固醇氧化酶 2.5KU/L,过氧化氢酶120LU/L,4-氨基安替比林 240mmol/L,α-环糊精 1g/L,tween-80 3ml/L,硫酸葡聚糖0.5g/L,Proclin300 0.05%。
R2: PIPES-Na 80mmol/L,过氧化物酶 2KU/L,氯化钠 0.9g/L,BSA 1.5g/L,叠氮钠 2.0g/L,聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚 1g/L。
本发明所述稳定剂的使用量在试剂中的体积为5 ml/L。
本发明所述的稳定剂的PH为6.8-7.0, PH对于酶的活性有很大的影响,影响机制很复杂,主要有下列几个方面:1.pH过小(过酸)、过大(过碱)都能使酶蛋白变性而失活.2.pH的改变能影响酶活性中心上必须基团的解离程度,同时也可以影响底物和辅酶的解离程度,从而影响酶分子对底物分子的结合和催化,只有在特定的pH下,酶、底物和辅酶的解离状态,最适宜它们相互结合,并发生催化作用,从而使酶反应速度达到最大值。这个pH称为酶的最适PH(optimun pH)酶的最适pH不是一个常数,它的大小与底物的种类和浓度、缓冲液的性质和浓度、介质的离子浓度、温度、反应时间有关,在测定某种酶的活力时,采用该酶的最适pH,并用适当的缓冲液维持最适pH。
本发明由于稳定剂由明胶、MgSO4 、甘油 、甜菜碱、海藻糖、聚乙二醇、EDTA 、聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚组成,用于高密度脂蛋白胆固醇测定试剂的稳定剂,可以显著延长高密度脂蛋白胆固醇测定试剂的有效期至2年,开瓶稳定性达到3个月,且明显降低空白吸光度值,试剂操作简单,结果准确,稳定性好。
具体实施方式
一种用于高密度脂蛋白胆固醇检测试剂的稳定剂,其特征在于该稳定剂由明胶、MgSO4 、甘油 、甜菜碱、海藻糖、聚乙二醇、EDTA 、聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚组成,各组分的成分比为:明胶 1~10ml/L,MgSO4 0.1~5g/L,甘油 1~15ml/L,甜菜碱0.1~1mol/L,海藻糖 0.1g/L~20 g/L,聚乙二醇 0.5~2g/L,EDTA 0.5~2.0g/L,聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚 1~5g/L,所述的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂由试剂1和试剂2组成,其中:R1:PIPES-Na 80mmol/L,胆固醇酯酶 2KU/L,胆固醇氧化酶 2.5KU/L,过氧化氢酶 120LU/L,4-氨基安替比林 240mmol/L,α-环糊精 1g/L,tween-80 3ml/L,硫酸葡聚糖 0.5g/L,Proclin300 0.05%,R2: PIPES-Na 80mmol/L,过氧化物酶 2KU/L,氯化钠 0.9g/L,BSA1.5g/L,叠氮钠 2.0g/L,聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚 1g/L,所述稳定剂的使用量在试剂中的体积为5 ml/L,所述的稳定剂)的PH为6.8-7.0,这个PH值是胆固醇酯酶,胆固醇氧化酶及过氧化氢酶的最适PH值,在此PH值的条件下,可以有效的保护酶不发生变性而失活,以延长酶的活性,从而有效的延长试剂的稳定性。在此PH值范围内,加入样品后,酶可以最大程度的催化反应,从而使酶反应速度达到最大值。
高密度脂蛋白胆固醇检测试剂的反应原理为:
1) 具有特异选择性的缓冲液作用于血清中CM、VLDL、LDL,并在胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的催化下反应生成H2O2,H2O2被过氧化氢酶分解为H2O和O2,此时由于缺少Trinder反应的其中一个色原,测定体系不显色;
2) 在表面活性剂的作用下,胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶催化HDL-C反应并显色,用生化分析仪比色定量。
反应一:CM VLDL LDL + 选择性抑制剂 + CHER + CHOD→ 4-胆甾烯酮 + H2O2
H2O2 + CAT→H2O + O2
反应二:HDL+叠氮钠+表面活性剂+ CHER+CHOD→ 4-胆甾烯酮+H2O2
H2O2 + 4-AAP +HRP→苯醌亚胺色素
本发明高密度脂蛋白胆固醇检测试剂,适用于各类自动、半自动生化仪,以奥林巴斯AU400全自动生化仪为例,其操作如下:
分析方法:终点法,试剂的用量为R1 225ul,样本量为3ul,将样本加入试剂1于37℃孵育3~5分钟后读取吸光度值A1,然后加入试剂2,加样量为75 ul,于37℃孵育5分钟后读取吸光度值A2,检测波长主波长为546nm,副波长为700nm。
本实验的目的是检测试剂的空白吸光度值、开瓶稳定性、长效稳定性。
操作步骤:使用定标液定标,取三个水平的质控各测定10次,取平均值,计算相对偏差。质控采用朗道质控(CAT.NO.LE2663 LOT.NO.2162CH LOT.NO.2220CHLOT.NO.2141CH),三个水平的靶值范围分别为
结果分析:根据检测数据,计算测定值均值、相对偏差。
表一结果显示,本发明试剂空白本底(未添加样品时试剂中某些成份本身具有的吸光度值)明显低于对比试剂,表明试剂的准确度高,精密性好,测试误差小,干扰因素少。
表二结果显示,对比试剂仅在一个月内表现出良好的测试结果,后期偏离靶值幅度较大,而本发明试剂在开瓶后3个月,对同一质控测定10次,相对偏差均小于6%,表明试剂在开瓶后非常稳定,准确性良好,为测试人员提供了方便快捷的检测试剂。
表三结果显示,对比试剂仅在一年内内表现出良好的测试结果,后期偏离靶值幅度较大,而本发明试剂在规定的储存条件下放置两年后,试剂依然非常稳定,相对偏差均小于6%,准确性好。显著延长了试剂的使用期限。
表1:高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒
空白吸光度值 | 不加稳定剂 | 加入稳定剂 |
OD(均值) | 0.1231 | 0.0432 |
表2:高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒
表3:高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒
本发明试剂中一定比例的MgSO4及过氧化氢酶起到了降低空白本底的作用,其中过氧化氢酶通过催化过氧化氢反应生成水和氧气从而减少因4-氨基安替比林被氧化而产生的颜色反应,达到降低空白本底的效果。 MgSO4的硫酸根离子可以降低4-氨基安替比林被氧化的速度而减少因4-氨基安替比林被氧化而产生的颜色反应,从而降低空白本底。
含有MgSO4及过氧化氢酶与不含有MgSO4及过氧化氢酶的对比试验数据结果:
本发明试剂中一定比例的明胶可以减缓有机试剂对酶的失活作用。甘油及甜菜碱起到抑制酶分子间聚集的作用,维持酶分子的二级结构,增强酶的稳定性。海藻糖即可通过氢键与酶表面分子结合,稳定酶活性,也可抑制酶分子间聚集,有效阻止酶分子变性失活。聚乙二醇具有疏水亲水的双重特性,可以提高酶的稳定性。酶分子易受到蛋白水解酶的影响,一旦条件适宜,就会发生水解反应,EDTA可避免水解现象,维持酶分子的活性。
本发明的用于高密度脂蛋白胆固醇测定试剂的稳定剂,可以显著延长高密度脂蛋白胆固醇测定试剂的有效期至2年,开瓶稳定性达到3个月,且明显降低空白吸光度值,试剂操作简单,结果准确,稳定性好,实验采用奥林巴斯AU400全自动生化仪进行,但本发明的试剂不限于上述仪器,还适用于其他半自动或全自动生化分析仪。
聚氧乙烯亚烷基三苄基苯基醚是一种表面活性剂,与测定胆固醇的酶试剂反应,可使高密度中的胆固醇优先反应,并随后测定胆固醇的量。该方法可以无需预处理,如离心和电泳,能够以有效、简单的方式进行定量测定,并可以应用于各种自动分析仪上。
现有的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂的成分有胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化氢酶、曲拉通X-100、4-氨基安替比林、缓冲液,没有稳定剂,所以开瓶稳定性仅一个月,开瓶效期仅一年。
Claims (3)
1.一种用于低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的稳定剂,其特征在于该稳定剂由明胶 、MgSO4 、甘油 、甜菜碱、海藻糖 、聚乙二醇、EDTA 组成,其重量组分为:明胶 1~10ml/L,MgSO4 0.1~5g/L,甘油 1~15ml/L,甜菜碱0.1~1mol/L,海藻糖 0.1g/L~20 g/L,聚乙二醇 0.5~2g/L,EDTA 0.5~2.0g/L,所述的用于低密度脂蛋白胆固醇检测试剂,由试剂1和试剂2组成:
R1:PIPES-Na 80mmol/L,胆固醇酯酶 2KU/L,胆固醇氧化酶 2KU/L,过氧化氢酶200LU/L,4-氨基安替比林 200mmol/L,三甲基-β-环糊精 5g/L,环氧乙烷十八烷胺 3g/L,亚铁氰化钾 50μmol/L,氯化钠 25ml/L,Proclin300 0.05%;
R2: PIPES-Na 80mmol/L,过氧化物酶 2KU/L,氯化钠 0.9g/L,BSA 1.5g/L,叠氮钠2.0g/L,TritonX-100 18g/L。
2.根据权利要求1所述的一种用于低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的稳定剂,其特征在于所述的稳定剂的使用量在试剂中的体积为5 ml/L。
3.根据权利要求1所述的一种用于低密度脂蛋白胆固醇测定试剂的稳定剂,其特征在于所述的稳定剂的PH为6.8-7.0。
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