CN106086158A - 一种测定α‑羟丁酸脱氢酶的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种测定α‑羟丁酸脱氢酶的试剂盒及其制备方法 Download PDF

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蔡晓辉
庄庆华
吴铮
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    • G01N2333/904—Oxidoreductases (1.) acting on CHOH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)

Abstract

本发明公开了一种测定α‑羟丁酸脱氢酶的试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：试剂R1：缓冲液 1~350mmol/L、α‑酮丁酸 0.01~10mmol/L、乙二胺四乙酸二钠0.1~2g/L、稳定剂0.01~0.40g/L，其溶剂为纯化水，试剂R2：缓冲液 1~350mmol/L、NADH 0.1~4.0mmol/L、稳定剂0.01~0.40g/L，其溶剂为纯化水，制备方法为：按照下列组分含量配制好试剂；将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的α‑羟丁酸脱氢酶的浓度。本发明具有准确度高、精密度好等优点。

Description

一种测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒及其制备方法。
背景技术
α-羟丁酸脱氢酶（α-HBDH）不是一个独立的特异酶，而是含有H亚基的乳酸脱氢酶同工酶LDH1和LDH2的总称。测定α-羟丁酸脱氢酶，其实际反应的是乳酸脱氢酶同工酶LDH1和LDH2的活性，对诊断心肌疾病和肝病有重要意义。α-HBDH的活性与LDH的活性变化一致，但更能反映LDH1的活性变化，其特异性比总LDH活性高。与LDH、AST、CK、CK-MB构成心肌酶谱，对诊断心肌梗死更有意义。
α-羟丁酸脱氢酶目前的检测方法有很多，目前，国内很多医疗机构所使用的α-羟丁酸脱氢酶试剂盒多采用速率法测定，但由于酶本身的限制以及辅助的环境条件，例如，是否选择了合适的缓冲液、稳定剂、最适pH等条件,使得α-羟丁酸脱氢酶的测定质量存在很大的折扣，因此稳定性以及测定的准确度均不是很好。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的α-羟丁酸脱氢酶测定结果不准确的缺陷，而提供一种测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒及其制备方法。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 1~350mmol/L
α-酮丁酸 0.01~10mmol/L
乙二胺四乙酸二钠 0.1~2g/L
稳定剂 0.01~0.40g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
缓冲液 1~350mmol/L
NADH 0.1~4.0mmol/L
稳定剂 0.01~0.40g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，本发明公开了一种测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 180mmol/L
α-酮丁酸 5mmol/L
乙二胺四乙酸二钠 1.0g/L
稳定剂 0.20g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
缓冲液 180mmol/L
NADH 2.0mmol/L
稳定剂 0.20g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，所述的试剂R1中，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、1，4-哌嗪二乙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、3-（N-吗啉基）-2-羟丙基磺酸缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、磷酸二氢钠缓冲液中的一种或两种以上任意比例的混合。
作为优选，所述的试剂R2中，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、1，4-哌嗪二乙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、3-（N-吗啉基）-2-羟丙基磺酸缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、磷酸二氢钠缓冲液中的一种或两种以上任意比例的混合。
作为优选，所述的试剂R1中，所述的稳定剂采用叠氮钠。
作为优选，所述的试剂R2中，所述的稳定剂采用叠氮钠。
作为优选，所述的试剂R1中，所述的缓冲液的pH值为6～8。
作为优选，所述的试剂R2中，所述的缓冲液的pH值为6～8。
作为优选，本发明还公开了上述测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒的制备方法和使用方法，包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
缓冲液 1~350mmol/L
α-酮丁酸 0.01~10mmol/L
乙二胺四乙酸二钠 0.1~2g/L
稳定剂 0.01~0.40g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
缓冲液 1~350mmol/L
NADH 0.1~4.0mmol/L
稳定剂 0.01~0.40g/L
其溶剂为纯化水。
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的α-羟丁酸脱氢酶的浓度。
本发明的检测原理是：α-羟丁酸脱氢酶催化α-酮丁酸转化成α-羟基丁酸，同时使烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化城NAD+，在340nm处NADH吸光度的下降速率与HBDH活性成正比。
样本中α-HBDH活性
式中：ΔAU/min 待测样品平均每分钟的吸光度变化值
ΔAB/min 校准液平均每分钟的吸光度变化值
CS 校准液中α-HBDH的浓度
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：
本发明所述的测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒通过添加稳定剂，使得酶的稳定性得以提升，从而提高了整个试剂盒的稳定性，整个试剂盒的稳定性的提高也就有效的提高了试剂的准确度、线性以及精密度。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
三羟甲基氨基甲烷缓冲液 180mmol/L
α-酮丁酸 5mmol/L
乙二胺四乙酸二钠 1.0g/L
叠氮钠 0.20g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
三羟甲基氨基甲烷缓冲液 180mmol/L
NADH 2.0mmol/L
叠氮钠 0.20g/L
其溶剂为纯化水。
实施例2
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
3-吗啉丙磺酸缓冲液 350mmol/L
α-酮丁酸 10mmol/L
乙二胺四乙酸二钠 2g/L
叠氮钠 0.01g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
3-吗啉丙磺酸缓冲液 350mmol/L
NADH 4.0mmol/L
叠氮钠 0.01g/L
其溶剂为纯化水。
实施例3
试剂盒的制备和使用方法
1、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
三羟甲基氨基甲烷缓冲液 180mmol/L
α-酮丁酸 5mmol/L
乙二胺四乙酸二钠 1.0g/L
叠氮钠 0.20g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
三羟甲基氨基甲烷缓冲液 180mmol/L
NADH 2.0mmol/L
叠氮钠 0.20g/L
其溶剂为纯化水。
2、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长340nm、副波长405nm；
（c）反应时间 ：8min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度 A1，3min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：负反应。
3、检测步骤
（a） 取200μl试剂R1与7μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入50μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，3min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1 ；
(d)
根据α-HBDH活性
计算出样本中的α-羟丁酸脱氢酶的浓度。
实施例4
试剂盒的制备和使用方法
1、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
3-吗啉丙磺酸缓冲液 350mmol/L
α-酮丁酸 10mmol/L
乙二胺四乙酸二钠 2g/L
叠氮钠 0.01g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
3-吗啉丙磺酸缓冲液 350mmol/L
NADH 4.0mmol/L
叠氮钠 0.01g/L
其溶剂为纯化水。
2、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长340nm、副波长405nm；
（c）反应时间 ：8min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度 A1，3min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：负反应。
3、检测步骤
（a） 取200μl试剂R1与7μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入50μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，3min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1 ；
(d)
根据α-HBDH活性
计算出样本中的α-羟丁酸脱氢酶的浓度。
表1为实施例1所制得的测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒以及实施例2所制得的测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的α-羟丁酸脱氢酶的浓度为272U/L，测定结果见表1：
表1
第1次（U/L） 第2次（U/L） 第3次（U/L） 均值（U/L） 偏差（%）
实施例1 275 268 266 268.67 0.86%
实施例2 272 265 267 268 1.47%
由表1可知，本发明所制得的测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表2为实施例1所制得的测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒以及实施例2所制得的测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的α-羟丁酸脱氢酶的浓度为466U/L，测定结果见表2：
表2
第1次（U/L） 第2次（U/L） 第3次（U/L） 均值（U/L） 偏差（%）
实施例1 461 473 451 461.67 0.92%
实施例2 460 472 450 460.67 1.14%
由表2可知，本发明所制得的测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表3为实施例3所制得的测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定以及实施例4所制得的测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下：
表3
由表3可知本发明所制得的测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒的精密度比较好，而且由表3可知，实施例3为最优的选择。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 1~350mmol/L
α-酮丁酸 0.01~10mmol/L
乙二胺四乙酸二钠 0.1~2g/L
稳定剂 0.01~0.40g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 1~350mmol/L
NADH 0.1~4.0mmol/L
稳定剂 0.01~0.40g/L
其溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 180mmol/L
α-酮丁酸 5mmol/L
乙二胺四乙酸二钠 1.0g/L
稳定剂 0.20g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 180mmol/L
NADH 2.0mmol/L
稳定剂 0.20g/L
其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1或2所述的一种测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1中，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、1，4-哌嗪二乙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、3-（N-吗啉基）-2-羟丙基磺酸缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、磷酸二氢钠缓冲液中的一种或两种以上任意比例的混合。
4.根据权利要求1或2所述的一种测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R2中，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、1，4-哌嗪二乙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪丙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、3-（N-吗啉基）-2-羟丙基磺酸缓冲液、2-吗啉乙磺酸缓冲液、磷酸二氢钠缓冲液中的一种或两种以上任意比例的混合。
5.根据权利要求1或2所述的一种测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1中，所述的稳定剂采用叠氮钠。
6.根据权利要求1或2所述的一种测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R2中，所述的稳定剂采用叠氮钠。
7.根据权利要求1或2所述的一种测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1中，所述的缓冲液的pH值为6～8。
8.根据权利要求1或2所述的一种测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R2中，所述的缓冲液的pH值为6～8。
9.根据权利要求1或2所述的一种测定α-羟丁酸脱氢酶的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
缓冲液 1~350mmol/L
α-酮丁酸 0.01~10mmol/L
乙二胺四乙酸二钠 0.1~2g/L
稳定剂 0.01~0.40g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
缓冲液 1~350mmol/L
NADH 0.1~4.0mmol/L
稳定剂 0.01~0.40g/L
其溶剂为纯化水
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的α-羟丁酸脱氢酶的浓度。
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