CN106092923A - 一种测定总胆汁酸的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定总胆汁酸的试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒：试剂R1：Good’s缓冲液、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、曲拉通X‑100、EDTA、丁基羟基茴香醚、叠氮钠，试剂R2：Good’s缓冲液、3‑α羟基类固醇脱氢酶、还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、丁基羟基茴香醚、叠氮钠。制备方法为：按照组分含量配制好试剂；将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的总胆汁酸的浓度。本发明具有准确度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定总胆汁酸的试剂盒及其制备方法。
背景技术
胆汁酸是胆汁的重要成分，在脂肪代谢中起着重要作用,胆汁酸主要存在于肠肝循环系统并通过再循环起一定的保护作用,只有一少部分胆汁酸进入外围循环,促进胆汁酸肠肝循环的动力是肝细胞的转运系统，吸收胆汁酸并将其分泌入胆汁、缩胆囊素诱导的胆囊收缩、小肠的推进蠕动，回肠黏膜的主动运输及血液向门静脉的流入。
胆汁酸有助于脂肪的乳化，增强胰腺的脂解作用，并通过形成混合胶粒提高脂类的溶解度，促进肠道对脂类物质的吸收,胆汁酸对脂肪吸收的重要作用由脂肪痢以及引起肠道胆汁盐浓度降低的症状如胆汁阴塞、肝硬化以及服用胆汁酸结合药物等得以证实。
胆汁酸为胆固醇代谢提供了一条重要的排泄途径,三分之一的胆固醇的分解代谢是通过胆汁酸合成实现的,吸收的胆汁酸对胆汁酸自身合成起负反馈调节作用，因而也对胆固醇的分解起负反馈调节作用,胆汁酸可促进胆汁中胆固醇的分泌，对保持胆固醇的溶解性具有重要作用；胆汁酸可为肠道胆固醇的吸收所必须,肝脏中胆固醇合成的调节与胆汁酸的肠肝循环密切相关,胆汁酸可调节肠道胆固醇的合成。
目前检测胆汁酸的方法主要为酶循环法，但此法随着检测时间的增长，试剂的稳定性逐渐下降,测定的准确度也就变差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术稳定性差、测定准确度低的缺陷，而提供一种测定总胆汁酸的试剂盒及其制备方法。
本发明公开了一种测定总胆汁酸的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Good’s缓冲液 50~130 mmol/L
氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 1.0~3.0 KU/L
曲拉通X-100 0.5~3.5 mL/L
EDTA 30~50 mmol/L
丁基羟基茴香醚 0.5~3.0 g/L
叠氮钠 0.2~1.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Good’s缓冲液 60~150 mmol/L
3-α羟基类固醇脱氢酶 1.0~4.0 KU/L
还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.5~5.0 KU/L
丁基羟基茴香醚 0.5~3.0 g/L
叠氮钠 0.2~1.4 g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，本发明公开了一种测定总胆汁酸的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Good’s缓冲液 90 mmol/L
氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 2.0 KU/L
曲拉通X-100 2 mL/L
EDTA 40 mmol/L
丁基羟基茴香醚 1.5 g/L
叠氮钠 0.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Good’s缓冲液 100 mmol/L
3-α羟基类固醇脱氢酶 2.5 KU/L
还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 3 KU/L
丁基羟基茴香醚 1.7 g/L
叠氮钠 0.8g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，本发明还公开了上述测定总胆汁酸的试剂盒的制备方法和使用方法，包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
Good’s缓冲液 50~130 mmol/L
氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 1.0~3.0 KU/L
曲拉通X-100 0.5~3.5 mL/L
EDTA 30~50 mmol/L
丁基羟基茴香醚 0.5~3.0 g/L
叠氮钠 0.2~1.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Good’s缓冲液 60~150 mmol/L
3-α羟基类固醇脱氢酶 1.0~4.0 KU/L
还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.5~5.0 KU/L
丁基羟基茴香醚 0.5~3.0 g/L
叠氮钠 0.2~1.4 g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的总胆汁酸的浓度。
作为优选，步骤（b）中，所述的试剂R1与试剂R2的体积比为3:1。
作为优选，步骤（b）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:5到1:100之间。
本发明的检测原理是：样本中的胆汁酸在3α-羟基类固醇脱氢酶及Thio-NAD+（二核苷酸氧化型）的作用下，特异性地氧化，生成3-酮类固醇及Thio-NADH（二核苷酸还原型），此外，生成的3-酮类固醇在3α-羟基类固醇脱氢酶及还原性辅酶Ⅰ存在下，生成胆汁酸和NAD+，如此循环往复从而放大微量的胆汁酸量，在405nm处测定生成的Thio-NADH的吸光度变化，求得胆汁酸量。
样本中总胆汁酸（TBA）的活性（umol/L）= CS ×（umol/L）
式中：ΔAU/min 待测样品平均每分钟的吸光度变化值
ΔAB/min 校准液平均每分钟的吸光度变化值
CS 校准液中TBA的浓度
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：
本发明在酶循环法的基础上添加了丁基羟基茴香醚作为抗氧化剂，叠氮钠作为防腐剂，使得酶的稳定性大大提升，保存时间更长，检测结果更准确。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中：
试剂R1：
Good’s缓冲液 90 mmol/L
氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 2.0 KU/L
曲拉通X-100 2 mL/L
EDTA 40 mmol/L
丁基羟基茴香醚 1.5 g/L
叠氮钠 0.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Good’s缓冲液 100 mmol/L
3-α羟基类固醇脱氢酶 2.5 KU/L
还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 3 KU/L
丁基羟基茴香醚 1.7 g/L
叠氮钠 0.8g/L
其溶剂为纯化水。
实施例2
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中：
试剂R1：
Good’s缓冲液 50 mmol/L
氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 3.0 KU/L
曲拉通X-100 0.5 mL/L
EDTA 50 mmol/L
丁基羟基茴香醚 0.5 g/L
叠氮钠 1.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Good’s缓冲液 60mmol/L
3-α羟基类固醇脱氢酶 4.0 KU/L
还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.5 KU/L
丁基羟基茴香醚 3.0 g/L
叠氮钠 0.2 g/L
其溶剂为纯化水。
实施例3
试剂盒的制备和使用方法
1、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
Good’s缓冲液 90 mmol/L
氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 2.0 KU/L
曲拉通X-100 2 mL/L
EDTA 40 mmol/L
丁基羟基茴香醚 1.5 g/L
叠氮钠 0.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Good’s缓冲液 100 mmol/L
3-α羟基类固醇脱氢酶 2.5 KU/L
还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 3 KU/L
丁基羟基茴香醚 1.7 g/L
叠氮钠 0.8g/L
其溶剂为纯化水；
2、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长340nm、副波长405nm；
（c）反应时间 ：8min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度 A1，3min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：负方向；
3、检测步骤
（a） 取225μl试剂R1与3μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入75μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，3min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 根据样本中总胆汁酸（TBA）的活性（umol/L）= CS × （umol/L）计算出样本中的总胆汁酸的浓度。
实施例4
试剂盒的制备和使用方法
1、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
Good’s缓冲液 50 mmol/L
氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 3.0 KU/L
曲拉通X-100 0.5 mL/L
EDTA 50 mmol/L
丁基羟基茴香醚 0.5 g/L
叠氮钠 1.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Good’s缓冲液 60mmol/L
3-α羟基类固醇脱氢酶 4.0 KU/L
还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.5 KU/L
丁基羟基茴香醚 3.0 g/L
叠氮钠 0.2 g/L
其溶剂为纯化水；
2、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长340nm、副波长405nm；
（c）反应时间 ：8min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度 A1，3min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：负方向；
3、检测步骤
（a） 取225μl试剂R1与3μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入75μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，3min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 根据样本中总胆汁酸（TBA）的活性（umol/L）= CS × （umol/L）计算出样本中的总胆汁酸的浓度。
表1为实施例1所制得的测定总胆汁酸的试剂盒以及实施例2所制得的测定总胆汁酸的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的总胆汁酸的浓度为 24.9umol/L，测定结果见表1：
表1
| 第1次（umol/L） | 第2次（umol/L） | 第3次（umol/L） | 均值（umol/L） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 24.8 | 25.1 | 24.7 | 24.8 | 0.40 |
| 实施例2 | 24.9 | 24.6 | 24.6 | 24.7 | 0.80 |
由表1可知，本发明所制得的测定总胆汁酸的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表2为实施例1所制得的测定总胆汁酸的试剂盒以及实施例2所制得的测定总胆汁酸的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的总胆汁酸的浓度为 51.7 umol/L，测定结果见表2：
表2
| 第1次（umol/L） | 第2次（umol/L） | 第3次（umol/L） | 均值（umol/L） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 50.9 | 52.2 | 51.6 | 51.57 | 0.25 |
| 实施例2 | 51.9 | 52.4 | 52.5 | 52.27 | 1.10 |
由表2可知，本发明所制得的测定总胆汁酸的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表3为实施例3所制得的测定总胆汁酸的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定以及实施例4所制得的测定总胆汁酸的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下：
表3
由表3可知本发明所制得的测定总胆汁酸的试剂盒的精密度比较好，而且由表3可知，实施例3为最优的选择。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (5)
1.一种测定总胆汁酸的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Good’s缓冲液 50~130 mmol/L
氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 1.0~3.0 KU/L
曲拉通X-100 0.5~3.5 mL/L
EDTA 30~50 mmol/L
丁基羟基茴香醚 0.5~3.0 g/L
叠氮钠 0.2~1.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Good’s缓冲液 60~150 mmol/L
3-α羟基类固醇脱氢酶 1.0~4.0 KU/L
还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.5~5.0 KU/L
丁基羟基茴香醚 0.5~3.0 g/L
叠氮钠 0.2~1.4 g/L
其溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种测定总胆汁酸的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分组成试剂盒，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Good’s缓冲液 90 mmol/L
氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 2.0 KU/L
曲拉通X-100 2 mL/L
EDTA 40 mmol/L
丁基羟基茴香醚 1.5 g/L
叠氮钠 0.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Good’s缓冲液 100 mmol/L
3-α羟基类固醇脱氢酶 2.5 KU/L
还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 3 KU/L
丁基羟基茴香醚 1.7 g/L
叠氮钠 0.8g/L
其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1所述的一种测定总胆汁酸的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
Good’s缓冲液 50~130 mmol/L
氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 1.0~3.0 KU/L
曲拉通X-100 0.5~3.5 mL/L
EDTA 30~50 mmol/L
丁基羟基茴香醚 0.5~3.0 g/L
叠氮钠 0.2~1.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
Good’s缓冲液 60~150 mmol/L
3-α羟基类固醇脱氢酶 1.0~4.0 KU/L
还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 0.5~5.0 KU/L
丁基羟基茴香醚 0.5~3.0 g/L
叠氮钠 0.2~1.4 g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的总胆汁酸的浓度。
4.根据权利要求1所述的一种测定总胆汁酸的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中，所述的试剂R1与试剂R2的体积比为3:1。
5.根据权利要求1所述的一种测定总胆汁酸的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：步骤（b）中，所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:5到1:100之间。
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