CN112881370B - 一种甘胆酸的测定试剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种甘胆酸的测定试剂及其制备方法，涉及生化手段测试技术领域，该测定试剂包括R1试剂、R2试剂和甘胆酸标准样；所述R1试剂包括：硫代氧化型辅酶I、缓冲液和羟基乙叉二膦酸；所述R2试剂包括：还原型辅酶I、缓冲液、甘胆酸脱氢酶、叠氮钠、乙醇、卵磷脂和丁基羟基茴香醚；所述甘胆酸标准样包括：甘胆酸钠水合物、缓冲液和叠氮钠。该测定试剂制备方法简单，在测定甘胆酸时，具有准确度、稳定性高，线性范围广且重复性好的特点。

Description

一种甘胆酸的测定试剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及生化手段测试技术领域，具体涉及一种脑神经营养治疗的中长链结构脂质组合制备方法。

背景技术

血清甘胆酸(Cholyglycine,CG)是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸之一，在肝细胞内，胆固醇经过极其复杂的酶促反应，转变成初级胆汁酸。其中有胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CD-CA)。胆酸的类固醇核上有三个羟基(C3、C7、C12)，侧链末端的羟基以肽键与甘氨酸结合，分子量为462u。CG在肝细胞合成，经胆管排入胆囊贮存，餐后胆囊收缩，随同胆汁排入小肠，参与脂肪的消化吸收，95％的胆酸由小肠粘膜重吸收入血，经门静脉输送至肝脏由肝细胞摄取。正常情况下，肝脏能有效摄取门静脉血中99％以上的CG重新泌入胆汁，仅有1％CG溢入体循环。当肝细胞受损时，肝细胞不能有效摄取经肠肝循环达肝脏的CG，致使血中CG含量增高；胆汁淤滞时，肝脏排泄胆酸发生障碍而返流入血循环中，也可使血中CG含量增高。

目前，国内测定甘胆酸的方法主要有：(1)乳胶增强免疫比浊法，该方法灵敏度较低，易出现前带现象；(2)化学发光法，该方法虽然灵敏度高，但不稳定，重复性较差以及(3)酶联免疫法，该方法定量准确性差，操作时间长，自动化程度低，一般只用于定性检测。中国专利CN105588936A公开了一种甘胆酸的测定试剂及其制备方法，该试剂包括R1试剂、R2试剂和甘胆酸标准样，R1试剂是由硫代氧化型辅酶溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液；R2试剂是由还原型辅酶溶解于添加有缓冲液、甘胆酸脱氢酶、叠氮钠的纯化水中所形成的溶液；甘胆酸标准样是由甘胆酸钠水合物、缓冲液和叠氮钠溶解于纯化水中形成的溶液。将上述试剂用于甘胆酸测定，具有快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好等优点。中国专利CN102539791A公开了一种总胆汁酸的定量测定及测定试剂盒，其中，提供了一种以酶学方法定量测定人血清样品中总胆汁酸含量的试剂，该试剂由分别放置的溶液型试剂1和试剂2两部分组成，其中，所述试剂1中含有氧化型β-硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，缓冲剂和稳定剂；试剂2中含有还原型辅酶I和羟类固醇脱氢酶以及稳定剂和缓冲剂，具有灵敏度高、成本低、操作简便快速、易于推广的优点。但上述专利中的试剂对于甘胆酸的检测试剂在测定时均存在准确度低以及重复性、稳定性差的问题。

针对现有技术中甘胆酸测定存在的检测试剂在测定时均存在的准确度低以及重复性、稳定性差等问题，亟需寻找一种准确度、稳定性高，线性范围广且重复性好的测定试剂，。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种甘胆酸的测定试剂及其制备方法，该测定试剂准确度、稳定性高，线性范围广且重复性好。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种甘胆酸的测定试剂，包括R1试剂、R2试剂和甘胆酸标准样；

所述R1试剂包括：硫代氧化型辅酶I、缓冲液和羟基乙叉二膦酸；

所述R2试剂包括：还原型辅酶I、缓冲液、甘胆酸脱氢酶、叠氮钠、乙醇、卵磷脂和丁基羟基茴香醚；

所述甘胆酸标准样包括：甘胆酸钠水合物、缓冲液和叠氮钠。

进一步地，所述R1试剂包括：1-1.5g/L硫代氧化型辅酶I、0.5-0.8mmol/L缓冲液和3-6g/L羟基乙叉二膦酸。

优选地，所述R1试剂包括：1.2g/L硫代氧化型辅酶I、0.65mmol/L缓冲液和5g/L羟基乙叉二膦酸。

进一步地，所述R2试剂包括：6-7g/L还原型辅酶I、0.5-0.8mmol/L缓冲液、5000-8000U/L甘胆酸脱氢酶、0.5-0.7mmol/L叠氮钠、10-15mL/L乙醇、0.08-0.12g/L卵磷脂和0.05-0.15g/L丁基羟基茴香醚。

优选地，所述R2试剂包括：6.5g/L还原型辅酶I、0.65mmol/L缓冲液、5000U/L甘胆酸脱氢酶、0.65mmol/L叠氮钠、12mL/L乙醇、0.1g/L卵磷脂和0.1g/L丁基羟基茴香醚。

进一步地，所述甘胆酸标准样包括：6-9g/L甘胆酸钠水合物、0.5-0.8mmol/L缓冲液和0.5-0.7mmol/叠氮钠。

优选地，所述甘胆酸标准样包括：8g/L甘胆酸钠水合物、0.6mmol/L缓冲液和0.6mmol/L叠氮钠。

进一步地，R1试剂中所述的羟基乙叉二膦酸、R2试剂中所述的卵磷脂与R2试剂中所述的丁基羟基茴香醚的重量比为3-6:0.08-0.12:0.05-0.15。优选为5:0.1:0.1。

进一步地，R1试剂中所述缓冲液和羟基乙叉二膦酸的用量比为0.5-0.8mmol:3-6g。优选为0.65mmol:5g。

进一步地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液和/或三羟甲基氨基甲烷。

进一步地，所述R1试剂、R2试剂盒甘胆酸标准样的体积比为200:50:6。

进一步地，所述硫代氧化型辅酶I为β-硫代烟酰胺脲嘌呤二核苷酸氧化型；所述还原型辅酶I为β-烟酰胺脲嘌呤二核苷酸还原型。

本发明还提供了上述测定试剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)R1试剂配制：向纯水中加入缓冲液，搅拌至溶解后，依次加入羟基乙叉二膦酸以及硫代氧化型辅酶I，搅拌至溶解后，定容，得到R1试剂；

(2)R2试剂配制：向纯水中加入缓冲液，搅拌至溶解后，依次加入甘胆酸脱氢酶、叠氮钠、溶解于乙醇中的卵磷脂、丁基羟基茴香醚和还原型辅酶I，搅拌至溶解后，定容，得到R2试剂；

(3)甘胆酸标准样配制：向纯水中加入甘胆酸钠水合物，搅拌至溶解后，依次加入缓冲液和叠氮钠，搅拌至溶解后定容，得到甘胆酸标准样。

本发明所取得的技术效果是：

本发明甘胆酸标准样中的甘胆酸被甘胆酸脱氢酶(GCDH)及β-硫代烟酰胺脲嘌呤二核苷酸氧化型(Thio-NAD)特异性地氧化，生成类固醇以及β-硫代烟酰胺脲嘌呤二核苷酸还原Thio-NADH；而生成的类固醇在GCDH和β-烟酰胺脲嘌呤二核苷酸还原型(NADH)作用下，又生成甘胆酸及β-烟酰胺脲嘌呤二核苷酸氧化型(NAD)。通过上述的循环，血清中微量的胆汁酸量得到了放大，Thio-NADH也同比的扩增，于是通过测定Thio-NADH在405nm特异性的吸光度变化，即可计算得到标本中甘胆酸的含量。本发明中的测定试剂通过设置R1试剂以及R2试剂，在原有研究的基础上，对R1试剂盒R2试剂的具体组分以及含量进行调整，在R1试剂中额外加入羟基乙叉二膦酸，同时在R2试剂中加入乙醇、卵磷脂和丁基羟基茴香醚，结果发现上述组分的加入在特定的添加量范围内能够对试剂盒的检测性能产生积极的促进影响，但同时，当上述成分用量超出某范围值时，则反而可能会产生相反的效果。本发明中试剂盒中的各组分之间协同能够促进试剂盒的准确度的提高，此外，试剂盒的热稳定性以及开瓶稳定性也产生了积极反馈。

具体实施方式

值得说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，因此对其来源不做具体限定。

实施例1

一种甘胆酸的测定试剂，包括R1试剂、R2试剂和甘胆酸标准样；

其中，R1试剂包括：1g/L硫代氧化型辅酶I、0.5mmol/L缓冲液和3g/L羟基乙叉二膦酸；R2试剂包括：6g/L还原型辅酶I、0.5mmol/L缓冲液、5000U/L甘胆酸脱氢酶、0.5mmol/L叠氮钠、10mL/L乙醇、0.08g/L卵磷脂和0.05g/L丁基羟基茴香醚；甘胆酸标准样包括：甘胆酸标准样包括：6g/L甘胆酸钠水合物、0.5mmol/L缓冲液和0.5mmol/叠氮钠。R1试剂、R2试剂盒甘胆酸标准样的使用量分别为200μL、50μL和6μL。

硫代氧化型辅酶I为β-硫代烟酰胺脲嘌呤二核苷酸氧化型，还原型辅酶I为β-烟酰胺脲嘌呤二核苷酸还原型，缓冲液为磷酸盐缓冲液。

制备方法包括以下步骤：

(1)R1试剂配制：向纯水中加入缓冲液，搅拌至溶解后，依次加入羟基乙叉二膦酸以及硫代氧化型辅酶I，搅拌至溶解后，定容，得到R1试剂；

(2)R2试剂配制：向纯水中加入缓冲液，搅拌至溶解后，依次加入甘胆酸脱氢酶、叠氮钠、溶解于乙醇中的卵磷脂、丁基羟基茴香醚和还原型辅酶I，搅拌至溶解后，定容，得到R2试剂；

(3)甘胆酸标准样配制：向纯水中加入甘胆酸钠水合物，搅拌至溶解后，依次加入缓冲液和叠氮钠，搅拌至溶解后定容，得到甘胆酸标准样。

实施例2

一种甘胆酸的测定试剂，包括R1试剂、R2试剂和甘胆酸标准样；

其中，R1试剂包括：1.5g/L硫代氧化型辅酶I、0.8mmol/L缓冲液和6g/L羟基乙叉二膦酸；R2试剂包括：7g/L还原型辅酶I、0.8mmol/L缓冲液、8000U/L甘胆酸脱氢酶、0.7mmol/L叠氮钠、15mL/L乙醇、0.12g/L卵磷脂和0.15g/L丁基羟基茴香醚；甘胆酸标准样包括：甘胆酸标准样包括：9g/L甘胆酸钠水合物、0.8mmol/L缓冲液和0.7mmol/叠氮钠。R1试剂、R2试剂盒甘胆酸标准样的使用量分别为200μL、50μL和6μL。

硫代氧化型辅酶I为β-硫代烟酰胺脲嘌呤二核苷酸氧化型，还原型辅酶I为β-烟酰胺脲嘌呤二核苷酸还原型，缓冲液为三羟甲基氨基甲烷。

制备方法同实施例1。

实施例3

一种甘胆酸的测定试剂，包括R1试剂、R2试剂和甘胆酸标准样；

其中，R1试剂包括：1.2g/L硫代氧化型辅酶I、0.65mmol/L缓冲液和5g/L羟基乙叉二膦酸；R2试剂包括：6.5g/L还原型辅酶I、0.65mmol/L缓冲液、5000U/L甘胆酸脱氢酶、0.65mmol/L叠氮钠、12mL/L乙醇、0.1g/L卵磷脂和0.1g/L丁基羟基茴香醚；甘胆酸标准样包括：甘胆酸标准样包括：8g/L甘胆酸钠水合物、0.6mmol/L缓冲液和0.6mmol/L叠氮钠。R1试剂、R2试剂盒甘胆酸标准样的使用量分别为200μL、50μL和6μL。

硫代氧化型辅酶I为β-硫代烟酰胺脲嘌呤二核苷酸氧化型，还原型辅酶I为β-烟酰胺脲嘌呤二核苷酸还原型，缓冲液为磷酸盐缓冲液。

制备方法同实施例1。

对比例1

中国专利CN105588936A实施例中的试剂。

对比例2

与实施例1的区别仅在于，测定试剂包括R1试剂、R2试剂和甘胆酸标准样；

其中，R1试剂包括：0.8g/L硫代氧化型辅酶I、1mmol/L缓冲液和2.5g/L羟基乙叉二膦酸；R2试剂包括：5g/L还原型辅酶I、1mmol/L缓冲液、4000U/L甘胆酸脱氢酶、0.8mmol/L叠氮钠、8mL/L乙醇、0.15g/L卵磷脂和0.04g/L丁基羟基茴香醚；甘胆酸标准样包括：甘胆酸标准样包括：5g/L甘胆酸钠水合物、1mmol/L缓冲液和0.4mmol/叠氮钠。

制备方法同实施例1。

对比例3

与实施例3的区别仅在于，R1试剂中所述的羟基乙叉二膦酸、R2试剂中所述的卵磷脂与R2试剂中所述的丁基羟基茴香醚的重量比为7:0.05:0.2(三者的总重量与实施例1一致)。

制备方法同实施例1。

对比例4

与实施例1的区别仅在于，R1试剂中所述缓冲液和羟基乙叉二膦酸的用量比为0.4mmol:7g(二者的总重量与实施例3一致)。

制备方法同实施例1。

本发明中的试剂为液体，可直接使用，测定方法如表1所示：

表1测定方法

测定条件如表2所示：

表2测定条件

计算公式：

样本要求：

1.新鲜血清。

2.血清分离后2-8℃保存可稳定三天。

3.血清胆红素≤400umol/L、甘油三酯≤14mmol/L、血红蛋白≤500mg/dL、葡萄糖≤11.1mmol/L测定结果没有影响。

比对试剂主要组成成分为：

R1：GOOD缓冲液50mmol/L、NAD+3.5mmol/L、葡萄糖6磷酸脱氢酶(G-6-P)2KU/L、抗甘胆酸多克隆抗体(兔多抗)1.0％；

R2：GOOD缓冲液50mmol/L、葡萄糖6磷酸脱氢酶-甘胆酸偶联物(G-6-P-CG偶联物)0.5％。

一、准确度实验

实施例1-3以及对比例1-4的试剂盒测定血清结果比对，取40份在检测浓度范围内不同浓度的人源血清样品，分别测定40个样本，每个样本测定一次。对两组检测结果进行相关性分析，计算相关系数r；以比对试剂检测结果作为靶值，分别计算40对数据的相对偏差(Bias％)。要求r不小于0.990，相对偏差不超过±10％；结果见表3。

表3实施例1-3试剂盒血清比对结果

根据表3可以得出，实施例1-3与比对试剂之间的相对偏差在-6.07～19.64％之间，表明实施例1-3血清结果相关性好，准确度高。进一步以相同的方式计算对比例1-4与比对试剂之间的相对偏差，结果发现该值在-35.34～42.86％之间，由此可知，对比例1-4的血清结果相关性差于各实施例。

二、重复性实验

将实施例1-3、对比例1-4以及比对试剂的试剂盒进行重复性检测。检测同一份质控品10次，计算平均值以及CV值；结果见表4和表5。

质控浓度1：靶值1.5mg/L；质控浓度2：靶值10.0mg/L。

表4实施例1-3的试剂盒重复性检测结果

表5对比例1-4试剂盒重复性检测结果

根据表4-5可以得出，实施例1-3重复性好。

三、线性范围

对实施例1-3以及对比例1-4的试剂盒进行线性范围检测；结果见表6。

将已知浓度的高浓度样本和低浓度样本按比例稀释(高浓度样本80mg/L，低浓度样本5mg/L)，每个样品测定三次，计算相关性系数以及相对偏差。

表6实施例1-3以及比对试剂的试剂盒进行线性范围结果

表7对比例1-4以及比对试剂的试剂盒进行线性范围结果

根据表6-7可以得出，线性范围：在线性范围0.5-80mg/L内，线性回归的相关系数r≥0.990，相对偏差不大于10％。实施例1-3线性范围广，相比较而言，对比例1-4的线性范围稍窄。

四、热稳定性

试验方法：将各实例中的试剂R1和R2置于恒温摇床内，在37℃转速100rpm条件下振荡，每天取出检测，监测靶值为10.5mg/L质控品的数值，重复检测三遍，记录并计算平均值，检测质控品数值的变化从而来反应试剂的稳定性，连续检测7天；检测结果统计至表8。

表8 37℃的热稳定性结果

从表8中可以得出，实施例1-3热稳定性比比对试剂好，比对试剂热稳定性7天时偏差已大于10％。同理，对比例中试剂的热稳定性也差于各实施例。

五、开瓶稳定性

试验方法：将各实例中的试剂R1和R2置于试剂仓内开瓶，在4℃条件下保存，每天检测，监测靶值为10.5mg/L质控品的数值，重复检测三遍，记录并计算平均值，检测质控品数值的变化从而来反应试剂的稳定性，连续检测7天；检测结果统计至表9。

表9 4℃稳定性结果

从表9中可以得出，实施例1-3以及比对试剂开瓶稳定性较好，在4℃条件下保存18天后仍有较好的检测能力。各对比例中的试剂检测能力则差强人意。

由以上实施例可以得出，采用本发明提供的试剂盒准确度好，线性范围广，重复性好，稳定性强，使用全自动或半自动生化仪能够得到检测甘胆酸的结果，缩短了检测时间，降低了操作难度，使CG检测更加普遍容易。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种甘胆酸的测定试剂，其特征在于：包括R1试剂、R2试剂和甘胆酸标准样；

所述R1试剂包括：1-1.5g/L硫代氧化型辅酶I、0.5-0.8mmol/L缓冲液和3-6g/L羟基乙叉二膦酸；

所述R2试剂包括：6-7g/L还原型辅酶I、0.5-0.8mmol/L缓冲液、5000-8000U/L甘胆酸脱氢酶、0.5-0.7mmol/L叠氮钠、10-15mL/L乙醇、0.08-0.12g/L卵磷脂和0.05-0.15g/L丁基羟基茴香醚；

所述甘胆酸标准样包括：甘胆酸钠水合物、缓冲液和叠氮钠；

R1试剂中所述的羟基乙叉二膦酸、R2试剂中所述的卵磷脂与R2试剂中所述的丁基羟基茴香醚的重量比为3-6:0.08-0.12:0.05-0.15；

R1试剂中所述缓冲液和羟基乙叉二膦酸的用量比为0.5-0.8mmol:3-6g。

2.根据权利要求1所述的测定试剂，其特征在于：所述甘胆酸标准样包括：6-9g/L甘胆酸钠水合物、0.5-0.8mmol/L缓冲液和0.5-0.7mmol/叠氮钠。

3.根据权利要求1所述的测定试剂，其特征在于：所述缓冲液为磷酸盐缓冲液和/或三羟甲基氨基甲烷。

4.根据权利要求1所述的测定试剂，其特征在于：所述硫代氧化型辅酶I为β-硫代烟酰胺脲嘌呤二核苷酸氧化型。

5.根据权利要求1所述的测定试剂，其特征在于：所述还原型辅酶I为β-烟酰胺脲嘌呤二核苷酸还原型。

6.如权利要求1-5任一项所述的测定试剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)R1试剂配制：向纯水中加入缓冲液，搅拌至溶解后，依次加入羟基乙叉二膦酸以及硫代氧化型辅酶I，搅拌至溶解后，定容，得到R1试剂；

(2)R2试剂配制：向纯水中加入缓冲液，搅拌至溶解后，依次加入甘胆酸脱氢酶、叠氮钠、溶解于乙醇中的卵磷脂、丁基羟基茴香醚和还原型辅酶I，搅拌至溶解后，定容，得到R2试剂；

(3)甘胆酸标准样配制：向纯水中加入甘胆酸钠水合物，搅拌至溶解后，依次加入缓冲液和叠氮钠，搅拌至溶解后定容，得到甘胆酸标准样。