CN111707817A - 一种肝胆酸测定试剂盒的制备及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明在于提供一种肝胆酸检测试剂盒的制备，将制备的抗体胶乳颗粒加入到试剂R2中，配制成独立包装的试剂R1和试剂R2，采用胶乳增强免疫比浊法检测血清样本中的肝胆酸，其检测快速、精准、准确度高、特异性强、精密度好、成本较低，且检测样本量少，可进行少量样本和急诊样本的测定。

Description

一种肝胆酸测定试剂盒的制备及检测方法
技术领域
本发明属于医药试剂技术领域。
背景技术
血清甘胆酸(Cholyglycine, CG) 是胆酸与甘氨酸结合而成的结合型胆酸之一，在肝细胞内，胆固醇经过及其复杂的酶促反应，转变成初级胆汁酸。其中有胆酸(CA)和鹅去氧胆酸（CD-CA）。胆酸的类固醇核上有三个羟基(C3、C7、C12），侧链末端的羟基以肽键与甘氨酸结合，分子量为462u。
CG正常代谢途径为肠—肝循环，CG由 肝细胞合成，经毛细胆管、胆管排入胆囊，随同胆汁进入十二指肠，帮助食物消化。95%胆酸在回肠末端重吸收，经门静脉再回肝脏，由肝细胞摄取再利用。在血清中主要以蛋白结合形式存在，溢入体循环的总量小于1 %。在正常情况下,外周血中胆酸含量甚微,正常成人无论空腹或餐后,其血清CG浓度稳定在低水平。
当肝细胞受损时，肝细胞摄取CG能力下降，致使血中CG含量增高；胆汁郁滞时，肝脏排泄胆酸发生障碍，而返流血液循环的CG含量增高，也使血CG含量增高。因此，用RIA（radioimmunoassay放射免疫测定法）法测定血清甘胆酸（CG）是评价肝细胞功能及其肝胆系物质循环功能的敏感指标之一。
现有技术中，肝胆酸的检测方法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)和免疫比浊法等。其中，酶联免疫吸附测定检测准确度高，但操作过程略显复杂、测定时间较长、影响因素多，且不适合急诊样本的检测；化学发光免疫分析法测定其自动化操作速度快，但是成本高、设备昂贵、稳定性较差，无法普及中基层医院及医疗机构；免疫比浊法测定，抗原或抗体量过大时，可出现可溶性复合物，造成误差，易受脂血影响。
发明内容
本发明在于提供一种肝胆酸检测试剂盒的制备，利用胶乳免疫比浊法，其检测快速、精准、准确度高、特异性强、精密度好、成本较低，且检测样本量少，可进行少量样本和急诊样本的测定。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明所述的肝胆酸检测试剂盒，其包含独立包装的试剂R1和试剂R2，所述的试剂R1包含以下浓度的组分：
缓冲液：50-200mmol/L；
离子溶液：5-20g/L；
表面活性剂：0.1-2g/L；
促凝剂：10-40g/L
防腐剂：0.5-2g/L；
所述的试剂R2包含以下浓度的组分：
缓冲液：50-200mmol/L；
抗体胶乳颗粒10-40mg/L；
稳定剂1-10g/L；
防腐剂：0.5-2g/L；
优选地，所述的试剂R1、试剂R2中的缓冲液是TRIS缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、氨基乙酸缓冲液中的一种或多种；
优选地，所述的试剂R1中的离子溶液是氯化钠溶液、氯化钾溶液、氯化镁溶液中的一种或多种；
优选地，所述的试剂R1中的表面活性剂是曲拉通X-100、曲拉通X-305、吐温-20、吐温-80、B66中的一种或多种；
优选地，所述的试剂R1中的促凝剂是聚乙二醇-6000、聚乙二醇-8000和聚乙二醇-20000中的一种或多种；
优选地，所述的试剂R1、试剂R2中的防腐剂是PC300、NaN3中的一种；
优选地，所述的试剂R2中的稳定剂是内牛清白蛋白、酪蛋白、蔗糖中的一种；
优选地，所述的试剂R2中的抗体胶乳颗粒制备步骤为：
准备：准备120-300nm的聚苯乙烯胶乳颗粒，胶乳颗粒用pH7.0的5mM/L 2-（N-吗啡啉）乙磺酸稀释至终浓度为1-3%w/v得到胶乳颗粒溶液；将肝胆酸羊多抗用pH7.0的5mM/L 2-（N-吗啡啉）乙磺酸稀释至终浓度为0.05-0.15%w/v得到抗体溶液；
偶联：将抗体溶液缓慢加入到胶乳颗粒溶液中，37℃ 220转/分钟偶联30分钟；再加入20mg/L的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC），37℃ 220转/分钟偶联60分钟，即得到抗体胶乳颗粒；
封闭：加入10%牛血清白蛋白溶液15mL，37℃ 220转/分钟封闭60分钟；
储存：加入试剂R2中的缓冲液50-200mmol/L，37℃ 220转/分钟60分钟。
其技术关键点在于制备抗体胶乳颗粒加入到试剂R2中，配制成独立包装的试剂R1和试剂R2，采用胶乳增强免疫比浊法检测血清样本中的肝胆酸，其检测快速、精准、准确度高、特异性强、精密度好、成本较低，且检测样本量少，可进行少量样本和急诊样本的测定。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1 制备肝胆酸检测试剂盒
根据本发明制备的肝胆酸检测试剂盒，其包含独立包装的试剂R1和试剂R2，所述的试剂R1包含以下浓度的组分：
氨基乙酸缓冲液：100mmol/L；
氯化钠：9g/L；
曲拉通X-100：0.5g/L；
PEG20000：20g/L
PC300：1g/L；
所述的试剂R2包含以下浓度的组分：
氨基乙酸缓冲液：100mmol/L；
抗体胶乳颗粒：35mg/L；
蔗糖：5g/L；
PC300：1g/L；
优选地，所述的试剂R2中的抗体胶乳颗粒制备步骤为：
准备：准备220nm的聚苯乙烯胶乳颗粒，胶乳颗粒用pH7.0的5mM/L 2-（N-吗啡啉）乙磺酸稀释至终浓度为1.5%w/v得到胶乳颗粒溶液；将肝胆酸羊多抗用pH7.0的5mM/L 2-（N-吗啡啉）乙磺酸稀释至终浓度为0.1%w/v得到抗体溶液；
偶联：将抗体溶液缓慢加入到胶乳颗粒溶液中，37℃ 220转/分钟偶联30分钟；再加入20mg/L的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC），37℃ 220转/分钟偶联60分钟；
封闭：加入10%牛血清白蛋白溶液15mL，37℃ 220转/分钟封闭60分钟；
储存：加入试剂R2中的氨基乙酸缓冲液100mmol/L，37℃ 220转/分钟60分钟，即得到抗体胶乳颗粒。
实施例2 本发明试剂盒准确度分析
测试试剂盒：实施例1的试剂盒、对比例的肝胆酸测定试剂盒（由北京九强生物技术股份有限公司生产）
测试仪器：日立7100全自动生化分析仪
具体操作为，设置参数：测试方法：两点终点法；主波长：600nm；测光点：18-34；样本量：6；试剂量R1：R2=150：50；校准方法：spline
标准曲线的设定：分别将已知浓度的标准品，即5、10、20、40、80mg/L放在校准盘里，设置校准品位置和浓度，得到以下数据：
表1（实施例1）
Figure 383328DEST_PATH_IMAGE002
表2（对比例）
Figure 300468DEST_PATH_IMAGE004
取40例不同浓度的临床样本与对比例平行进行检测，得到以下数据（表3）：
血清编号 实施例1 对比例 绝对偏差 相对偏差 血清相关性
血清1 0.5 0.6 -0.1 -16.67% 0.999554902
血清2 1.6 1.8 -0.2 -11.11%
血清3 2.2 2.5 -0.3 -12.00%
血清4 2.3 3.0 -0.7 -23.33%
血清5 1.1 1.4 -0.3 -21.43%
血清6 2.3 2.7 -0.4 -14.81%
血清7 2.6 3.8 -1.2 -31.58%
血清8 77.6 78.8 -1.2 -1.52%
血清9 0.6 0.8 -0.2 -25.00%
血清10 1.6 2.1 -0.5 -23.81%
血清11 51.9 52.2 -0.3 -0.57%
血清12 2.2 2.8 -0.6 -21.43%
血清13 66.5 67.5 -1.0 -1.48%
血清14 12.9 12.5 0.4 3.20%
血清15 30.2 31.7 -1.5 -4.73%
血清16 1.6 2.1 -0.5 -23.81%
血清17 3.1 3.6 -0.5 -13.89%
血清18 1.7 2.3 -0.6 -26.09%
血清19 2.8 3.7 -0.9 -24.32%
血清20 2.4 2.9 -0.5 -17.24%
血清21 19.3 19.2 0.1 0.52%
血清22 1.3 1.9 -0.6 -31.58%
血清23 19.3 18.9 0.4 2.12%
血清24 33.0 34.1 -1.1 -3.23%
血清25 41.8 40.5 1.3 3.21%
血清26 43.5 43.1 0.4 0.93%
血清27 53.6 54.2 -0.6 -1.11%
血清28 87.8 87.2 0.6 0.69%
血清29 24.8 24.5 0.3 1.22%
血清30 29.7 29.4 0.3 1.02%
血清31 11.1 10.3 0.8 7.77%
血清32 20.9 20.1 0.8 3.98%
血清33 2.0 1.7 0.3 17.65%
血清34 4.0 3.2 0.8 25.00%
血清35 2.3 1.8 0.5 27.78%
血清36 3.9 2.7 1.2 44.44%
血清37 3.3 2.5 0.8 32.00%
血清38 19.9 19.5 0.4 2.05%
血清39 1.9 1.5 0.4 26.67%
血清40 29.8 29.8 0.0 0.00%
表3的结果表明，本发明制备的试剂盒与对比例相关性较好，测值一致。
分别用实施例1与对比例试剂盒检测高值质控和低值质控，每个浓度测试3次，取平均值，计算平均值与靶值的相对偏差（表4）：
Figure 80205DEST_PATH_IMAGE006
表4的结果表明，本发明制备的试剂盒与对比例检测质控，准确性很好，偏差均在5%以内，无显著性差异。
实施例3 本发明试剂盒精密度分析
测试试剂盒：实施例1的试剂盒、对比例的肝胆酸测定试剂盒（由北京九强生物技术股份有限公司生产）
测试仪器：日立7100全自动生化分析仪
具体操作为，设置参数：测试方法：两点终点法；主波长：600nm；测光点：18-34；样本量：6；试剂量R1：R2=150：50；校准方法：spline
通过校准后，测定同一血清样本，测10次，通过检测10次的浓度结果求得平均值、SD值，算出CV值。结果见表5：
Figure 39196DEST_PATH_IMAGE008
从表5数据可看出，实施例1对同一样本的测定结果，重复性和对比例相差不多，说明本试剂测定样本具有很好的精密度。
实施例4 本发明试剂盒线性分析
测试试剂盒：实施例1的试剂盒、对比例的肝胆酸测定试剂盒（由北京九强生物技术股份有限公司生产）
测试仪器：日立7100全自动生化分析仪
具体操作为，设置参数：测试方法：两点终点法；主波长：600nm；测光点：18-34；样本量：6；试剂量R1：R2=150：50；校准方法：spline
使用接近线性范围上限80mg/L的高浓度样品和接近线性范围下限的低浓度样品，混合成5个稀释浓度，分别测试试剂，每个稀释浓度测试3次取其平均值，计算与理论值的偏差及线性相关系数，结果见表6：
Figure 853568DEST_PATH_IMAGE010
表6的数据结果可看出，实施例1线性上线的测定值稍高于对比例。

Claims (8)

1.一种肝胆酸测定试剂盒，其包含独立包装的试剂R1和试剂R2，试剂R1包含以下浓度的组分：
缓冲液：50-200mmol/L；
离子溶液：5-20g/L；
表面活性剂：0.1-2g/L；
促凝剂：10-40g/L
防腐剂：0.5-2g/L；
试剂R2包含以下浓度的组分：
缓冲液：50-200mmol/L；
抗体胶乳颗粒10-40mg/L；
稳定剂1-10g/L；
防腐剂：0.5-2g/L。
2.根据权利要求1所述的一种肝胆酸测定试剂盒，其特征在于，试剂R1、试剂R2中的缓冲液是TRIS缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、氨基乙酸缓冲液中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种肝胆酸测定试剂盒，其特征在于，所述的试剂R1中的离子溶液是氯化钠溶液、氯化钾溶液、氯化镁溶液中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的一种肝胆酸测定试剂盒，其特征在于，所述的试剂R1中的表面活性剂是曲拉通X-100、曲拉通X-305、吐温-20、吐温-80、B66中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种肝胆酸测定试剂盒，其特征在于，所述的试剂R1中的促凝剂是聚乙二醇-6000、聚乙二醇-8000和聚乙二醇-20000中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的一种肝胆酸测定试剂盒，其特征在于，所述的试剂R1、试剂R2中的防腐剂是PC300、NaN3中的一种。
7.根据权利要求1所述的一种肝胆酸测定试剂盒，其特征在于，所述的试剂R2中的稳定剂是内牛清白蛋白、酪蛋白、蔗糖中的一种。
8.根据权利要求1所述的一种肝胆酸测定试剂盒，其特征在于，所述的试剂R2中的抗体胶乳颗粒制备步骤为：
准备：准备120-300nm的聚苯乙烯胶乳颗粒，胶乳颗粒用pH7.0的5mM/L 2-（N-吗啡啉）乙磺酸稀释至终浓度为1-3%w/v得到胶乳颗粒溶液；将肝胆酸羊多抗用pH7.0的5mM/L 2-（N-吗啡啉）乙磺酸稀释至终浓度为0.05-0.15%w/v得到抗体溶液；
偶联：将抗体溶液缓慢加入到胶乳颗粒溶液中，37℃ 220转/分钟偶联30分钟；再加入20mg/L的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC），37℃ 220转/分钟偶联60分钟，即得到抗体胶乳颗粒；
封闭：加入10%牛血清白蛋白溶液15mL，37℃ 220转/分钟封闭60分钟；
储存：加入试剂R2中的缓冲液50-200mmol/L，37℃ 220转/分钟60分钟。
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