CN103558398B - 一种抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂 - Google Patents
一种抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及缺血修饰白蛋白检测技术领域，特别涉及一种抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂，包括试剂1和试剂2，试剂1中含有0.1-1%的烷基糖苷APG1214和0.1-1%的Emulgen709。在R1试剂中加入两种特殊的非离子表面活性剂烷基糖苷APG1214和Emulgen709，不仅显著改善测定的性能，而且对维护体系的透明，防止出现白色浑浊，效果明显，相比之前所用的吐温-80、Tritonx-100、聚氧乙烯月桂醚等有更好的效果，显著提高了检测试剂的抗肝素干扰能力。
Description
技术领域
本发明涉及缺血修饰白蛋白检测技术领域，特别涉及一种抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂。
背景技术
缺血修饰白蛋白（IMA）是急性冠脉综合征(ACS)诊断的生物标志。ACS具有发病急、变化快、临床表现与危险性不均一等特征，早期诊断困难。传统的生物标志物只有在心肌发生坏死时才升高，但这时已给患者带来了不可逆的病理损害。因此，急需一种可以反映心肌缺血的早期敏感强的生化指标用于早期诊断，而IMA是近年来的研究热点，为ACS早期诊断的研究开辟了新的道路。
IMA检测是以心肌缺血可引起人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)N末端发生变化及其与Co2+结合迅速减少为前提，采用白蛋白一钴结合实验测定白蛋白与外源性Co2+嵫合的能力。测定时将已知量的Co2+加入到血清标本中，待白蛋白与Co2+充分结合后，再利用二硫苏糖醇(DTT)与Co2+的显色反应，定量检测剩余的、游离态的Co2+，通过比色来间接测定IMA的含量。
在前期很多采用蛋白-钴结合实验法研制的测定试剂中，对于使用肝素处理的临床样本，无法正常检测，经实验验证和相关国内外文献显示，在使用普通IMA检测试剂，检测肝素样本，与非肝素的血清样本检测结果相关性极差，准确性难以保障，给常规的临床检测带来很大不便。它主要有以下几个问题：反应曲线差；相关性差；准确度差等。
发明内容
为了解决以上检测肝素样本中出现的反应曲线差、相关性差、准确度差的问题，本发明提供了一种抗肝素干扰能力强、具有很好的反应曲线、相关性和准确度的抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂。
本发明是通过以下方式实现的：
一种抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂，包括试剂1和试剂2，其中，
试剂1中含有0.1-1%的烷基糖苷APG1214和0.1-1%的Emulgen709。
烷基糖苷APG1214是一种烷基碳数为12-14的烷基多糖苷，是一种非离子表面活性剂。
Emulgen709是一种聚氧乙烯烷基醚。
一种抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂，包括试剂1和试剂2，其中，
试剂1中各组分重量百分含量如下：
去离子水
86.9-88.7%，
缓冲液
10%，
CoCl2·6H2O
0.1%，
防腐剂
1%，
烷基糖苷APG1214
0.1-1%，
Emulgen709
0.1-1%；
调整pH值到7.5-7.8；
试剂2中各组分重量百分含量如下：
去离子水
88%，
缓冲液
10%，
二硫苏糖醇
1%，
防腐剂
1%，
调整pH值到5.9-6.4。
所述的缺血修饰白蛋白检测试剂，优选所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液，试剂1pH值为7.5，试剂2pH值为5.9；
优选所述防腐剂为NaN3。
本发明的目的提供一种抗肝素的缺血修饰白蛋白检测试剂，为临床监测提供方便：本发明采用液体双试剂用白蛋白-钴结合实验法测定测试血清中的缺血修饰白蛋白含量。在R1试剂中加入两种特殊的非离子表面活性剂烷基糖苷APG1214和Emulgen709，在保障准确度和试剂的稳定性的前提下，不仅显著改善测定的性能，防止出现白色浑浊，效果明显，而且对维护体系的透明及提高试剂的抗干扰性能都有良好效果，为临床肝素血清样本中IMA的检测提供很大方便。
本发明的有益效果：
1）采用双试剂，R1和R2两种试剂都同时使用缓冲范围广的三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲体系，并将Co2+储存在pH值为7.5-7.8的中性环境中，因为中性环境下DTT有较强的还原性，但是DTT随着pH值得降低还原性会有很大的降低，因此将DTT储存在pH为5.9-6.4的试剂R2中以保障其稳定系；
2）在R1试剂中加入两种特殊的非离子表面活性剂烷基糖苷APG1214（重量百分比分别为0.1%-1%）和Emulgen709（重量百分比分别为0.1%-1%），不仅显著改善测定的性能，而且对维护体系的透明，防止出现白色浑浊，效果明显，相比之前所用的吐温-80、Tritonx-100、聚氧乙烯月桂醚等有更好的效果，显著提高了检测试剂的抗肝素干扰能力。
附图说明
图1实施例1试剂检测肝素样本反应曲线，
图2实施例2试剂检测肝素样本反应曲线，
图3实施例3试剂检测肝素样本反应曲线，
图4实施例2试剂检测肝素样本反应曲线。
具体实施方式
实施例
1
：一种现有的缺血修饰白蛋白检测试剂
试剂1中各组分重量百分含量：
去离子水
88.9%，
三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris） 10%，
CoCl2·6H2O
0.1%，
NaN3
1%，
将上述成分混合后即试剂1（钴离子试剂），并用HCl或者NaOH将pH值调整到7.5；
试剂2中各组分重量百分含量：
去离子水
88%，
三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris） 10%，
DTT
1%，
NaN3
1%，
将上述成分混合后即试剂2（硫苏糖醇试剂），并用HCl或者NaOH将PH值调整到5.9。
实施例
2
：本发明的抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂
试剂1中各组分重量百分含量：
去离子水
88.7%，
三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris） 10%，
CoCl2·6H2O
0.1%，
NaN3
1%，
烷基糖苷APG1214
0.1%，
Emulgen709
0.1%，
将上述成分混合后即试剂1（钴离子试剂），并用HCl或者NaOH将PH值调整到7.5；
试剂2中各组分重量百分含量：
去离子水
88%，
三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris） 10%，
DTT
1%，
NaN3
1%，
将上述成分混合后即试剂2（硫苏糖醇试剂），并用HCl或者NaOH将PH值调整到5.9。
2）本实施例试剂的使用方法：
本实施例描述的抗肝素干扰的IMA检测试剂，首先随机抽取20个新鲜的临床样本，将每一份新鲜样本分成两组，一组放在普通的KHB离心管中，另一组放置在肝素钠（肝素钾或肝素锂）离心管中同时放在离心机中离心处理，在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如东芝40全自动分析仪等，将R1和R2按照体积2:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，分别使用实施例1中的配方配置的IMA检测试剂和实施例2中加入非离子表面活性剂烷基糖苷APG1214和Emulgen709的IMA检测试剂同步对40个样本进行检测。操作如表1：
表1检测条件及工艺
计算：缺血修饰白蛋白含量（μmol/L）＝（∆A测定/min÷∆A标准/min）×C标准。
3）准确度实验：利用实施例2中本发明的配方配制试剂，与实施例1中原始方法配制的IMA检测试剂照检测，按照上述使用方法进行试验。检测结果见表2，当检测样本全部是KHB样本时实施例1和实施例2的20个样本的相对偏差最大为4.78%，相关系数为0.998654，两者相关性很强。当使用实施1试剂检测不同类型的处理的样本时相对偏差极大，最大到达94.50%，相关系数仅为0.85，最后用实施例2检测不同类型处理的样本时相对偏差最大为4.43%，相关系数为0.998457，相关性非常好，见表3和表4。说明在实施例2中加入烷基糖苷APG1214和Emulgen709两种非离子表面活性剂后，能够在检测结果上能够很好排除肝素的干扰，样本的准确度很高。
表2实施例1与实施例2试剂检测检测KHB样本结果
表3实施例1试剂检测不同类型样本对比检测结果
表4实施例2试剂检测不同类型样本对比检测结果
4）实施例1与实施例2试剂反应曲线的对比：
对同一检测样本，将实施例1和实施例2的反应曲线，进行对比发现，实施例1的反应曲线（见图1）在加入R1试剂后曲线出现波动，并且曲线有上扬的趋势，说明肝素与试剂中的成分发生了反应，影响了反应曲线，这也从测名证明了为什么实施例1中的对于不同类型的样本的检测结果相关性差的原因，而本实施例中的反应曲线（见图2）却非常的好，说明两种非离子表面活性剂对排除肝素的干扰起到了很好的效果。
实施例
3
：抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂
1）试剂1中各组分重量百分含量：
去离子水
86.9%
三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris） 10%
CoCl2·6H2O
0.1%
NaN3
1%
烷基糖苷APG1214
1%
Emulgen709
1%
将上述成分混合后即试剂1（钴离子试剂），并用HCl或者NaOH将PH值调整到7.5。
2）试剂2中各组分重量百分含量：
去离子水
88%
三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris） 10%
DTT
1%
NaN3
1%
将上述成分混合后即试剂2（硫苏糖醇试剂），并用HCl或者NaOH将PH值调整到5.9。
2）本实施例描述的是将烷基糖苷APG1214 和Emulgen709的重量百分比同时由0.1%加大到1%后IMA试剂抗肝素干扰的能力；
3）其操作方式与实施例1中的操作方式相同；
4）准确度实验：利用本实施例中配比配制试剂，与实施例2中方法配制的检测试剂照检测，按照上述3）中的使用方法进行试验。
检测结果见表5和表6，表明当检测样本全部是KHB样本时，实施例3和实施例2的20个样本的相对偏差最大为3.95%，相关系数为0.9993，两者相关性很强；当检测样本全是肝素样本时实例和实例2方法配制的试剂20个样本的相对偏差最大为-3.83%，相关性为0.999321，因此说明在实施例2中加入烷基糖苷APG1214和Emulgen709两种非离子表面活性剂重量百分比同时由0.1%加大到1%后，IMA试剂抗肝素干扰的能力依然很好，样本的准确度高。
表5实施例3与实施例2试剂检测KHB对比检测结果
表6 实施例3与实施例2试剂检测肝素样本对比检测结果
5）实施例3试剂与实施例2试剂反应曲线的对比：
对同一检测样本，绘制实施例3和实施例2的反应曲线，见图3和图4，反应曲线能够做到等效，说明两种非离子表面活性剂分别将浓度扩大到1%，同样对反应曲线起到良好的作用。
实施例
4
：一种现有的加入吐温
-80
的缺血修饰白蛋白检测试剂
1）试剂1中各组分重量百分含量：
去离子水
88.8%，
三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris） 10%，
CoCl2·6H2O
0.1%，
NaN3
1%，
吐温-80
0.1%
将上述成分混合后即试剂1（钴离子试剂），并用HCl或者NaOH将pH值调整到7.5；
试剂2中各组分重量百分含量：
去离子水
88%，
三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris） 10%，
DTT
1%，
NaN3
1%，
将上述成分混合后即试剂2（硫苏糖醇试剂），并用HCl或者NaOH将PH值调整到5.9。
2）本实施例描述的是在试剂1中加入吐温-80后IMA试剂抗肝素干扰的能力；
3）其操作方式与实施例1中的操作方式相同；
4）准确度实验：利用本实施例中配比配制试剂，与实施例2中方法配制的检测试剂照检测，按照上述3）中的使用方法进行试验。
检测结果见表7，当检测样本全是肝素样本时实例4和实例2方法配制的试剂20个样本的相对偏差最大为72.15%，相关性为0.872019，因此说明在实施例2中加入吐温-80非离子表面活性剂后，IMA试剂抗肝素干扰的能力较差，样本检测的准确度比较差。
表7实施例4与实施例2试剂检测肝素样本对比检测结果
实施例
5
：一种现有的加入
Tritonx-100
的缺血修饰白蛋白检测试剂
1）试剂1中各组分重量百分含量：
去离子水
88.8%，
三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris） 10%，
CoCl2·6H2O
0.1%，
NaN3
1%，
Tritonx-100
0.1%
将上述成分混合后即试剂1（钴离子试剂），并用HCl或者NaOH将pH值调整到7.5；
试剂2中各组分重量百分含量：
去离子水
88%，
三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris） 10%，
DTT
1%，
NaN3
1%，
将上述成分混合后即试剂2（硫苏糖醇试剂），并用HCl或者NaOH将PH值调整到5.9。
2）本实施例描述的是在试剂1中加入Tritonx-100后IMA试剂抗肝素干扰的能力；
3）其操作方式与实施例1中的操作方式相同；
4）准确度实验：利用本实施例中配比配制试剂，与实施例2中方法配制的检测试剂照检测，按照上述3）中的使用方法进行试验。
检测结果见表8，当检测样本全是肝素样本时实例和实例2方法配制的试剂20个样本的相对偏差最大为-34.60%，相关性为0.944115，因此说明在实施例2中加入Tritonx-100后两种非离子表面活性剂后，IMA试剂抗肝素干扰的能力较差，样本检测的准确度比较差，说明加入Tritonx-100后抗肝素能力较差。
表8实施例5与实施例2试剂检测肝素样本对比检测结果
实施例
6
：一种现有的加入聚氧乙烯月桂醚缺血修饰白蛋白检测试剂
1）试剂1中各组分重量百分含量：
去离子水
88.8%，
三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris） 10%，
CoCl2·6H2O
0.1%，
NaN3
1%，
聚氧乙烯月桂醚
0.1%
将上述成分混合后即试剂1（钴离子试剂），并用HCl或者NaOH将pH值调整到7.5；
试剂2中各组分重量百分含量：
去离子水
88%，
三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris） 10%，
DTT
1%，
NaN3
1%，
将上述成分混合后即试剂2（硫苏糖醇试剂），并用HCl或者NaOH将PH值调整到5.9。
2）本实施例描述的是在试剂1中加入聚氧乙烯月桂醚后IMA试剂抗肝素干扰的能力；
3）其操作方式与实施例1中的操作方式相同；
4）准确度实验：利用本实施例中配比配制试剂，与实施例2中方法配制的检测试剂照检测，按照上述3）中的使用方法进行试验。
检测结果见表9，当检测样本全是肝素样本时实例和实例2方法配制的试剂20个样本的相对偏差最大为59.34%，相关性为0.936005，因此说明在实施例6中加入聚氧乙烯月桂醚两种非离子表面活性剂后，IMA试剂抗肝素干扰的能力较差，样本检测的准确度比较差，说明抗肝素的能力较差。
表9实施例6与实施例2试剂检测肝素样本对比检测结果
实施例
7
：一种单独加入烷基糖苷
APG1214
的缺血修饰白蛋白检测试剂
1）试剂1中各组分重量百分含量：
去离子水
88.8%，
三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris） 10%，
CoCl2·6H2O
0.1%，
NaN3
1%，
烷基糖苷APG1214
0.1%
将上述成分混合后即试剂1（钴离子试剂），并用HCl或者NaOH将pH值调整到7.5；
试剂2中各组分重量百分含量：
去离子水
88%，
三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris） 10%，
DTT
1%，
NaN3
1%，
将上述成分混合后即试剂2（硫苏糖醇试剂），并用HCl或者NaOH将PH值调整到5.9。
2）本实施例描述的是在试剂1中加入烷基糖苷APG1214后IMA试剂抗肝素干扰的能力；
3）其操作方式与实施例1中的操作方式相同；
4）准确度实验：利用本实施例中配比配制试剂，与实施例2中方法配制的检测试剂照检测，按照上述3）中的使用方法进行试验。
检测结果见表10，当检测样本全是肝素样本时实例和实例2方法配制的试剂20个样本的相对偏差最大为-59.43%，相关性为0.972192，因此说明在实施例7中单独加入烷基糖苷APG1214 一种非离子表面活性剂后，IMA试剂抗肝素干扰的能力不能达到预期的效果，样本检测的准确度比较差，说明这种方式配制的IMA检测试剂抗肝素的能力较差。
表10实施例7与实施例2试剂检测肝素样本对比检测结果
实施例
8
：一种单独加入
Emulgen709
的缺血修饰白蛋白检测试剂
1）试剂1中各组分重量百分含量：
去离子水
88.8%，
三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris） 10%，
CoCl2·6H2O
0.1%，
NaN3
1%，
Emulgen709
0.1%
将上述成分混合后即试剂1（钴离子试剂），并用HCl或者NaOH将pH值调整到7.5；
试剂2中各组分重量百分含量：
去离子水
88%，
三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris） 10%，
DTT
1%，
NaN3
1%，
将上述成分混合后即试剂2（硫苏糖醇试剂），并用HCl或者NaOH将PH值调整到5.9。
2）本实施例描述的是在试剂1中加入聚氧乙烯月桂醚后IMA试剂抗肝素干扰的能力；
3）其操作方式与实施例1中的操作方式相同；
4）准确度实验：利用本实施例中配比配制试剂，与实施例2中方法配制的检测试剂照检测，按照上述3）中的使用方法进行试验。
检测结果见表11，当检测样本全是肝素样本时实例和实例2方法配制的试剂20个样本的相对偏差最大为33.08%，相关性为0.956576，因此说明在实施例8中单独加入Emulgen709一种非离子表面活性剂后，IMA试剂抗肝素干扰的能力也不能达到预期效果，样本检测的准确度比较差，说明在IMA检测试剂中单独加入Emulgen709是不行的。
表11实施例8与实施例2试剂检测肝素样本对比检测结果
通过验证，在试剂中加入非离子表面活性剂烷基糖苷APG1214和Emulgen709得到的检测试剂检测肝素样本与普通的KHB临床样本相关性好，临床检测样本结果一致，能够达到市场对产品的应用要求，为临床检测提供了很大的方便。
Claims (3)
1.一种抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂，其特征在于包括试剂1和试剂2，其中，
试剂1中各组分重量百分含量如下：
去离子水
86.9-88.7%，
缓冲液
10%，
CoCl2·6H2O
0.1%，
防腐剂
1%，
烷基糖苷APG1214
0.1-1%，
Emulgen709
0.1-1%；
调整pH值到7.5；
试剂2中各组分重量百分含量如下：
去离子水
88%，
缓冲液
10%，
二硫苏糖醇
1%，
防腐剂
1%，
调整pH值到5.9。
2.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂，其特征在于所述试剂1和试剂2中的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液，试剂1 pH值为7.5，试剂2 pH值为5.9。
3.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂，其特征在于所述试剂1和试剂2中的防腐剂为NaN3。
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