CN103558398B - 一种抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂 - Google Patents

一种抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及缺血修饰白蛋白检测技术领域,特别涉及一种抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂,包括试剂1和试剂2,试剂1中含有0.1-1%的烷基糖苷APG1214和0.1-1%的Emulgen709。在R1试剂中加入两种特殊的非离子表面活性剂烷基糖苷APG1214和Emulgen709,不仅显著改善测定的性能,而且对维护体系的透明,防止出现白色浑浊,效果明显,相比之前所用的吐温-80、Tritonx-100、聚氧乙烯月桂醚等有更好的效果,显著提高了检测试剂的抗肝素干扰能力。

Description

一种抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂
技术领域
本发明涉及缺血修饰白蛋白检测技术领域,特别涉及一种抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂。
背景技术
缺血修饰白蛋白(IMA)是急性冠脉综合征(ACS)诊断的生物标志。ACS具有发病急、变化快、临床表现与危险性不均一等特征,早期诊断困难。传统的生物标志物只有在心肌发生坏死时才升高,但这时已给患者带来了不可逆的病理损害。因此,急需一种可以反映心肌缺血的早期敏感强的生化指标用于早期诊断,而IMA是近年来的研究热点,为ACS早期诊断的研究开辟了新的道路。
IMA检测是以心肌缺血可引起人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)N末端发生变化及其与Co2+结合迅速减少为前提,采用白蛋白一钴结合实验测定白蛋白与外源性Co2+嵫合的能力。测定时将已知量的Co2+加入到血清标本中,待白蛋白与Co2+充分结合后,再利用二硫苏糖醇(DTT)与Co2+的显色反应,定量检测剩余的、游离态的Co2+,通过比色来间接测定IMA的含量。
在前期很多采用蛋白-钴结合实验法研制的测定试剂中,对于使用肝素处理的临床样本,无法正常检测,经实验验证和相关国内外文献显示,在使用普通IMA检测试剂,检测肝素样本,与非肝素的血清样本检测结果相关性极差,准确性难以保障,给常规的临床检测带来很大不便。它主要有以下几个问题:反应曲线差;相关性差;准确度差等。
发明内容
为了解决以上检测肝素样本中出现的反应曲线差、相关性差、准确度差的问题,本发明提供了一种抗肝素干扰能力强、具有很好的反应曲线、相关性和准确度的抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂。
本发明是通过以下方式实现的:
一种抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂,包括试剂1和试剂2,其中,
试剂1中含有0.1-1%的烷基糖苷APG1214和0.1-1%的Emulgen709。
烷基糖苷APG1214是一种烷基碳数为12-14的烷基多糖苷,是一种非离子表面活性剂。
Emulgen709是一种聚氧乙烯烷基醚。
一种抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂,包括试剂1和试剂2,其中,
试剂1中各组分重量百分含量如下:
去离子水 86.9-88.7%,
缓冲液 10%,
CoCl2·6H2O 0.1%,
防腐剂 1%,
烷基糖苷APG1214 0.1-1%,
Emulgen709 0.1-1%;
调整pH值到7.5-7.8;
试剂2中各组分重量百分含量如下:
去离子水 88%,
缓冲液 10%,
二硫苏糖醇 1%,
防腐剂 1%,
调整pH值到5.9-6.4。
所述的缺血修饰白蛋白检测试剂,优选所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液,试剂1pH值为7.5,试剂2pH值为5.9;
优选所述防腐剂为NaN3
本发明的目的提供一种抗肝素的缺血修饰白蛋白检测试剂,为临床监测提供方便:本发明采用液体双试剂用白蛋白-钴结合实验法测定测试血清中的缺血修饰白蛋白含量。在R1试剂中加入两种特殊的非离子表面活性剂烷基糖苷APG1214和Emulgen709,在保障准确度和试剂的稳定性的前提下,不仅显著改善测定的性能,防止出现白色浑浊,效果明显,而且对维护体系的透明及提高试剂的抗干扰性能都有良好效果,为临床肝素血清样本中IMA的检测提供很大方便。
本发明的有益效果:
1)采用双试剂,R1和R2两种试剂都同时使用缓冲范围广的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲体系,并将Co2+储存在pH值为7.5-7.8的中性环境中,因为中性环境下DTT有较强的还原性,但是DTT随着pH值得降低还原性会有很大的降低,因此将DTT储存在pH为5.9-6.4的试剂R2中以保障其稳定系;
2)在R1试剂中加入两种特殊的非离子表面活性剂烷基糖苷APG1214(重量百分比分别为0.1%-1%)和Emulgen709(重量百分比分别为0.1%-1%),不仅显著改善测定的性能,而且对维护体系的透明,防止出现白色浑浊,效果明显,相比之前所用的吐温-80、Tritonx-100、聚氧乙烯月桂醚等有更好的效果,显著提高了检测试剂的抗肝素干扰能力。
附图说明
图1实施例1试剂检测肝素样本反应曲线,
图2实施例2试剂检测肝素样本反应曲线,
图3实施例3试剂检测肝素样本反应曲线,
图4实施例2试剂检测肝素样本反应曲线。
具体实施方式
实施例 1 :一种现有的缺血修饰白蛋白检测试剂
试剂1中各组分重量百分含量:
去离子水 88.9%,
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris) 10%,
CoCl2·6H2O 0.1%,
NaN3 1%,
将上述成分混合后即试剂1(钴离子试剂),并用HCl或者NaOH将pH值调整到7.5;
试剂2中各组分重量百分含量:
去离子水 88%,
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris) 10%,
DTT 1%,
NaN3 1%,
将上述成分混合后即试剂2(硫苏糖醇试剂),并用HCl或者NaOH将PH值调整到5.9。
实施例 2 :本发明的抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂
试剂1中各组分重量百分含量:
去离子水 88.7%,
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris) 10%,
CoCl2·6H2O 0.1%,
NaN3 1%,
烷基糖苷APG1214 0.1%,
Emulgen709 0.1%,
将上述成分混合后即试剂1(钴离子试剂),并用HCl或者NaOH将PH值调整到7.5;
试剂2中各组分重量百分含量:
去离子水 88%,
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris) 10%,
DTT 1%,
NaN3 1%,
将上述成分混合后即试剂2(硫苏糖醇试剂),并用HCl或者NaOH将PH值调整到5.9。
2)本实施例试剂的使用方法:
本实施例描述的抗肝素干扰的IMA检测试剂,首先随机抽取20个新鲜的临床样本,将每一份新鲜样本分成两组,一组放在普通的KHB离心管中,另一组放置在肝素钠(肝素钾或肝素锂)离心管中同时放在离心机中离心处理,在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪,如东芝40全自动分析仪等,将R1和R2按照体积2:1的比例放置到对应的试剂位上,在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本,分别使用实施例1中的配方配置的IMA检测试剂和实施例2中加入非离子表面活性剂烷基糖苷APG1214和Emulgen709的IMA检测试剂同步对40个样本进行检测。操作如表1:
表1检测条件及工艺
计算:缺血修饰白蛋白含量(μmol/L)=(∆A测定/min÷∆A标准/min)×C标准。
3)准确度实验:利用实施例2中本发明的配方配制试剂,与实施例1中原始方法配制的IMA检测试剂照检测,按照上述使用方法进行试验。检测结果见表2,当检测样本全部是KHB样本时实施例1和实施例2的20个样本的相对偏差最大为4.78%,相关系数为0.998654,两者相关性很强。当使用实施1试剂检测不同类型的处理的样本时相对偏差极大,最大到达94.50%,相关系数仅为0.85,最后用实施例2检测不同类型处理的样本时相对偏差最大为4.43%,相关系数为0.998457,相关性非常好,见表3和表4。说明在实施例2中加入烷基糖苷APG1214和Emulgen709两种非离子表面活性剂后,能够在检测结果上能够很好排除肝素的干扰,样本的准确度很高。
表2实施例1与实施例2试剂检测检测KHB样本结果
表3实施例1试剂检测不同类型样本对比检测结果
表4实施例2试剂检测不同类型样本对比检测结果
4)实施例1与实施例2试剂反应曲线的对比:
对同一检测样本,将实施例1和实施例2的反应曲线,进行对比发现,实施例1的反应曲线(见图1)在加入R1试剂后曲线出现波动,并且曲线有上扬的趋势,说明肝素与试剂中的成分发生了反应,影响了反应曲线,这也从测名证明了为什么实施例1中的对于不同类型的样本的检测结果相关性差的原因,而本实施例中的反应曲线(见图2)却非常的好,说明两种非离子表面活性剂对排除肝素的干扰起到了很好的效果。
实施例 3 :抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂
1)试剂1中各组分重量百分含量:
去离子水 86.9%
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris) 10%
CoCl2·6H2O 0.1%
NaN3 1%
烷基糖苷APG1214 1%
Emulgen709 1%
将上述成分混合后即试剂1(钴离子试剂),并用HCl或者NaOH将PH值调整到7.5。
2)试剂2中各组分重量百分含量:
去离子水 88%
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris) 10%
DTT 1%
NaN3 1%
将上述成分混合后即试剂2(硫苏糖醇试剂),并用HCl或者NaOH将PH值调整到5.9。
2)本实施例描述的是将烷基糖苷APG1214 和Emulgen709的重量百分比同时由0.1%加大到1%后IMA试剂抗肝素干扰的能力;
3)其操作方式与实施例1中的操作方式相同;
4)准确度实验:利用本实施例中配比配制试剂,与实施例2中方法配制的检测试剂照检测,按照上述3)中的使用方法进行试验。
检测结果见表5和表6,表明当检测样本全部是KHB样本时,实施例3和实施例2的20个样本的相对偏差最大为3.95%,相关系数为0.9993,两者相关性很强;当检测样本全是肝素样本时实例和实例2方法配制的试剂20个样本的相对偏差最大为-3.83%,相关性为0.999321,因此说明在实施例2中加入烷基糖苷APG1214和Emulgen709两种非离子表面活性剂重量百分比同时由0.1%加大到1%后,IMA试剂抗肝素干扰的能力依然很好,样本的准确度高。
表5实施例3与实施例2试剂检测KHB对比检测结果
表6 实施例3与实施例2试剂检测肝素样本对比检测结果
5)实施例3试剂与实施例2试剂反应曲线的对比:
对同一检测样本,绘制实施例3和实施例2的反应曲线,见图3和图4,反应曲线能够做到等效,说明两种非离子表面活性剂分别将浓度扩大到1%,同样对反应曲线起到良好的作用。
实施例 4 :一种现有的加入吐温 -80 的缺血修饰白蛋白检测试剂
1)试剂1中各组分重量百分含量:
去离子水 88.8%,
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris) 10%,
CoCl2·6H2O 0.1%,
NaN3 1%,
吐温-80 0.1%
将上述成分混合后即试剂1(钴离子试剂),并用HCl或者NaOH将pH值调整到7.5;
试剂2中各组分重量百分含量:
去离子水 88%,
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris) 10%,
DTT 1%,
NaN3 1%,
将上述成分混合后即试剂2(硫苏糖醇试剂),并用HCl或者NaOH将PH值调整到5.9。
2)本实施例描述的是在试剂1中加入吐温-80后IMA试剂抗肝素干扰的能力;
3)其操作方式与实施例1中的操作方式相同;
4)准确度实验:利用本实施例中配比配制试剂,与实施例2中方法配制的检测试剂照检测,按照上述3)中的使用方法进行试验。
检测结果见表7,当检测样本全是肝素样本时实例4和实例2方法配制的试剂20个样本的相对偏差最大为72.15%,相关性为0.872019,因此说明在实施例2中加入吐温-80非离子表面活性剂后,IMA试剂抗肝素干扰的能力较差,样本检测的准确度比较差。
表7实施例4与实施例2试剂检测肝素样本对比检测结果
实施例 5 :一种现有的加入 Tritonx-100 的缺血修饰白蛋白检测试剂
1)试剂1中各组分重量百分含量:
去离子水 88.8%,
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris) 10%,
CoCl2·6H2O 0.1%,
NaN3 1%,
Tritonx-100 0.1%
将上述成分混合后即试剂1(钴离子试剂),并用HCl或者NaOH将pH值调整到7.5;
试剂2中各组分重量百分含量:
去离子水 88%,
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris) 10%,
DTT 1%,
NaN3 1%,
将上述成分混合后即试剂2(硫苏糖醇试剂),并用HCl或者NaOH将PH值调整到5.9。
2)本实施例描述的是在试剂1中加入Tritonx-100后IMA试剂抗肝素干扰的能力;
3)其操作方式与实施例1中的操作方式相同;
4)准确度实验:利用本实施例中配比配制试剂,与实施例2中方法配制的检测试剂照检测,按照上述3)中的使用方法进行试验。
检测结果见表8,当检测样本全是肝素样本时实例和实例2方法配制的试剂20个样本的相对偏差最大为-34.60%,相关性为0.944115,因此说明在实施例2中加入Tritonx-100后两种非离子表面活性剂后,IMA试剂抗肝素干扰的能力较差,样本检测的准确度比较差,说明加入Tritonx-100后抗肝素能力较差。
表8实施例5与实施例2试剂检测肝素样本对比检测结果
实施例 6 :一种现有的加入聚氧乙烯月桂醚缺血修饰白蛋白检测试剂
1)试剂1中各组分重量百分含量:
去离子水 88.8%,
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris) 10%,
CoCl2·6H2O 0.1%,
NaN3 1%,
聚氧乙烯月桂醚 0.1%
将上述成分混合后即试剂1(钴离子试剂),并用HCl或者NaOH将pH值调整到7.5;
试剂2中各组分重量百分含量:
去离子水 88%,
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris) 10%,
DTT 1%,
NaN3 1%,
将上述成分混合后即试剂2(硫苏糖醇试剂),并用HCl或者NaOH将PH值调整到5.9。
2)本实施例描述的是在试剂1中加入聚氧乙烯月桂醚后IMA试剂抗肝素干扰的能力;
3)其操作方式与实施例1中的操作方式相同;
4)准确度实验:利用本实施例中配比配制试剂,与实施例2中方法配制的检测试剂照检测,按照上述3)中的使用方法进行试验。
检测结果见表9,当检测样本全是肝素样本时实例和实例2方法配制的试剂20个样本的相对偏差最大为59.34%,相关性为0.936005,因此说明在实施例6中加入聚氧乙烯月桂醚两种非离子表面活性剂后,IMA试剂抗肝素干扰的能力较差,样本检测的准确度比较差,说明抗肝素的能力较差。
表9实施例6与实施例2试剂检测肝素样本对比检测结果
实施例 7 :一种单独加入烷基糖苷 APG1214 的缺血修饰白蛋白检测试剂
1)试剂1中各组分重量百分含量:
去离子水 88.8%,
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris) 10%,
CoCl2·6H2O 0.1%,
NaN3 1%,
烷基糖苷APG1214 0.1%
将上述成分混合后即试剂1(钴离子试剂),并用HCl或者NaOH将pH值调整到7.5;
试剂2中各组分重量百分含量:
去离子水 88%,
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris) 10%,
DTT 1%,
NaN3 1%,
将上述成分混合后即试剂2(硫苏糖醇试剂),并用HCl或者NaOH将PH值调整到5.9。
2)本实施例描述的是在试剂1中加入烷基糖苷APG1214后IMA试剂抗肝素干扰的能力;
3)其操作方式与实施例1中的操作方式相同;
4)准确度实验:利用本实施例中配比配制试剂,与实施例2中方法配制的检测试剂照检测,按照上述3)中的使用方法进行试验。
检测结果见表10,当检测样本全是肝素样本时实例和实例2方法配制的试剂20个样本的相对偏差最大为-59.43%,相关性为0.972192,因此说明在实施例7中单独加入烷基糖苷APG1214 一种非离子表面活性剂后,IMA试剂抗肝素干扰的能力不能达到预期的效果,样本检测的准确度比较差,说明这种方式配制的IMA检测试剂抗肝素的能力较差。
表10实施例7与实施例2试剂检测肝素样本对比检测结果
实施例 8 :一种单独加入 Emulgen709 的缺血修饰白蛋白检测试剂
1)试剂1中各组分重量百分含量:
去离子水 88.8%,
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris) 10%,
CoCl2·6H2O 0.1%,
NaN3 1%,
Emulgen709 0.1%
将上述成分混合后即试剂1(钴离子试剂),并用HCl或者NaOH将pH值调整到7.5;
试剂2中各组分重量百分含量:
去离子水 88%,
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris) 10%,
DTT 1%,
NaN3 1%,
将上述成分混合后即试剂2(硫苏糖醇试剂),并用HCl或者NaOH将PH值调整到5.9。
2)本实施例描述的是在试剂1中加入聚氧乙烯月桂醚后IMA试剂抗肝素干扰的能力;
3)其操作方式与实施例1中的操作方式相同;
4)准确度实验:利用本实施例中配比配制试剂,与实施例2中方法配制的检测试剂照检测,按照上述3)中的使用方法进行试验。
检测结果见表11,当检测样本全是肝素样本时实例和实例2方法配制的试剂20个样本的相对偏差最大为33.08%,相关性为0.956576,因此说明在实施例8中单独加入Emulgen709一种非离子表面活性剂后,IMA试剂抗肝素干扰的能力也不能达到预期效果,样本检测的准确度比较差,说明在IMA检测试剂中单独加入Emulgen709是不行的。
表11实施例8与实施例2试剂检测肝素样本对比检测结果
通过验证,在试剂中加入非离子表面活性剂烷基糖苷APG1214和Emulgen709得到的检测试剂检测肝素样本与普通的KHB临床样本相关性好,临床检测样本结果一致,能够达到市场对产品的应用要求,为临床检测提供了很大的方便。

Claims (3)

1.一种抗肝素干扰的缺血修饰白蛋白检测试剂,其特征在于包括试剂1和试剂2,其中,
试剂1中各组分重量百分含量如下:
去离子水 86.9-88.7%,
缓冲液 10%,
CoCl2·6H2O 0.1%,
防腐剂 1%,
烷基糖苷APG1214 0.1-1%,
Emulgen709 0.1-1%;
调整pH值到7.5;
试剂2中各组分重量百分含量如下:
去离子水 88%,
缓冲液 10%,
二硫苏糖醇 1%,
防腐剂 1%,
调整pH值到5.9。
2.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂,其特征在于所述试剂1和试剂2中的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液,试剂1 pH值为7.5,试剂2 pH值为5.9。
3.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白检测试剂,其特征在于所述试剂1和试剂2中的防腐剂为NaN3
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