CN104198729B - 一种稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒 - Google Patents

一种稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒，包括钴离子试剂和二硫苏糖醇试剂，钴离子试剂的组分为：缓冲液：50-500mmol/L，氯化钴：0.01-1.0g/L，表面活性剂：1g/L，防腐剂：0.5g/L；二硫苏糖醇试剂的组分为：缓冲液：50-300mmol/L，DTT：0.01-1.0g/L，表面活性剂：1g/L，保护剂：1-20g/L，防腐剂：0.5g/L。本发明试剂盒可以快速达到反应终点，性能稳定，室温开瓶避光保存稳定30天，2-8℃闭瓶保存稳定12个月，完全满足临床检验需要。

Description

一种稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒
技术领域
本发明涉及一种缺血修饰白蛋白检测技术领域，尤其涉及一种稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒。
背景技术
缺血修饰白蛋白(IMA)是一种新的较为理想的缺血标志物，它是在缺血或再灌注发生时，由于自由基等破坏了血清白蛋白的氨基酸序列，而导致白蛋白与过渡金属的结合能力改变，从而发生与过渡金属结合能力改变的白蛋白。
作为检测早期心肌缺血的指标，IMA可敏感地反映心肌缺血状况，因此，在急性冠状动脉综合征的早期诊断、危险分层、指导治疗等方面有着重要意义。目前，国内外普遍采用的检测IMA试剂盒由液体双试剂组成，第一试剂为钴离子试剂，第二试剂为二硫苏糖醇(DTT)试剂。但是由于DTT本身是一种很强的还原剂，很容易被空气氧化，而且半衰期液比较短，因此稳定性很差。为了提高试剂的稳定性，中国发明专利(公开号：CN102507916A)通过将DTT加入到高浓度缓冲液中，并加入少量非离子型表面活性剂，从而大大降低了DTT氧化的速度，提高了试剂的稳定性。又如中国发明专利(公开号：CN103760357A)通过在试剂2(DTT试剂)中加入还原保护剂谷胱甘肽、亚硫酸氢钠或巯基乙醇，有效地保护了DTT在溶液中的稳定性。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提出了一种可以快速达到反应终点，性能稳定，室温开瓶避光保存稳定30天，2-8℃闭瓶保存稳定12个月，完全满足临床检验需要的稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒，包括钴离子试剂和二硫苏糖醇试剂，
所述钴离子试剂的组分为：缓冲液：50-500mmol/L，氯化钴：0.01-1.0g/L，表面活性剂：1g/L，防腐剂：0.5g/L；
所述二硫苏糖醇试剂的组分为：缓冲液：50-300mmol/L，DTT：0.01-1.0g/L，表面活性剂：1g/L，保护剂：1-20g/L，防腐剂：0.5g/L。
在上述的一种稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒中，所述钴离子试剂中的缓冲液可以是三羟甲基氨基甲烷缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液或三乙醇胺缓冲液中的一种。
在上述的一种稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒中，所述钴离子试剂中的缓冲液的pH为7.0-8.5。
在上述的一种稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒中，所述二硫苏糖醇试剂中的缓冲液可以是醋酸-醋酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或2-吗啉乙磺酸缓冲液中的一种。
在上述的一种稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒中，所述二硫苏糖醇试剂中的缓冲液的pH为5.0-6.5。
在上述的一种稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒中，所述钴离子试剂和二硫苏糖醇试剂中的表面活性剂可以是TritonX-100、吐温-20或布里杰-35中的一种。表面活性剂可以加速反应达到终点。
在上述的一种稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒中，所述钴离子试剂和二硫苏糖醇试剂中的防腐剂可以是叠氮钠或proclin系列中的一种。
在上述的一种稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒中，所述二硫苏糖醇试剂中的保护剂可以是甘露醇、葡萄糖或甘油中的一种。上述保护剂保护剂甘露醇、葡萄糖和甘油可以大幅度减缓DTT的氧化速率，显著提高试剂的稳定性。
本发明稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒检测原理是：血清中正常的白蛋白以活性形式存在，当加入钴离子试剂后，Co2+与白蛋白N-末端结合，溶液中存在的游离Co2+浓度较低。而心肌缺血患者血清标本中含有较多的IMA，加入同等量的钴离子试剂后，由于IMA与Co2+的结合能力降低，溶液中存在较高浓度的游离Co2+，加入二巯基苏糖醇试剂后，二巯基苏糖醇试剂可与游离Co2+产生络合反应，生成红褐色的产物，在最大吸收波长下测定吸光度的大小，其吸光度与Co2+浓度成正比，吸光度高者表示血清中存在较多的IMA。与标准品进行比较，即可计算出样本中IMA的浓度。
与现有技术相比，本发明具有以下几个优点：
1.本发明稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒能快速达到反应终点、测试性能稳定。
2.本发明稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒中加入保护剂，明显的提高了试剂的稳定性，室温开瓶避光保存稳定30天，2-8℃闭瓶保存稳定12个月，完全满足临床检验的需要。
附图说明
图1为本发明稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒的定标曲线；
图2为实施例1稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒和对比例2试剂盒的IMA测试结果的相关性曲线；
图3为本发明实施例1稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒中添加不同浓度的保护剂甘露醇后DTT含量的稳定性曲线。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例结合附图说明，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
应用本发明试剂盒测定血清样本中IMA值的测试条件为：温度37℃，检测主波长505nm，副波长700nm；测试方法为：血清样本或者校准品12ul加入90ul的钴离子试剂混匀，37℃孵育5min，读吸光度值A1，然后加入30ul的二硫苏糖醇试剂混匀，5min后读吸光度值A2，ΔA＝A2-A1，然后按照如下公式计算样本中IMA的浓度：
单位定义：1ml血清中白蛋白失去结合1ug钴离子的能力定义为1U。
对比例1：
本对比例为本发明稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒不添加保护剂成分的试剂盒，它由钴离子试剂和二硫苏糖醇试剂组成；
其中，钴离子试剂的组分及其浓度为：三乙醇胺缓冲液：100mmol/L，氯化钴：0.2g/L，TritonX-100：1g/L，叠氮钠：0.5g/L，其中，三乙醇胺缓冲液的pH值为8.0；
二硫苏糖醇试剂的组分及其浓度为：2-吗啉乙磺酸缓冲液：100mmol/L，DTT：1.0g/L，TritonX-100：1g/L，叠氮钠：0.5g/L，其中，2-吗啉乙磺酸缓冲液的pH值为5.5。
对比例2：
市售常见缺血修饰白蛋白试剂盒。
实施例1：
本实施例稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒由钴离子试剂和二硫苏糖醇试剂组成；
其中，钴离子试剂的组分及其浓度为：三乙醇胺缓冲液：100mmol/L，氯化钴：0.2g/L，TritonX-100：1g/L，叠氮钠：0.5g/L，其中，三乙醇胺缓冲液的pH值为8.0；
二硫苏糖醇试剂的组分及其浓度为：2-吗啉乙磺酸缓冲液：100mmol/L，DTT：1.0g/L，TritonX-100：1g/L，甘露醇：5-20g/L，叠氮钠：0.5g/L，其中，2-吗啉乙磺酸缓冲液的pH值为5.5。
实施例2：
本实施例稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒由钴离子试剂和二硫苏糖醇试剂组成；
其中，钴离子试剂的组分及其浓度为：三乙醇胺缓冲液：100mmol/L，氯化钴：0.2g/L，TritonX-100：1g/L，叠氮钠：0.5g/L，其中，三乙醇胺缓冲液的pH值为8.0；
二硫苏糖醇试剂的组分及其浓度为：2-吗啉乙磺酸缓冲液：100mmol/L，DTT：1.0g/L，TritonX-100：1g/L，葡萄糖：10g/L，叠氮钠：0.5g/L，其中，2-吗啉乙磺酸缓冲液的pH值为5.5。
实施例3：
本实施例稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒由钴离子试剂和二硫苏糖醇试剂组成；
其中，钴离子试剂的组分及其浓度为：三乙醇胺缓冲液：100mmol/L，氯化钴：0.2g/L，TritonX-100：1g/L，叠氮钠：0.5g/L，其中，三乙醇胺缓冲液的pH值为8.0；
二硫苏糖醇试剂的组分及其浓度为：2-吗啉乙磺酸缓冲液：100mmol/L，DTT：1.0g/L，TritonX-100：1g/L，甘油：10g/L，叠氮钠：0.5g/L，其中，2-吗啉乙磺酸缓冲液的pH值为5.5。
图1是本发明稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒用浓度为70.6U/ml的校准品的定标曲线，图1中的读数点每34个点为10分钟。从图1可知：本发明的试剂盒可以很快的达到反应终点，节约测试时间，检测速率快。
将实施例1和对比例2作比较，测试20份血清样本中IMA的浓度，检测结果如表1所示；然后以对比例2试剂盒测试结果为横坐标，以实施例1测试结果为纵坐标，做回归分析，两者相关性如图2所示。
表1：实施例1和对比例2试剂盒的IMA浓度测试结果
从表1和图2可知：实施例1和对比例2的试剂盒血清测试偏差最大值为3.32％，回归方程为Y＝0.9805X+0.003，R2＝0.9978，相关系数R为0.9989，表明本发明实施例1试剂盒同对比例2市售常见缺血修饰白蛋白试剂盒的相关性强，说明本发明制备的试剂盒可以替代市场上常见的试剂盒。
将本发明实施例1和对比例1中组成成分的试剂盒置于2-8℃储存，然后测试实施例1加入不同浓度的甘露醇对DTT稳定性的影响，测试结果如表2所示，DTT含量的稳定性曲线如图3所示。
表2：本发明实施例1加入不同量的保护剂甘露醇对DTT稳定性的影响
从表2和图3可知，加入保护剂甘露醇后可以显著提高DTT的稳定性，且随着甘露醇浓度的增加，DTT的稳定性越好。当保护剂甘露醇浓度为10g/L时，DTT的稳定性基本保持不变。因此以10g/L甘露醇作为最佳保护剂用量，可以有效提高缺血修饰白蛋白测定试剂的稳定性。
将本发明对比例1、实施例2和实施例3中组成成分的试剂盒置于2-8℃储存，然后测试加入浓度为10g/L的保护剂葡萄糖和甘油对DTT稳定性的影响，检测结果如表3所示。
表3：加入葡萄糖保护剂对DTT稳定性的影响
从表3可知，加入保护剂葡萄糖或甘油后也可以大幅度降低DTT的氧化速率，有效提高缺血修饰白蛋白测定试剂的稳定性。
实施例4-6与实施例1-3的唯一区别仅在于钴离子试剂中的三乙醇胺缓冲液pH值为8.5。
实施例7-9与实施例1-3的唯一区别仅在于钴离子试剂中的三乙醇胺缓冲液pH值为7.5。
实施例10-12与实施例1-3的唯一区别仅在于钴离子试剂中的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
实施例13-15与实施例1-3的唯一区别仅在于钴离子试剂中的缓冲液为哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液。
实施例16-18与实施例1-3的唯一区别仅在于钴离子试剂中的表面活化剂为吐温-20。
实施例19-21与实施例1-3的唯一区别仅在于钴离子试剂中的表面活化剂为布里杰-35。
实施例22-24与实施例1-3的唯一区别仅在于钴离子试剂中的防腐剂为proclin系列。
实施例25-27与实施例1-3的唯一区别仅在于二硫苏糖醇试剂中的2-吗啉乙磺酸缓冲液的pH为6.0。
实施例28-30与实施例1-3的唯一区别仅在于二硫苏糖醇试剂中的2-吗啉乙磺酸缓冲液的pH为6.5。
实施例31-33与实施例1-3的唯一区别仅在于二硫苏糖醇试剂中的缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液。
实施例34-36与实施例1-3的唯一区别仅在于二硫苏糖醇试剂中的缓冲液为磷酸盐缓冲液。
实施例37-39与实施例1-3的唯一区别仅在于二硫苏糖醇试剂中的缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
实施例40-42与实施例1-3的唯一区别仅在于二硫苏糖醇试剂中的表面活化剂为吐温-20。
实施例43-45与实施例1-3的唯一区别仅在于二硫苏糖醇试剂中的表面活化剂为布里杰-35。
实施例46-48与实施例1-3的唯一区别仅在于二硫苏糖醇试剂中的防腐剂为proclin系列。
实施例49-51与实施例1-3的唯一区别仅在于钴离子试剂中的三乙醇胺缓冲液的浓度为50mmol/L。
实施例52-54与实施例1-3的唯一区别仅在于钴离子试剂中的三乙醇胺缓冲液的浓度为200mmol/L。
实施例55-57与实施例1-3的唯一区别仅在于钴离子试剂中的三乙醇胺缓冲液的浓度为500mmol/L。
实施例58-60与实施例1-3的唯一区别仅在于二硫苏糖醇试剂中的2-吗啉乙磺酸缓冲液的浓度为50mmol/L。
实施例61-63与实施例1-3的唯一区别仅在于二硫苏糖醇试剂中的2-吗啉乙磺酸缓冲液的浓度为200mmol/L。
实施例64-66与实施例1-3的唯一区别仅在于二硫苏糖醇试剂中的2-吗啉乙磺酸缓冲液的浓度为300mmol/L。
鉴于本发明方案实施例众多，各实施例实验数据庞大众多，不适于于此处逐一列举说明，但是各实施例所需要验证的内容和得到的最终结论均接近，均可以证明本发明稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒能快速达到反应终点，检测结果相关性强，加入保护剂后可以大幅度降低DTT的氧化速率，有效提高缺血修饰白蛋白测定试剂的稳定性，故而此处不对各个实施例的验证内容进行逐一说明。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims (7)

1.一种稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒，其特征在于，包括钴离子试剂和二硫苏糖醇试剂，
所述钴离子试剂的组分为：缓冲液：50-500mmol/L，氯化钴：0.01-1.0g/L，表面活性剂：1g/L，防腐剂：0.5g/L；
所述二硫苏糖醇试剂的组分为：缓冲液：50-300mmol/L，DTT：0.01-1.0g/L，表面活性剂：1g/L，保护剂：1-20g/L，防腐剂：0.5g/L；
所述二硫苏糖醇试剂中的保护剂是甘露醇、葡萄糖或甘油中的一种。
2.根据权利要求1所述的一种稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒，其特征在于，所述钴离子试剂中的缓冲液是三羟甲基氨基甲烷缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液或三乙醇胺缓冲液中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的一种稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒，其特征在于，所述钴离子试剂中的缓冲液的pH为7.0-8.5。
4.根据权利要求1所述的一种稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒，其特征在于，所述二硫苏糖醇试剂中的缓冲液是醋酸-醋酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或2-吗啉乙磺酸缓冲液中的一种。
5.根据权利要求1或4所述的一种稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒，其特征在于，所述二硫苏糖醇试剂中的缓冲液的pH为5.0-6.5。
6.根据权利要求1所述的一种稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒，其特征在于，所述钴离子试剂和二硫苏糖醇试剂中的表面活性剂是TritonX-100、吐温-20或布里杰-35中的一种。
7.根据权利要求1所述的一种稳定的缺血修饰白蛋白试剂盒，其特征在于，所述钴离子试剂和二硫苏糖醇试剂中的防腐剂是叠氮钠或proclin系列中的一种。
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