CN101458257B - 检测缺血修饰白蛋白的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测缺血修饰性白蛋白的试剂盒。本发明的试剂盒由试剂1和试剂2组成。通过加入表面活性剂，加速了缺血修饰性白蛋白的反应；选用保护剂，确保了试剂的稳定性，本发明的试剂盒有较好的临床应用前景。本发明提供了制备方法。

Description

检测缺血修饰白蛋白的试剂盒及其制备方法

技术领域：

本发明涉及生物试剂。具体涉及一种检测缺血修饰性白蛋白试剂盒及其制备方法。

背景技术：

缺血修饰白蛋白是当缺血/再灌注发生时，由于自由基等破坏了血清白蛋白的氨基酸序列，而导致白蛋白与过渡金属的结合能力改变，这种因缺血而发生与过渡金属结合能力改变的白蛋白则称缺血修饰白蛋白(IMA)。

近年来，心肌损伤标志物有了迅速的发展。肌钙蛋白(cTn)、肌红蛋白(Myo)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)质量的检测已在临床上得到广泛的应用，逐步取代原有的酶活性的检测。但对于急性冠状动脉综合症(Acute Coronary Syndromes，ACS)的诊断问题尚未得到妥善解决。

另外ECG(心电图)、CK(肌酸激酶)、CK-MB(肌酸激酶同工酶)、Myo(肌红蛋白)、cTnT(肌钙蛋白T)、cTnI(肌钙蛋白I)等也是检测指标，但它们有下列不足：

ECG：灵敏度一般低于50％

CK、CK-MB、Myo：特异性差，在骨骼肌中也存在

cTnT、cTnI：特异性高，但只有在心肌缺血6-12小时后才能检出，且仅在不可逆的细胞损害及细胞膜的完整性破坏之后才升高，即它是对心肌细胞损伤的特异性高。

除上述之外，IMA(缺血修饰白蛋白)：是心肌缺血的特异标志物，ACS(急性冠状动脉综合症)疑似患者就诊时单独测定的灵敏度为82％，与ECG和cTn联合测定的灵敏度可以达到95％，说明其具有很高的灵敏度和阴性预测值。

缺血修饰白蛋白的测定对临床医师而言：一个低危险度的患者，如果IMA结果正常(低于判断值)并伴ECG无明显异常和cTn正常，可以排除急性冠状动脉综合症？。这是一个非常好的让急诊患者早期出院的指征。但对于一个高危险度的患者，不能就此简单的将正常的IMA看成是早期可以出院的指征。因而，目前还不宜将IMA正常患者，都作为可以早期出院的指征。

1999年Bar-or等“发现心肌缺血发作时，人血清白蛋白(Human serurrlalbum in，(HSA)N一末端将发生改变。当其N一末端受损或铜占据的HAS称为缺血修饰白蛋白(ischemia modified album in，IMA)。近年来众多研究显示IMA是急性心肌缺血的一种理想的生化标志物。

ACB试验(钴结合实验)利用IMA结合过渡金属能力减弱的性质进行定量测定。正常对照的血清标本中白蛋白以活性形式存在，加入氯化钴溶液后，C即可与白蛋白N末端结合，溶液中存在的游离Co2浓度较低；而缺血个体的血清标本中含有较多IMA，加入同样浓度的氯化钴溶液，由于IMA与C结合的能力弱，溶液中存在较高浓度的游离。利用二硫苏糖醇(DTT)可以与游离C产生红色反应，IMA含量与颜色程度呈正比，在505rma处检测吸光度，可间接对IMA进行定量测定。

但是以往的钴结合实验特异性不强，从而造成很多假阳性结果。DTT跟蛋白形成的化合物颜色稳定时间短。反应的时间也比较慢，在自动生化仪上有时候反应难以进行。试剂的稳定性也不强。DTT很容易被氧化从而容易分解。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，提供一种提高试剂稳定性和灵敏度的检测缺血修饰性白蛋白的试剂。

本发明基于下列原理：

(1)选用有效的表面活性剂加速反应：TrionX-100、TrionX-405；

(2)为了保证试剂的稳定性，添加了特殊的保护剂，如：谷胱甘肽、氯化钾等。

本发明提供了一种检测缺血修饰性白蛋白的试剂盒，该试剂盒由下列试剂1和试剂2组成的：

试剂1：

缓冲液               10-200mmol/L

C_OCl₂                10-100mmol/L

Triton x-100         0.01-20ml/L

NaCl                 20-100mmol/L

MnCl₂                20-100mmol/L

去离子水             1L

试剂2：

Na₂HPO₄              10-200mmol/L

NaH₂PO₄              10-200mmol/L

KCl                  10-500mmol/L

DTT                  1-20g/L

谷胱甘肽             5-20g/L

去离子水             1L

proclin300(防腐剂)   0.01-0.5ml/L

所述试剂1中的缓冲液为：柠檬酸钠-乳酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液或邻苯二甲酸-盐酸；试剂1和试剂2的混合比例为3-9∶1；试剂2中的谷胱甘肽的浓度为1-10g/L；试剂2中的KCl的浓度为20-200mmol/L。

本发明的另一目的是提供了上述一种检测缺血修饰性白蛋白的试剂盒制备方法：该方法包括下列步骤：

一、配方

试剂1：

缓冲液               10-200mmol/L

C_OCl₂                10-100mmol/L

Triton x-100         0.01-20ml/L

NaCl                 20-100mmol/L

MnCl₂                20-100mmol/L

去离子水             1L

试剂2：

Na₂HPO₄              10-200mmol/L

NaH₂PO₄              10-200mmol/L

KCl                  10-500mmol/L

DTT                  1-20g/L

谷胱甘肽             5-20g/L

proclin300(防腐剂)   0.01-0.5ml/L

去离子水             1L；

二、方法：

(1)在容器一中加入试剂1配方总量80％的去离子水；

(2)向已加了去离子水的容器一中依次加入的缓冲液、C_OCl₂、Triton x-100、NaCl和MnCl₂；

(3)在容器二中加入试剂2配方总量80％的去离子水；

(4)向已加了去离子水的容器二中依次加入Na₂HPO₄、NaH₂PO₄、KCl、DTT、谷胱甘肽和proclin300；

(5)调节容器二中混合液的pH值至7.4；

(6)分别向容器一和容器二中加入试剂1和试剂2配方总量剩余20％的去离子水即制得试剂1和试剂2；

(7)将容器一和容器二中的溶液搅拌至完全溶解，制得试剂1和试剂2；

(8)将容器密封后保存。

表面活性剂(激活剂)对反应的影响

浓度	未加激活剂达到反应终点所需时间	加复合激活剂达到反应终点所需要时间
			20g/L	5min	1.8min
40g/L	13min	2.1min
			60g/L	24min	3.2min
80g/L	30min	3.9min

(2)不同保护剂对缺血修饰性白蛋白检测试剂的影响：加入10g/L的谷胱甘肽氯化钾对DTT的保护作用

时间	未加保护剂的DTT的浓度	加入10g/L的谷胱甘肽0.1mol/L氯化钾DTT的浓度
			0	100％	100％
1个月	95％	98％
			3个月	80％	95％
6个月	50％	88％
			12个月	20％	77％

上述检测结果表明本发明的试剂盒对试剂有很强的保护作用，随着时间的推移，对酶的保护作用会更明显，12个月后加保护剂的试剂跟没加保护剂的试剂相比，DTT升高57％。

本发明通过加入表面活性剂，加速了缺血修饰性白蛋白的反应，提高了灵敏度；选用保护剂，确保了试剂的稳定性，本发明的试剂盒有较好的临床应用前景。

具体实施方式：

实例1

配方

试剂1

柠檬酸钠          300mmol/L

乳酸              50mmol/L

C_OCl₂             40mmol/L

Triton x-100      5ml/L

NaCl              40mmol/L

MnCl₂             30mmol/L

去离子水          1L

试剂2

Na₂HPO₄           50mmol/L

NaH₂PO₄           20mmol/L

KCl               80mmol/L

DTT               6g/L

谷胱甘肽          8g/L

proclin300        0.5ml/L

去离子水          1L

方法：

(1)在容器一中加入0.8L的去离子水；

(2)向已加了去离子水的容器一中依次加入300mmol柠檬酸钠、50mmol的乳酸、10mmol C_OCl₂、10ml的Triton x-100、20mmol NaCl和20mmol MnCl₂；

(3)在容器二中加入0.8L的去离子水；

(4)向已加了去离子水的容器二中依次加入10mmol Na₂HPO₄、10mmolNaH₂PO₄、20mmol KCl、15gDTT、10g谷胱甘肽和0.3mlproclin300；

(5)调节容器二中混合液的pH值至7.4；

(6)分别向容器一和容器二中加入0.2L的去离子水即制得试剂1和试剂2；

(7)将容器一和容器二中的溶液搅拌至完全溶解，即制得试剂1和试剂2；

(8)将容器密封杜绝外界的氧气与试剂接触，保存。

实例2

试剂1

甘氨酸          100mmol/L

盐酸            50mmol/L

HgCl₂           50mmol/L

C_OCl₂           50mmol/L

Triton x-100    2ml/L

NaCl            40mmol/L

MnCl₂           30mmol/L

去离子水        1L

试剂2

Na₂HPO₄         50mmol/L

NaH₂PO₄         50mmol/L

KCl             80mmol/L

DTT             10g/L

谷胱甘肽        8g/L

proclin300      0.5ml/L

去离子水            1L。

制备方法同实例1。

实例3

试剂1

邻苯二甲酸          100mmol/L

盐酸                50mmol/L

C_OCl₂               50mmol/L

Triton x-100        10ml/L

NaCl                30mmol/L

MnCl₂               50mmol/L

去离子水            1L

试剂2

Na₂HPO₄             60mmol/L

NaH₂PO₄             40mmol/L

KCl                 40mmol/L

DTT                 10g/L

谷胱甘肽            10g/L

proclin300          0.5ml/L

去离子水            1L

制备方法同实例1。

实例4

试剂1

乙酸                100mmol/L

乙酸钠            100mmol/L

C_OCl₂             50mmol/L

Triton x-100      10ml/L

NaCl              50mmol/L

MnCl₂             80mmol/L

去离子水          1L

试剂2

Na₂HPO₄           60mmol/L

NaH₂PO₄           70mmol/L

KCl               80mmol/L

DTT               10g/L

谷胱甘肽          5g/L

proclin300        0.5ml/L

去离子水          1L

制备方法同实例1。

实例5

试剂1

乙酸              200mmol/L

乙酸钠            150mmol/L

C_OCl₂             30mmol/L

Triton x-100      20ml/L

NaCl              50mmol/L

MnCl₂             20mmol/L

去离子水          1L

试剂 2：

Na₂HPO₄    20mmol/L

NaH₂PO₄    30mmol/L

KCl        80mmol/L

DTT        10g/L

谷胱甘肽   5g/L

proclin300 0.5ml/L

去离子水   1L

制备方法同实例1。

Claims (2)

1.一种检测缺血修饰性白蛋白的试剂盒，其特征在于该试剂盒由下列试剂1和试剂2组成：

试剂1：

试剂2：

所述缓冲液为：柠檬酸钠-乳酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液或邻苯二甲酸-盐酸缓冲液；所述的试剂1和试剂2的混合比例为3-9∶1；所述试剂2的pH值为7.4。

2.一种权利要求1所述一种检测缺血修饰性白蛋白的试剂盒制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

一、配方：

试剂1：

试剂2：

所述缓冲液为：柠檬酸钠-乳酸缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液或邻苯二甲酸-盐酸缓冲液；所述的试剂1和试剂2的混合比例为3-9∶1；所述试剂2的pH值为7.4；

二、方法：

(1)在容器一中加入试剂1配方总量80％的去离子水；

(2)向已加了去离子水的容器一中依次加入缓冲液、COCl₂、Triton x-100、NaCl和MnCl₂；

(3)在容器二中加入试剂2配方总量80％的去离子水；

(4)向已加了去离子水的容器二中依次加入Na₂HP0₄、NaH₂PO₄、KCl、DTT、谷胱甘肽和proclin300；

(5)调节容器二中混合液的pH值至7.4；

(6)分别向容器一和容器二中加入试剂1和试剂2配方总量剩余20％的去离子水即制得试剂1和试剂2；

(7)将容器一和容器二中的溶液搅拌至完全溶解，制得试剂1和试剂2；

(8)将容器密封后保存。