CN105002263B

CN105002263B - 一种还原型辅酶复合试剂及其应用

Info

Publication number: CN105002263B
Application number: CN201510450879.4A
Authority: CN
Inventors: 岳彩琴
Original assignee: Zhongsheng Beikong Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Zhongsheng Beikong Biological Science & Technology Co Ltd
Priority date: 2015-07-28
Filing date: 2015-07-28
Publication date: 2018-02-16
Anticipated expiration: 2035-07-28
Also published as: CN105002263A

Abstract

本发明提供了一种可稳定还原型辅酶的复合试剂，所述试剂的组成成分包括：还原型辅酶、缓冲液和稳定剂；所述缓冲液选自2‑(环己胺)乙磺酸、3‑(环己胺)‑1‑丙磺酸、3‑(环己胺)‑2‑羟基‑1‑丙磺酸、N‑三(羟甲基)‑3‑氨基丙烷磺酸和3‑三羟甲基甲胺‑2‑羟基丙磺酸、三乙醇胺中的一种。本发明所提供的还原型辅酶复合试剂在2‑8℃开盖使用状态下的稳定时间可以达到15‑30天。在2‑8℃密闭避光存储过程中的稳定时间可以达到10‑15个月。

Description

一种还原型辅酶复合试剂及其应用

技术领域

本发明涉及生化检测领域，具体的，涉及一种稳定的还原型辅酶复合试剂及其应用。

背景技术

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，辅酶I)和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP，辅酶Ⅱ)，这两种辅酶都有氧化型和还原型两种形式，氧化型用NAD⁺及NADP⁺表示，还原型用NADH及NADPH表示，其分子中的吡啶环可接受[H⁺]，在脱氢酶的作用下，它们可以传递作用物分子的氢。生物体内有许多以NAD⁺或NADP⁺作为辅酶的脱氢酶，NADH和NADPH在340nm处有特异吸收峰，所以临床检验学上广泛利用NADH和NADPH的特点，作为监测生化反应的指标，用来计算被测物的浓度或者活力，例如，酶法肌酐试剂、门冬氨酸转移酶试剂、丙氨酸氨基转移酶试剂、α-羟丁酸脱氢酶试剂、乳酸脱氢酶试剂、尿素测定试剂等；此外，NADH和NADPH可以作为酶循环反应的辅酶参与反应，使反应信号循环放大，提高检测的灵敏度，例如在总胆汁酸测定技术中，Thio-NAD可以与3α-HSD一起特异性氧化胆汁酸，生成3-酮类固醇和还原性辅酶(NADH)，体系中有一定量的NADH存在时，又反向生成Thio-NAD和胆汁酸，每一次循环比原来的反应提高一倍的灵敏度，如此往复循环，从而放大微量的胆汁酸，产生大量的水溶性非染料的硫代还原型辅酶(Thio-NADH)，最后测定生成的Thio-NADH的吸光度变化，测得总胆汁酸的含量。

中国专利申请CN1179792A提供了一种保持还原型辅酶的方法，该方法是在反应体系中引入一个不干扰测定的化学反应，利用酶和底物将已氧化的辅酶还原成还原型辅酶，使得在存储过程中还原型辅酶再生，但这种催化反应速度比较慢，实施的成本比较高、某些酶不太容易获得，且加入的酶本身也存在稳定性的问题。美国专利US5278044提供了一种脂质体包裹来稳定还原型辅酶的方法，该方法主要用于药物或化妆品的制作，并不适用于临床诊断试剂。美国专利US5278044提供了用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲体系来稳定NADH的方法，该方法主要特点是pH值为9.5～11.0，其中最佳pH值为10.0～10.4之间，但在实际应用过程中过高的pH值限制了缓冲体系的选择，且很多酶在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲体中活力会受到影响，这就限制了其应用。中国专利申请CN1311335A提供的pH值为8.5～11.0，溶液中含有0.5～50mM的金属离子螯合剂的试剂；中国专利申请CN101140279A提供了一种含有缓冲液、稳定剂、有机溶剂、螯合剂和无机盐的还原型辅酶的复合稳定剂，以上两种试剂中均含有螯合剂，再加入某些酶时，可能会影响酶的稳定性而限制其应用。

现有的还原型辅酶溶液一般由还原型辅酶、金属离子螯合剂和缓冲液、无机盐及有机溶剂等组成，再加入某些酶时，存在稳定时间较短的缺陷，在2-8℃条件下储存的过程中，稳定性发生变化，这种特性导致其随着放置时间的延长试剂颜色由无色或淡黄色而逐渐变成红色，测定结果降低，在应用时影响检测结果的准确性；2-8℃开盖使用状态下，稳定性发生变化，测定结果降低，不能满足检测的要求。

因此有必要提供一种新的、稳定性好、可以与某些酶类混合使用的还原型辅酶溶液，用于临床生化试剂中。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的还原型辅酶溶液在加入某些酶时，存在的稳定时间短的缺陷，提供了一种可稳定还原型辅酶的复合试剂，所述复合试剂的组成成分包括：

还原型辅酶、缓冲液和稳定剂；其中，所述缓冲液选自由2-(环己胺)乙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-1-丙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸缓冲液、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液和三乙醇胺缓冲液所组成的组中的一种。

可选的，所述稳定剂选自由核苷酸、核苷酸衍生物、NaCl、KCl、MgCl₂、牛血清白蛋白和金属离子螯合剂所组成的组中的一种或多种。

可选的，在所述复合试剂中还原型辅酶的浓度为0.01-10g/L，优选为0.5-6g/L；缓冲液的终浓度为5-500mmol/L，优选为10-100mmol/L；稳定剂的浓度为0.5-20g/L，优选为3-10g/L。

可选的，所述缓冲液的缓冲容量为0.05-1mol/L。

可选的，所述复合试剂的pH为8.5-10.0。

可选的，所述缓冲液为2-(环己胺)乙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-1-丙磺酸缓冲液、3-(环己胺)-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸缓冲液、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液或三乙醇胺缓冲液，所述稳定剂为核苷酸、核苷酸衍生物、NaCl、KCl、MgCl₂、牛血清白蛋白、金属离子螯合剂所组成的组中的至少一种。

可选的，所述复合试剂还包括脱氢酶、牛血清白蛋白、有机溶剂、抗氧化剂、聚氧乙烯类表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。

可选的，所述脱氢酶类为乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶和3α-类固醇脱氢酶中的至少一种；所述有机溶剂为乙二醇、丙三醇和1.3-丙二醇中的至少一种；所述抗氧化剂为巯基乙醇、二硫苏糖醇和谷胱甘肽中的至少一种；所述聚氧乙烯类表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基醚和聚乙二醇对异辛基苯基醚中的至少一种；防腐剂为NaN₃和Proclin300中的至少一种。

本发明还提供了本发明所述的还原型辅酶复合试剂的应用。

可选的，所述应用包括制备总胆汁酸测定试剂、酶法肌酐试剂、门冬氨酸转移酶试剂、丙氨酸氨基转移酶试剂、α-羟丁酸脱氢酶试剂、乳酸脱氢酶试剂、尿素测定试剂。

通过上述技术方案，本发明所提供的还原型辅酶试剂，在2-8℃开盖使用状态下的稳定时间可以达到15-30天。在2-8℃密闭避光存储过程中的稳定时间可以达到10-15个月。

具体实施方式

下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

本发明提供了一种还原型辅酶复合试剂，所述复合试剂的组成成分包括：

其中，还原型辅酶和稳定剂均溶解于缓冲液中形成稳定且均一的溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液的缓冲容量为0.05-1mol/L。优选的，为了获得更好的稳定效果，缓冲液为N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)缓冲液或3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸(TAPSO)缓冲液。

可选的，所述复合试剂的pH为8.5-10.0，优选的pH为9.0-9.5。

根据本发明的复合试剂，所述稳定剂选自由核苷酸、核苷酸衍生物、NaCl、KCl、MgCl₂、牛血清白蛋白和金属离子螯合剂所组成的组中的一种或多种，优选的，为了获得最佳的稳定效果，所述稳定剂选自核苷酸和核苷酸衍生物中的至少一种。

其中，所述核苷酸和核苷酸衍生物为腺苷酸、鸟苷酸、胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、腺苷5'-二磷酸钠盐、腺苷5'-二磷酸钾盐、腺苷-3′,5′-环单磷酸钠盐、鸟苷-3′,5′-环单磷酸钠盐、鸟嘌呤核苷-5'-二磷酸二钠、胞嘧啶核苷酸二钠、尿苷二磷酸二钠等。

其中，所述金属离子螯合剂为EDTA.2Na和EDTA.2K中的至少一种。

可选的，在所述复合试剂中，还原型辅酶的浓度为0.01-10g/L，优选为0.5-6g/L；缓冲液的终浓度为5-500mmol/L，优选为10-100mmol/L；稳定剂的浓度为0.5-20g/L，优选为3-10g/L。

其中，所述缓冲液的终浓度表示利用缓冲液、还原型辅酶和稳定剂等组分配制所述复合试剂后，复合试剂中起缓冲作用的有效成分的终浓度，例如，当所述缓冲液为N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)时，缓冲液的终浓度表示配制获得的复合试剂中N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)的浓度。当缓冲液由两种或两种以上有效成分组成时，缓冲液的终浓度指代几种有效成分的总浓度。

在本发明的一种优选的实施方式中，所述缓冲液为N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)或3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸(TAPSO)，所述稳定剂为腺苷-3′,5′-环单磷酸钠盐和鸟苷-3′,5′-环单磷酸钠盐中的至少一种。

其中，所述复合试剂制备后在2-8℃开盖使用状态下的稳定时间可以达到15-30天；在2-8℃密闭避光存储过程中的稳定时间可以达到10-15个月。

可选的，所述复合试剂还包括脱氢酶、牛血清白蛋白、有机溶剂、抗氧化剂、聚氧乙烯类表面活性剂和防腐剂。

可选的，脱氢酶的浓度为1-20KU/L、牛血清白蛋白的浓度为0.5-5g/L、有机溶剂的含量为1％-20％、抗氧化剂的浓度为1-10g/L、聚氧乙烯类表面活性剂含量为1％-20％、防腐剂的浓度为0.1-2g/L。

可选的，所述脱氢酶为乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶和3α-类固醇脱氢酶中的至少一种；所述有机溶剂为乙二醇、丙三醇和1.3-丙二醇中的至少一种；所述抗氧化剂为巯基乙醇、二硫苏糖醇和谷胱甘肽中的至少一种；所述聚氧乙烯类表面活性剂为聚氧乙烯十二烷基醚和聚乙二醇对异辛基苯基醚中的至少一种；防腐剂为NaN₃和Proclin300中的至少一种。

其中，在制备本发明所提供的复合试剂时对各成分的混合顺序没有特别要求，可以直接将所述原料混合物中的各组分进行同时、分批或分步混合，只要能得到均匀的稳定相即可，优选通过搅拌使混合更加均匀。

本发明还提供了所述还原型辅酶复合试剂的应用。所述应用包括利用还原型辅酶作为还原底物的检测反应；可选的，所述应用包括制备总胆汁酸测定试剂、酶法肌酐试剂、门冬氨酸转移酶试剂、丙氨酸氨基转移酶试剂、α-羟丁酸脱氢酶试剂、乳酸脱氢酶试剂、尿素测定试剂。

在本发明的一种优选的实施方式中，当将所述试剂应用于总胆汁酸测定试剂时，缓冲液为pH8.6的N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)缓冲液；稳定剂为腺苷-3′,5′-环单磷酸钠盐；其他成分包括3α-类固醇脱氢酶、乙二醇和防腐剂NaN₃。

下面通过实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1-16

按照表1列出的组分含量将各组分混合，得到均匀的稳定相。制备NADH试剂，分别得到NADH试剂1-16。

表1

实施例1-16中，各组分的具体选择如下：

实施例1-13中，缓冲液为pH8.6的N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)缓冲液，稳定剂为腺苷-3’,5′-环单磷酸钠盐。实施例14中，缓冲液为3-(环己胺)-1-丙磺酸，稳定剂为腺苷-3′,5′-环单磷酸钠盐。实施例15中，缓冲液为N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)，稳定剂为鸟苷-3′,5′-环单磷酸钠盐。实施例1-15中，还包括浓度为12KU/L的3α-类固醇脱氢酶、10％(w/v)的乙二醇和NaN₃1g/L的防腐剂。实施例16中，按照实施例1相同的方法制备NADH试剂，不同的是，不添加乙二醇。

对比例1

按照实施例1相同的方法制备NADH试剂，不同的是，将缓冲液替换为三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，得到NADH试剂17。

对比例2

按照实施例1相同的方法制备NADH试剂，不同的是，将稳定剂替换为EDTA.2Na，得到NADH试剂18。

测试例1

本测试例测定NADH试剂1-18的稳定性。测试NADH试剂1-18在8℃开盖使用状态下的稳定时间以及在8℃度密闭避光存储过程中的稳定时间。

稳定时间的评价方法为：试剂8℃开盖使用状态下,30天之内，每天测定一次，每次重复三次，取平均值；计算每次测定结果的均值与初期测定结果的相对偏差。

试剂8℃度密闭避光存储过程中，在15个月的保存期内，每月测定一次，每次重复三次，取平均值；计算每次测定结果的均值与初期测定结果的相对偏差。利用分光光度法进行测定，测试在340nm波长下的吸光度，当吸光度的相对偏差小于15％时判定为稳定，否则判定为不稳定。结果列于表2。

表2

测试例2

测试例2用于说明实施例1和对比例1-2中制备获得的NADH试剂在总胆汁酸测定时的稳定性。

1)试剂配制：按照表3所示，配制总胆汁酸测定试剂A；试剂B为实施例1和对比例1-2中制备获得的NADH试剂1、17、18。

结果列于表4。

表3

成份	用量
		Thio-NAD	0.85g/L
pH3.82-N-吗啡乙磺酸(MES)缓冲液	10mM
		Brij35	5％
EDTA.2Na	0.5mM
		草氨酸钠	2mM

2)检测方法：采用具有双试剂功能的自动生化分析仪(光径1cm、测试温度37℃、主波长405nm、副波长660nm)，用纯化水和校准品进行校准，按照样本：试剂A：试剂B＝3μL：210μL：70μL的方式加样，加入试剂B 1分钟后，读取2～4分钟的吸光度值，测定质控品。

3)测试时间和稳定性评价方式：试剂8℃开盖使用状态下,30天之内，每天测定质控品一次，每次重复三次，取平均值；计算每次测定结果的均值与初期测定结果的相对偏差，相对偏差小于±15％判定为稳定。试剂8℃度密闭避光存储过程中，在15个月的保存期内，每月测定质控品一次，每次重复三次，取平均值；计算每次测定结果的均值与初期测定结果的相对偏差，相对偏差应小于±15％判定为稳定。

表4

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种还原型辅酶复合试剂，所述复合试剂由以下成分组成：

NADH 5g/L、pH8.6的N-三(羟甲基)-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)缓冲液50mmol/L、腺苷-3’,5′-环单磷酸钠盐5g/L、浓度为12KU/L的3α-类固醇脱氢酶、10％(w/v)的乙二醇和NaN₃ 1g/L。

2.权利要求1所述的还原型辅酶复合试剂的应用，其特征在于，所述应用包括制备总胆汁酸测定试剂、酶法肌酐试剂、门冬氨酸转移酶试剂、丙氨酸氨基转移酶试剂、α-羟丁酸脱氢酶试剂、乳酸脱氢酶试剂、尿素测定试剂。