CN109557322A - 一种缺血修饰白蛋白校准品及其应用 - Google Patents

一种缺血修饰白蛋白校准品及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种缺血修饰白蛋白校准品及其应用，所述校准品包括水平试剂1和水平试剂2，其中，所述水平试剂1和水平试剂2的原料都包括乙二胺四乙酸二钠、叠氮钠、氯化钠和3‑(N‑玛琳代)丙磺酸；本发明通过缺血修饰白蛋白的反应原理，建立新的方法学，利用EDTA等螯合剂来配置校准品以达到目的，放弃了传统的校准配方；全新的配方较之传统方法学高效稳定且配置简易，同时降低了成本，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

Description

一种缺血修饰白蛋白校准品及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种缺血修饰白蛋白校准品及其应用。
背景技术
心肌缺血是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。心肌缺血时，人血清白蛋白通过缺血部位时，由于自由基等破坏了血清白蛋白的氨基酸序列(其氨基末端被修饰)，这种N-末端被损害/被铜占据的白蛋白称为缺血修饰白蛋白(Ischemia-modified albumin,IMA)，其特点是N-末端和钴等过渡金属离子的结合率下降。
缺血修饰白蛋白(IMA)是一种新的较为理想的缺血标志物，它是利用白蛋白-钴结合试验检测缺血修饰白蛋白含量，作为检测早期心肌缺血的指标。IMA可敏感的反映心肌缺血状况，在急性冠状动脉综合征的早期诊断、危险分层、指导治疗等方面有重要意义，是目前较为理想的检测心肌缺血的生化标志物。其原理为：利用缺血修饰白蛋白(IMA)的反应原理，即血清中白蛋白与Co2+结合后剩余的Co2+与二硫苏糖醇(DTT)反应生成红色配合物来测定反应物。
目前，IMA测定一般利用正常人血清中白蛋白能与Co2+结合而缺血修饰白蛋白与Co2+结合能力减弱的特性，采用白蛋白-钴结合试验(ACB)进行。正常人白蛋白以活性形式存在，加入钴试剂后，Co2+与人血清白蛋白N-末端结合，溶液中游离Co2+浓度下降，心肌缺血病人血清标本中含有大量的IMA，加入同等量的钴试剂后，由于IMA与Co2+的结合能力下降，溶液中存在较多量的游离Co2+，加入二硫苏糖醇(DTT)试剂后，游离钴可与二硫苏糖醇反应，产生棕红色化合物。游离钴含量越高，颜色欲深，用分光光度计测定吸光度值大小，从而间接表示血清中IMA含量。
通过修饰白蛋白来测定人体缺血修饰白蛋白的含量达到诊断效果。然而缺血修饰白蛋白试剂盒校准品利用传统方法不易获得，也就是这个校准品所面临的直接问题。CN200610031746.4公开了一种缺血修饰白蛋白组合测定试剂及其使用方法，该组合测定试剂采用如下原料和工艺制得。氯化钴试剂，其成分是：0.001-1％的氯化钴，99-99.999％的盐酸三乙醇胺缓冲液。二硫苏糖醇试剂，其成分是：0.01-2％的二硫苏糖醇，98-99.99％的水。该组合测定试剂的使用方法是为下述步骤：1)仪器准备；2)试剂准备；3)测定进行：准确吸取蒸馏水、血清标本及标准品，与试剂1共聚。然后在设定范围波长下比色，读取光密度A1，加入试剂2反应，再比色，读取光密度A2，依据读得数据计算测定结果。但该发明的标准品制备步骤繁琐复杂，不易推广应用。
因此，研发一种更为高效稳定且配制简易的新型校准品，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种缺血修饰白蛋白校准品及其应用，所述校准品通过缺血修饰白蛋白的反应原理，建立新的方法学，利用EDTA等螯合剂来配置校准品以达到目的，放弃了传统的校准配方；全新的配方较之传统方法学高效稳定且配置简易，同时降低了成本，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种缺血修饰白蛋白校准品，所述校准品包括水平试剂1和水平试剂2，其中，所述水平试剂1和水平试剂2的原料都包括乙二胺四乙酸二钠、叠氮钠、氯化钠和3-(N-玛琳代)丙磺酸。
即水平试剂1的原料包括乙二胺四乙酸二钠、叠氮钠、氯化钠和3-(N-玛琳代)丙磺酸；水平试剂2的原料包括乙二胺四乙酸二钠、叠氮钠、氯化钠和3-(N-玛琳代)丙磺酸。
本发明中，发明人在长期生产实践过程中，深入调研现有技术制备缺血修饰白蛋白校准品的优缺点，为克服传统校准品制备工艺复杂，成本高昂，产品不稳定等缺点，基于血清白蛋白与钴离子的反应原理，建立新的方法学，利用EDTA等螯合剂替换与钴离子反应的血清白蛋白，配置校准品以达到目的，放弃了传统的校准配方，筛选校准品原料的活性组分，优化各组分的配比浓度，各组分各浓度协同增效，匹配完整的实验体系，最终成功制得稳定高效便捷的校准品，实验验证结果准确可靠，全新的配方较之传统方法学高效稳定且配置简易，同时降低了成本。
优选地，所述叠氮钠的浓度为0.8-1.2g/L，例如可以是0.8g/L、0.9g/L、1.0g/L、1.1g/L或1.2g/L。
优选地，所述氯化钠的浓度为0.7-1.1％，例如可以是0.7％、0.8％、0.9％、1.0％或1.1％。
优选地，所述3-(N-玛琳代)丙磺酸的浓度为8-12nM，例如可以是8nM、9nM、10nM、11nM或12nM。
优选地，所述水平试剂1和水平试剂2的原料还包括甘油。
优选地，所述甘油的浓度为0.04-0.06％，例如可以是0.04％、0.05％或0.06％。
优选地，所述水平试剂1中乙二胺四乙酸二钠的浓度为2-10mM，例如可以是2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM。
优选地，所述水平试剂2中乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.1-5mM，例如可以是0.1mM、1mM、2mM、3mM、4mM或5mM。
作为优选技术方案，本发明提供一种缺血修饰白蛋白校准品，所述校准品包括水平试剂1和水平试剂2；
其中，所述水平试剂1包括：0.8-1.2g/L的叠氮钠、0.7-1.1％的氯化钠、8-12nM的3-(N-玛琳代)丙磺酸、0.04-0.06％的甘油和2-10Mm的乙二胺四乙酸二钠；
所述水平试剂2包括0.8-1.2g/L的叠氮钠、0.7-1.1％的氯化钠、8-12nM的3-(N-玛琳代)丙磺酸、0.04-0.06％的甘油和0.1-5mM的乙二胺四乙酸二钠。
第二方面，本发明提供一种检测缺血修饰白蛋白的方法，所述方法采用乙二胺四乙酸二钠作为校准品的主要原料，利用EDTA与钴离子的络合反应代替了原来的反应，与EDTA反应剩余的钴离子与DTT反应生成红色配合物的原理计算IMA的含量，替代了缺血修饰白蛋白为主要原料的校准品，通过溯源为以EDTA的校准品赋值达到校准作用。
第三方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的校准品。
优选地，所述试剂盒还包括试剂R1和试剂R2；
其中，试剂R1的组分包括氯化钴和表面活性剂；
试剂R2的组分包括二硫苏糖醇。
其中，所述试剂R1还包括防腐剂，所述试剂R2还包括防腐剂。
所述试剂R1的氯化钴的浓度为5.0mM/L。
所述试剂R2的二硫苏糖醇的浓度为50mM/L。
第四方面，本发明提供一种如权第一方面所述的校准品和/或第三方面所述的试剂盒用于检测缺血修饰白蛋白的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的校准品高效稳定且配置简易，检测结果准确可靠，降低了成本，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
附图说明
图1是本发明的血清比对图；
图2是本发明的溯源性流程原理图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1
校准品水平试剂1的配方如表1：
表1
原料名称 每升含量
叠氮钠 1g
乙二胺四乙酸二钠.2H<sub>2</sub>O 8mM
NaCl 0.9％
Mops 10mM
甘油 0.05％
校准品水平试剂2的配方如表2：
表2
实施例2
校准品水平试剂1的配方如表3：
表3
原料名称 每升含量
叠氮钠 0.8g
乙二胺四乙酸二钠.2H<sub>2</sub>O 2mM
NaCl 0.7％
Mops 8mM
甘油 0.04％
校准品水平试剂2的配方如表4：
表4
原料名称 每升含量
叠氮钠 0.8g
乙二胺四乙酸二钠.2H<sub>2</sub>O 0.1mM
NaCl 0.7％
Mops 8mM
甘油 0.04％
实施例3
校准品水平试剂1的配方如表5：
表5
原料名称 每升含量
叠氮钠 1.2g
乙二胺四乙酸二钠.2H<sub>2</sub>O 10mM
NaCl 1.1％
Mops 12mM
甘油 0.06％
校准品水平试剂2的配方如表6：
表6
原料名称 每升含量
叠氮钠 1.2g
乙二胺四乙酸二钠.2H<sub>2</sub>O 5mM
NaCl 1.1％
Mops 12mM
甘油 0.06％
对比例1
与实施例1相比，除了不添加叠氮钠外，其他条件与实施例1相同。
对比例2
与实施例1相比，除了不添加氯化钠外，其他条件与实施例1相同。
对比例3
与实施例1相比，除了不添加3-(N-玛琳代)丙磺酸外，其他条件与实施例1相同。
对比例4
与实施例1相比，除了叠氮钠的添加量改为2g/L外，其他条件与实施例1相同。
对比例5
与实施例1相比，除了氯化钠的添加量改为2％外，其他条件与实施例1相同。
对比例6
与实施例1相比，除了3-(N-玛琳代)丙磺酸的添加量改为15nM外，其他条件与实施例1相同。
实验检测
(1)传统缺血修饰白蛋白校准品，作用原理及配方如下：
原理：样品中白蛋白与钴离子结合后，加入显色剂与剩余的游离钴离子反应，生成红褐色产物，通过与同样处理的缺血修饰白蛋白校准品进行比较，即可计算出样品中的IMA的含量。
配方：
表7
(2)将本申请的校准品与传统缺血修饰白蛋白校准品试剂盒进行溯源，流程原理图见图2
用北京九强生物技术有限公司的IMA试剂盒及其配套的校准质控为本申请的工作校准品(即内部校准品)定值(测试30次取平均值)，后使用该已赋值完成的工作校准品(内部校准品)为本申请的试剂R1和R2进行校准定标，利用该测量系统测定本申请的产品校准品(即本申请的水平试剂2)30次即为溯源赋值，(校准品水平试剂1为零点)，试剂R1与R2的供应商：浙江蓝怡医药有限公司。
内部校准品即工作校准品：是酶校准品及准确性的传递物，酶校准品及准确性的传递的工作校准品(Working Calibrator)：能准确的从有证参考物质传递给原级，一种物质配制于适宜的基质中的校准品；再从原级校准品传递给工成单项或多项的校准品。
表8九强检测系统测定30次工作校准品(即内部校准品)
表9工作校准品为本申请的试剂R1和R2校准定标后测试30次产品校准品
(3)测定条件(以日立7180为例)：
采用实施例1制得的校准品与试剂R1\R2组装为试剂盒，进行检测，与九强试剂盒进行比较；
分析方法：两点终点法；测定温度：37℃；比色杯光径1.0cm；波长600nm(主)/800nm(副)；样品量：24.0微升；试剂R1：180微升；试剂R2：60微升；反应方向：上升；试剂R1与R2的供应商：浙江蓝怡医药有限公司；
操作步骤：
加入24.0微升空白/标准/样本；
加入180微升试剂R1；
混匀，37℃孵育5分钟，相对于空白读取吸光度值A1；
加入60微升试剂R2
混匀，5分钟后相对于空白读取吸光度值A2。
结果见如下表10和图1；
表10血清比对数据(利用各自测量系统测定同一份血清数据)
TEST 九强U/L 本申请U/L
TEST 1 20.4 19.8
TEST 2 42.3 41.4
TEST 3 37.5 37.6
TEST 4 41.6 41.1
TEST 5 33.4 32.6
TEST 6 52.5 51.8
TEST 7 63.8 63.5
TEST 8 66.5 66
TEST 9 37.4 38
TEST 10 55.6 54.9
平均值 45.10 44.67
实施例2和实施例3的检测数据与实施例1基本一致，在此不再赘述。
由表10可知，本申请提供的校准品组装成试剂盒对血清的检测结果与市售试剂盒基本一致，证明本申请提供的校准品及应用准确可靠。
采用实施例1和对比例1-6的校准品对同一份血清数据进行检测，结果见表11，单位为U/L；
表11
实施例1 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5 对比例6
44.67 32.52 31.43 36.21 38.27 49.31 49.87
由表11可知，对比例1-3制得的校准品与本申请的技术方案相比缺少组分，对比例4-6制得的校准品与本申请的技术方案相比组分添加量超范围，其检测结果均不稳定，无法实现样品的检测和应用。
综上所述，本发明提供的校准品性能稳定，与市售商品化试剂盒检测结果基本一致，但配置简单，检测结果准确可靠，重复性好，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种缺血修饰白蛋白校准品，其特征在于，所述校准品包括水平试剂1和水平试剂2，其中，所述水平试剂1和水平试剂2的原料都包括乙二胺四乙酸二钠、叠氮钠、氯化钠和3-(N-玛琳代)丙磺酸。
2.根据权利要求1所述的校准品，其特征在于，所述叠氮钠的浓度为0.8-1.2g/L。
3.根据权利要求1或2所述的校准品，其特征在于，所述氯化钠的浓度为0.7-1.1％。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的校准品，其特征在于，所述3-(N-玛琳代)丙磺酸的浓度为8-12nM。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的校准品，其特征在于，所述水平试剂1的原料还包括甘油，水平试剂2的原料还包括甘油；
优选地，所述甘油的浓度为0.04-0.06％。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的校准品，其特征在于，所述水平试剂1中乙二胺四乙酸二钠的浓度为2-10Mm；
优选地，所述水平试剂2中乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.1-5mM。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的校准品，其特征在于，所述校准品包括水平试剂1和水平试剂2；
其中，所述水平试剂1包括：0.8-1.2g/L的叠氮钠、0.7-1.1％的氯化钠、8-12nM的3-(N-玛琳代)丙磺酸、0.04-0.06％的甘油和2-10Mm的乙二胺四乙酸二钠；
所述水平试剂2包括0.8-1.2g/L的叠氮钠、0.7-1.1％的氯化钠、8-12nM的3-(N-玛琳代)丙磺酸、0.04-0.06％的甘油和0.1-5mM的乙二胺四乙酸二钠。
8.一种检测缺血修饰白蛋白的方法，其特征在于，所述方法采用乙二胺四乙酸二钠作为校准品的主要原料。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-7中任一项所述的校准品；
优选地，所述试剂盒还包括试剂R1和试剂R2；
其中，试剂R1的组分包括氯化钴和表面活性剂；
试剂R2的组分包括二硫苏糖醇。
10.一种如权利要求1-7中任一项所述的校准品和/或权利要求9所述的试剂盒用于检测缺血修饰白蛋白的应用。
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