CN105238848A - 一种α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种α-L-岩藻糖苷酶含量检测试剂盒，由独立的试剂1和试剂2组成，其中试剂1的组分包括缓冲剂、防腐剂、金属离子螯合剂、稳定剂和水；试剂2的组分包括缓冲剂、防腐剂、酶作用底物、表面活性剂、稳定剂和水。制备方法为：(1)制备试剂1：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，调节pH至6.5-8.5之间，定容；(2)制备试剂2：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，调节pH至6.5-8.5之间，定容；(3)将试剂1和试剂2单独分装，密封。本发明的检测试剂盒具有稳定性好，精确度高，线性测试范围宽，重复性好，抗干扰性强等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种人体血清中α-L-岩藻糖苷酶检测试剂及其制备方法，属于血清样本中α-L-岩藻糖苷酶含量检测的技术领域。
背景技术
α-L-岩藻糖苷酶(α-L-Fucosidase，AFU)是一种溶酶体酸性水解酶，广泛分布于人体内的各种组织、细胞及体液中。1977年Bauer等在动物实验中观察到Morris鼠肝癌组织中AFU活力较正常肝脏高7倍，且与肿瘤生长期有关。1980年法国学者Dcugnier等首先在3例原发性肝癌血清中发现AFU活性升高，并提出把AFU作为诊断肝癌的一种新的标志酶，并被后来的众多研究所证实。近年来，AFU检测的方法学研究及其他肿瘤或非肿瘤性疾病的血清AFU水平变化的研究也日益增多。
随着AFU研究的日益增多，AFU检测方法学和产品也在不断的丰富和完善，目前AFU的测定方法学主要有荧光法、比色法和速率法，各种检测方法各有优势。其中，荧光法是利用AFU水解4-甲基伞型酮α-L-岩藻吡喃糖苷释放4-甲基伞型酮，用碱性缓冲液终止反应，并使产物呈现荧光，用360nm或365nm激发波长和400nm或448nm发射波长检测荧光强度，对照不同浓度4-甲基伞型酮制备的标准曲线求酶的活性。此法敏感性高，适用范围广，但是该检测方法对配套的仪器要求很高，不适合用于自动化检测。其中，终点比色法也是近几年新兴的检测方法，他是以对硝基苯酚α-L-岩藻糖苷为底物，在AFU催化下生成α-L-岩藻糖苷和对硝基苯酚，对硝基苯酚在碱性溶液中呈黄色。用分光光度计在405nm波长下比色，即可得出AFU的含量，本检测方法反应时间较长，且操作繁琐，干扰因素较多，因此也不适用于自动化检测。速率法是最近应用最普遍的检测方法，他是利用血清样本中AFU催化2-氯-对硝基酚α-L-岩藻吡喃糖苷(CNP-F)水解生成2-氯-对硝基酚(CNP)，在405nm或410nm波长下监测CNP生成速率，计算出AFU活性。该检测方法操作简便，测定时间短，且灵敏度和抗干扰性能都很好，采用该方法学制备出来的检测试剂盒适用于各种类型的生化分析仪。
随着AFU检测方法学的不断改进和完善，目前已经出现一些适用于AFU检测的诊断试剂盒出现，但是这些检测试剂盒会存在一些检测方面的问题，比如抗干扰性能、特异性、准确性等方面的问题，因此亟待开发一种AFU检测试剂盒，能满足检验医学的各项需求。
发明内容
本发明的目的之一是为了克服以上的技术缺陷提供一种性能优良的α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒。
本发明的目的之二是为了提供一种性能优良的α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒的制备方法。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
一种α-L-岩藻糖苷酶含量检测试剂盒，由独立的试剂1和试剂2组成，其中试剂1的组分包括缓冲剂、防腐剂、金属离子螯合剂、稳定剂和水；试剂2的组分包括缓冲剂、防腐剂、酶作用底物、表面活性剂、稳定剂和水。
进一步地，所述的缓冲剂为：三羟甲基甲胺基乙磺酸、2-(N-吗啡啉)乙磺酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸、三羟甲基甲胺基丙磺酸或哌嗪-1,4-二羟基丙磺酸。
进一步地，所述的防腐剂为咪唑烷基脲。
进一步地，所述的稳定剂为氯化钠。
进一步地，所述的金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸二钠，氨基三乙酸或二亚乙基三胺五乙酸及其盐。
进一步地，所述的酶作用的底物为MG-2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷。
进一步地，所述的表面活性剂为曲拉通X-100或乙基苯基聚乙二醇。
进一步地，每1升试剂1中各组分的含量为：缓冲剂2-80g，防腐剂0.1-10g，金属离子螯合剂0.5-10g，稳定剂0.1-8g；每1升试剂2中各组分的含量优选为：缓冲剂2-80g，防腐剂0.1-10g，酶作用底物0.5-10g，表面活性剂0.1-5ml，稳定剂0.1-8g；
进一步地，每1升试剂1中各组分的含量为：缓冲剂5-40g，防腐剂0.75-5g，金属离子螯合剂0.8-4g，稳定剂1-5g；每1升试剂2中各组分的含量为：缓冲剂5-40g，防腐剂0.75-5g，酶作用底物2-5g，表面活性剂1-3ml，稳定剂1-5g。
上述的试剂盒的制备方法，(1)制备试剂1：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，用1mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至6.5-8.5之间，然后用蒸馏水或双蒸水定容至1L；(2)制备试剂2：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，用1mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至6.5-8.5之间，然后用蒸馏水或双蒸水定容至1L；(3)将试剂1和试剂2单独分装，密封，即得。
本发明提供的一种α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒，采用液体双试剂模式，有效地避免了非特异性反应的干扰，同时可以最大限度减少来自样本本身浊度的干扰，保证了测定结果的稳定可靠，具有稳定性好，精确度高，线性测试范围宽，重复性好，抗干扰性强等优点。
附图说明
图1是本发明实施例1提供的试剂盒与购自德国AutecDiagnostica公司的检测试剂盒的检测结果图。
具体实施方式
本发明的检测试剂盒以MG-2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷(MG-CNPF)为底物，利用MG-CNPF在反应体系中的灵敏度、精密度、抗干扰及有利于试剂稳定的特点，一定程度的提高检测试剂盒的性能，同时通过与其他试剂组分的配比组合，进一步的优化和提升试剂的性能。本发明的检测试剂盒有两种组分，分别为试剂1和试剂2，这种液体双试剂组合，有利于样本的充分稀释溶解、稀释，同时也能有利于样本中的AFU与底物MG-CNPF充分接触并发生良好的反应，并能一定程度的避免血液样本中的各项杂质对检测结果的干扰，具体的试剂盒的组分及配比如下：
一种α-L-岩藻糖苷酶含量检测试剂盒，该检测试剂盒由独立的试剂1和试剂2组成，其中试剂1的组分包括缓冲剂、防腐剂、金属离子螯合剂、稳定剂和水；试剂2的组分包括缓冲剂、防腐剂、酶作用底物(MG-CNPF)、表面活性剂、稳定剂和水。
为了达到更好的检测效果，本发明检测试剂盒中，每1升试剂1中各组分的含量优选为：缓冲剂2-80g，防腐剂0.1-10g，金属离子螯合剂0.5-10g，稳定剂0.1-8g；
进一步优选的，每1升试剂1中各组分的含量优选为：缓冲剂5-40g，防腐剂0.75-5g，金属离子螯合剂0.8-4g，稳定剂1-5g；
最优选的，每1升试剂1中各组分的含量为：缓冲剂23g，防腐剂2.6g，金属离子螯合剂2g，稳定剂2g。
每1升试剂2中各组分的含量优选为：缓冲剂2-80g，防腐剂0.1-10g，酶作用底物0.5-10g，表面活性剂0.1-5ml，稳定剂0.1-8g；
进一步优选的，每1升试剂2中各组分的含量优选为：缓冲剂5-40g，防腐剂0.75-5g，酶作用底物2-5g，表面活性剂1-3ml，稳定剂1-5g；
最优选的，每1升试剂2中各组分的含量优选为：缓冲剂23g，防腐剂2.6g，酶作用底物3g，表面活性剂2ml，稳定剂2g；
本发明检测试剂盒中试剂1或试剂2所述的缓冲剂是能够维持反应体系在一定酸碱度范围的物质，例如：三羟甲基甲胺基乙磺酸(TES)、2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸(HEPES)、三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)、哌嗪-1,4-二羟基丙磺酸(POPSO)等，为了达到更好的检测效果，本发明所用的缓冲剂为2-(N-吗啡啉)乙磺酸，该缓冲液的优点在于它不参加和不干扰生物化学反应过程，对酶催化反应等无抑制作用，是用于酶功能研究很好的缓冲剂。
本发明检测试剂盒中试剂1和试剂2所述的防腐剂主要是为了防止细菌滋生导致的产品变质，所以任何一种能起到防止细菌滋生作用的防腐剂均能适用于本发明，优选的，本发明试剂1和试剂2中所述的防腐剂为咪唑烷基脲。
本发明检测试剂盒中试剂1和试剂2所述的稳定剂主要是为了维持反应体系的稳定性，本发明通过研究发现在反应试剂中加入一定量的氯化钠有助于维持反应体系的稳定性，因此，本发明的试剂1和试剂2优选氯化钠作为本发明的稳定剂。
本发明检测试剂盒中试剂1中所述的金属离子螯合剂能够络合检测样本中的二价金属离子，以减少二价金属离子造成的干扰；因此能够络合二价金属离子的各种金属离子络合物均能够适用于作为试剂Ⅰ中所述的金属离子络合物，例如：乙二胺四乙酸二钠，氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸及其盐等，本发明优选乙二胺四乙酸二钠(EDTA)作为试剂Ⅰ中所述的金属离子络合物。
本发明检测试剂盒中试剂2中所述的酶作用的底物为MG-2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷，本发明采用MG-2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷(CNPF)作为酶作用的底物，由于AFU催化CNPF释放2-氯-4-硝基苯酚(CNP)，后者呈色的PH范围颇宽，在AFU最适应的PH条件下，仍可呈现明显黄色，引起405nm～410nm处吸光度升高；连续监测吸光度的升高速率，可计算出样品中AFU活性。此外，采用该作用底物在反应的特异性和灵敏度方面更有优势，有利于提高试剂检测的准确性和精密度。
本发明检测试剂盒中试剂2中所述的表面活性剂主要起到促进检测样本中各物质的溶解，达到减少样本浊度对测定结果的影响的目的；因此，现有的具有增溶性质的表面活性剂都可作为试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的表面活性剂，例如，曲拉通X-100、乙基苯基聚乙二醇等，本发明检测试剂盒中优选曲拉通X-100作为表面活性剂。
本发明检测试剂盒中所用到的每种组分均能通过商业途径从生物试剂公司或医药公司购买得到。
本发明的另外一个目的是提供一种制备α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒的方法，包括：
(1)制备试剂1：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，用1mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至6.5-8.5之间，然后用蒸馏水或双蒸水定容至1L；(2)制备试剂2：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，用1mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至6.5-8.5之间，然后用蒸馏水或双蒸水定容至1L；(3)将试剂Ⅰ和试剂Ⅱ单独分装，密封，即得。
采用本发明制备的检测试剂盒其基本的实验参数如下：
本发明检测试剂盒在生化仪上的基本操作流程如下所述：
混匀后，37℃恒温90秒后测定初始吸光度，然后再180秒内准确测定平均每分钟吸光度变化率ΔA/min。
本发明检测试剂盒在检测过程中不需要对样本进行预稀释，方便临床使用，操作简单、快速，适用于全自动生化分析仪，具有较大的临床实用价值。其中最有优势的是本发明检测试剂盒中所选用的底物，在本发明检测试剂盒中选用MG-2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷(CNPF)作为酶作用的底物，由于AFU催化CNPF释放2-氯-4-硝基苯酚(CNP)，后者呈色的PH范围颇宽，在AFU最适应的PH条件下，仍可呈现明显黄色，引起405nm～410nm处吸光度升高；连续监测吸光度的升高速率，可计算出样品中AFU活性。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒的制备：
1、试剂1的制备：
按所述用量取各组分：
将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，用1mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至6.5-8.5之间，然后用蒸馏水或双蒸水定容至1L。
2、试剂2的制备：
按所述用量取各组分：
将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，用1mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至6.5-8.5之间，然后用蒸馏水或双蒸水定容至1L。
实施例2α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒的制备：
1、试剂1的制备：
按所述用量取各组分：
将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，用1mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至6.5-8.5之间，然后用蒸馏水或双蒸水定容至1L。
2、试剂2的制备：
按所述用量取各组分：
将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，用1mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至6.5-8.5之间，然后用蒸馏水或双蒸水定容至1L。
实施例3α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒的制备：
1、试剂1的制备：
按所述用量取各组分：
将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，用1mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至6.5-8.5之间，然后用蒸馏水或双蒸水定容至1L。
2、试剂2的制备：
按所述用量取各组分：
将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，用1mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至6.5-8.5之间，然后用蒸馏水或双蒸水定容至1L。
实施例4α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒的制备：
1、试剂1的制备：
按所述用量取各组分：
将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，用1mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至6.5-8.5之间，然后用蒸馏水或双蒸水定容至1L。
2、试剂2的制备：
按所述用量取各组分：
将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，用1mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至6.5-8.5之间，然后用蒸馏水或双蒸水定容至1L。
各种不同含量配比的试剂盒工艺一致，试剂1和试剂2中各组分的用量参照发明内容中的范围进行选定。
本发明检测试剂盒具体测定方法为液体双试剂操作，其中液体双试剂在生化仪上的基本实验参数可基本操作流程分别如下所述：
基本的实验参数如下：
基本操作流程如下：
混匀后，37℃恒温90秒后测定初始吸光度，然后再180秒内准确测定平均每分钟吸光度变化率ΔA/min。
采用本发明制备的检测试剂盒，其样本中α-L-岩藻糖苷酶含量计算如下：根据两点校准品浓度和对应吸光度变化率ΔA/min，采用两点线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。
试验例1本发明检测试剂盒与进口试剂盒测值的相关性实验
1、供试试剂盒
(1)本发明实施例1所制备的试剂盒。
(2)对照试剂盒：α-L-岩藻糖苷酶测定试剂盒(CNPF法)，德国AutecDiagnostica公司生产。
2、试验方法及结果
通过用本发明实施例1所制备的试剂盒与购自德国AutecDiagnostica公司的检测试剂盒测定对46例新鲜血清样本中α-L-岩藻糖苷酶活性的测定结果进行比较，试验结果为图1所示，并进行回归分析。从图1中可以看出本发明试剂盒与德国AutecDiagnostica公司生产的试剂盒在测定血清样本中α-L-岩藻糖苷酶活性方面有良好的相关性。
试验例2本发明检测试剂盒的灵敏度试验
以生理盐水为空白样本，用实施例1所制备的检测试剂盒重复测定20次，计算结果均值为0.0002，标准差S为0.00026，根据以空白均值加上两倍标准差的方法计算吸光度变化0.00072，用稀释后酶活力分别为0.5U/L、1U/L和2U/L的α-L-岩藻糖苷酶校准品溶液测定，其吸光度变化范围为0.0004、0.0007和0.0015，其中1U/L的α-L-岩藻糖苷酶校准品吸光度变化值与空白测值的计算结果0.00072最接近，因此本发明检测试剂盒检测α-L-岩藻糖苷酶的灵敏度可达到1U/L，适合低值样本的检测应用。试验例3本发明各实施例所制备的检测试剂盒精密度试验
选取测定浓度为15-40U/L之间的血清，用本发明的实施例1、2、3和4制备的AFU检测试剂盒进行试剂盒精密度实验，每个试剂盒对同一个血清样本进行10次的重复测定，具体的结果如下表1所示。从表1中的实验结果可知，本发明实施例制备的检测试剂盒1、2、3和4的精密度结果如下表所示，其中实施例1制备的检测试剂盒性能最优良。
表1本发明实施例制备的检测试剂盒精密度结果
Claims (10)
1.一种α-L-岩藻糖苷酶含量检测试剂盒，其特征在于：由独立的试剂1和试剂2组成，其中试剂1的组分包括缓冲剂、防腐剂、金属离子螯合剂、稳定剂和水；试剂2的组分包括缓冲剂、防腐剂、酶作用底物、表面活性剂、稳定剂和水。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的缓冲剂为：三羟甲基甲胺基乙磺酸、2-(N-吗啡啉)乙磺酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸、三羟甲基甲胺基丙磺酸或哌嗪-1,4-二羟基丙磺酸。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的防腐剂为咪唑烷基脲。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的稳定剂为氯化钠。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸二钠，氨基三乙酸或二亚乙基三胺五乙酸及其盐。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的酶作用的底物为MG-2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的表面活性剂为曲拉通X-100或乙基苯基聚乙二醇。
8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：每1升试剂1中各组分的含量为：缓冲剂2-80g，防腐剂0.1-10g，金属离子螯合剂0.5-10g，稳定剂0.1-8g；每1升试剂2中各组分的含量优选为：缓冲剂2-80g，防腐剂0.1-10g，酶作用底物0.5-10g，表面活性剂0.1-5ml，稳定剂0.1-8g。
9.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：每1升试剂1中各组分的含量为：缓冲剂5-40g，防腐剂0.75-5g，金属离子螯合剂0.8-4g，稳定剂1-5g；每1升试剂2中各组分的含量为：缓冲剂5-40g，防腐剂0.75-5g，酶作用底物2-5g，表面活性剂1-3ml，稳定剂1-5g。
10.权利要求1所述的试剂盒的制备方法，其特征在于：(1)制备试剂1：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，用1mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至6.5-8.5之间，然后用蒸馏水或双蒸水定容至1L；(2)制备试剂2：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，用1mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至6.5-8.5之间，然后用蒸馏水或双蒸水定容至1L；(3)将试剂1和试剂2单独分装，密封，即得。
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