CN106018366B - 一种荧光dna-银纳米簇及其制备方法以及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种荧光DNA‑银纳米簇及其制备方法以及应用，荧光DNA‑银纳米簇，粒径为2‑10nm；肉眼观察其水溶液显浅粉色，在360nm紫外灯照射下呈亮红色；用530nm激发波长激发，发射波长为570‑800nm，在618nm处得到较大荧光发射强度，以罗丹明B为参照物，荧光量子产率为35.3％，用荧光DNA‑银纳米簇检测铜离子和焦磷酸根离子的方法，包括以下步骤：(1)绘制相应离子的响应标准曲线并获得线性回归方程式，(2)检测，将检测到的荧光强度代入线性回归方程式中，得铜离子或焦磷酸根离子的浓度；本发明的荧光DNA‑银纳米簇具有性能稳定、绿色环保的优点，检测方法快速简单、检测灵敏度好。

Description

一种荧光DNA-银纳米簇及其制备方法以及应用

技术领域

本发明涉及分析检测领域，特别涉及一种荧光DNA-银纳米簇及其制备方法以及应用。

背景技术

作为一种重要的生物功能阴离子，焦磷酸根(pyrophosphate,PPi)在生命科学、环境科学、药物领域和化学过程等方面起着非常重要的作用。PPi是一种在生物体内具有重要生理功能的阴离子,在健康个体的生理浓度大约是3mmol/L。作为活细胞中三磷酸腺苷水解的产物，PPi参与生物体中诸多新陈代谢能量转化过程，在诸如能量储存、信号转导、DNA复制和遗传信息处理等生理过程中扮演重要的角色。有些疾病与PPi含量密切相关：在骨关节病或假性痛风患者中常发现二水焦磷酸钙晶体堆积现象，软骨钙化病病人的关节液中也有高水平的PPi含量。另外，由于端粒酶在合成碱基重复序列时伴随有PPi的释放,与PPi相关的生物发光分析也应用于肿瘤诊断。因此，鉴于其重要的研究价值，对PPi进行选择性检测已成为近年来分析检测界的研究热点之一。在过去的几十年中，人们已经建立了许多用于定量测定PPi的方法，包括化学发光方法、酶联免疫检测法、毛细管电泳、电化学方法和分子荧光等方法。然而这些方法存在检测灵敏度不够、操作繁琐、仪器耗材昂贵等问题，仍需在快速灵敏低成本检测PPi方面积极开发新的检测方法。

Cu²⁺是人体内继铁和锌后第三个最丰富的必需微量元素。然而,人体内异常水平的Cu²⁺会存在毒性，导致氧化应激和逻辑神经障碍等症状,包括阿尔海默茨病、帕金森病、Menkes氏综合征、肝豆状核变性等。因此，在特殊样品中找到对铜离子快速灵敏检测的方法很重要。传统用于定量测定Cu²⁺的方法包括电化学方法、原子发射光谱法、冷原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法和原子荧光光谱法等。这些方法相对费时费力，操作繁琐、且所需要的仪器昂贵。分子荧光法以其高灵敏性与高选择性及无需昂贵仪器等优点而受到关注。但是它需要专门的机构精心设计、合成和纯化，导致成本高，无法用于常规检测应用。

近年来，核酸诱导金属纳米簇的合成已经成为材料科学领域及分析领域的研究热点。研究者利用特定的核酸片段，识别或结合贵金属离子，在强还原剂还原的条件下，得到纳米尺度的贵金属原子簇。其中，银纳米簇因具有超小粒径、无毒性，性能稳定和优异的光谱和光物理特性而备受关注。因此，基于功能核酸的荧光纳米银簇作为环境或生物等样本的检测应用提供强大平台。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备简单、性能稳定、检测灵敏度好、无毒、荧光强度强兼具优良生物相容性的荧光DNA-银纳米簇及其制备方法以及应用，该荧光DNA-银纳米簇作为探针，既可以检测Cu²⁺含量，又可以检测PPi含量，可见该荧光DNA-银纳米簇可以实现双通道检测，该检测方法具有操作简单、灵敏度高，特异性强、背景信号低、适用范围广等优点，是一种简便实用的分析技术。

本发明的目的通过如下技术方案实现：一种用于合成荧光DNA-银纳米簇的寡链DNA片段，其序列为5’-ACC CGA ACC TGG GCT ACC CAC CCC TTA ATC CCC-3’。

一种荧光DNA-银纳米簇，它的粒径为2-10nm；肉眼观察其水溶液显浅粉色，在360nm紫外灯照射下呈亮红色；用530nm激发波长激发，发射波长为570-800nm，在618nm处得到较大荧光发射强度(如图1所示)，以罗丹明B为参照物，荧光量子产率为35.3％。

所述的荧光DNA-银纳米簇，它以富C寡链DNA片段为模板合成得到。

所述的富C寡链DNA片段的序列为5’-ACC CGA ACC TGG GCT ACC CAC CCC TTAATC CCC-3’。

本发明设计了一种新的脱氧核酸(DNA)序列：5’-ACC CGA ACC TGG GCT ACC CACCCC TTA ATC CCC-3’，本发明以该序列为模板，合成了一种新型荧光DNA-银纳米簇，该荧光DNA-银纳米簇是一种新型核酸包裹的荧光纳米银簇(AgNCs)。本发明的发明人还用了其他寡链DNA片段作为模板来合成荧光DNA-银纳米簇，如5’-CCC CCCCCC CCC CCC-3’序列、5’-CAC TCC CTA CCC TCC CTG GGC CAAGAG TGT GCT AAA-3’序列等，发现这些模板合成得到的荧光DNA-银纳米簇的稳定性不如本发明所采用的DNA模板合成出来的好，荧光发射强度也明显较低。由此可见，模板的选择是至关重要的环节，并不是所有富C寡链DNA片段都适合作为用于荧光DNA-银纳米簇合成的模板，模板需要进行合理的设计。

所述的荧光DNA-银纳米簇的制备方法，它包括以下步骤：将序列为5’-ACC CGAACC TGG GCT ACC CAC CCC TTA ATC CCC-3’的寡链DNA母液配于磷酸盐缓冲液中，然后将所得的混合溶液转移到恒温金属浴内，在80-90℃范围内加热3-5min，之后取出混合溶液缓慢降温至室温后，向混合溶液中以摩尔比为寡链DNA：Ag⁺＝1:3～1:12加入AgNO₃溶液，激烈振荡3-5min后静置20-30min，接着在混合溶液中以摩尔比BH₄ ^-：Ag⁺＝1:1～2:1加入NaBH₄溶液，振荡5-8min混匀后，室温避光反应6-12h，即可得所述的荧光DNA-银纳米簇溶液。

所述的寡链DNA母液为将90℃解链3-5min后的富C寡链DNA片段加二次水配成终浓度为50-100μmol/L的母液。

所述的磷酸盐缓冲液的pH值为7.0-7.5，浓度为20-50mmol/L。

所述AgNO₃溶液的浓度范围为1mM-3mM，所述NaBH₄溶液的浓度范围为1mM-3mM。

所述的荧光DNA-银纳米簇的应用，用于铜离子含量的检测。

如图2所示：本发明的发明人还利用本发明所得到的荧光DNA-银纳米簇来检测其他常见金属离子，发现其他金属离子的响应效果并不理想，证明了本发明所得到的荧光DNA-银纳米簇对铜离子的检测具有一定的选择性，其中，图2中F₀为空白PBS的荧光纳米银簇的荧光值，F为加入阳离子后的荧光值。

所述的荧光DNA-银纳米簇的应用，用于焦磷酸根离子含量的检测。

本发明将具有荧光特性的荧光DNA-银纳米簇应用到Cu²⁺和PPi的定量检测中，利用Cu²⁺对荧光DNA-银纳米簇的PET效应造成其荧光猝灭的原理，以荧光DNA-银纳米簇为荧光探针，通过控制荧光DNA-银纳米簇探针的用量以及荧光强度的测量等步骤实现对Cu²⁺的定量检测，同时，还可以对PPi离子进行定量检测。

一种利用所述荧光DNA-银纳米簇检测铜离子的方法，它包括以下步骤：

(1)绘制Cu²⁺响应标准曲线并获得线性回归方程式：

取一定量的荧光DNA-银纳米簇溶液作为荧光探针，与Cu²⁺标准缓冲溶液混合，将混合液中Cu²⁺调节至不同浓度并静置5-10min后，用荧光分光光度计在室温下分别检测上述不同Cu²⁺浓度的混合液在618nm处的荧光强度，获得相对荧光强度与Cu²⁺浓度的标准曲线；根据所得标准曲线，获得荧光强度与Cu²⁺浓度的线性回归方程式；所述的Cu²⁺标准缓冲溶液为Cu(NO₃)₂溶于缓冲溶液中所得到的Cu²⁺标准溶液。

(2)检测：之后取一定量的荧光DNA-银纳米簇溶液作为荧光探针溶液，与Cu²⁺待测缓冲溶液混合并静置5-10min，用荧光分光光度计在室温下检测混合液在618nm处的荧光强度强度，将该荧光强度带入步骤(1)所获得的线性回归方程式中，经计算得待测液的Cu²⁺浓度；

其中，所述缓冲溶液为含有0.1-0.5mol/L NaNO₃的PBS缓冲溶液，其中PBS缓冲溶液的pH为7.0-7.5,浓度为20-50mmol/L，所述荧光分光光度计的激发波长设置为530nm，激发狭缝宽度为10nm，发射狭缝宽度为10nm。

一种利用所述荧光DNA-银纳米簇检测焦磷酸根离子的方法，它包括以下步骤：

(1)绘制焦磷酸根离子响应标准曲线并获得线性回归方程式：

取焦磷酸根离子标准缓冲溶液与等体积、浓度为0.5-1mmol/L的Cu²⁺缓冲溶液混合，将混合液中焦磷酸根离子调节至不同浓度后在35-37℃下反30-40min，取适量的荧光DNA-银纳米簇溶液分别置于上述不同焦磷酸根离子浓度的混合液中，混匀并静置5-10min，然后用荧光分光光度计在室温下检测上述混合液在618nm处的荧光强度，获得相对荧光强度与焦磷酸根离子浓度的标准曲线；根据所得标准曲线，获得荧光强度与焦磷酸根离子浓度的线性回归方程式；所述的焦磷酸根离子标准缓冲溶液为焦磷酸盐标准溶液经缓冲溶液稀释到相应浓度所得的焦磷酸根离子标准溶液。

(2)检测：

取焦磷酸根离子待测缓冲溶液与等体积、浓度为0.5-1mmol/L的Cu²⁺缓冲溶液混合，在35-37℃下反应30-40min后，取适量的荧光银纳米簇溶液于混合液中，混匀并静置5-10min，用荧光分光光度计在室温下检测混合液在618nm处的荧光强度，将该荧光强度带入步骤(1)所获得的线性回归方程式中，经计算得待测液的PPi浓度；

其中，所述缓冲溶液为含有0.1-0.5mol/L NaNO₃的PBS缓冲溶液，其中PBS缓冲溶液的pH为7.0-7.5，浓度为20-50mmol/L，所述荧光分光光度计的激发波长设置为530nm，激发狭缝宽度为10nm，发射狭缝宽度为10nm。

发明人将铜离子与焦磷酸根离子(PPi)进行混合后，再与荧光DNA-银纳米簇溶液探针作用来检测焦磷酸根离子(PPi)的浓度，这是一种用于PPi定量分析的全新检测方法，本发明的荧光DNA-银纳米簇溶液探针检测PPi的工作原理如图4所示。Cu²⁺的存在会由于PET作用导致DNA-银纳米簇荧光的猝灭，且其猝灭的程度和Cu²⁺浓度存在一定的线性关系，由此可以进行Cu²⁺的检测。另一方面，在体系中引入PPi，由于PPi可以和Cu²⁺形成强的配位化合物，该化合物的形成有效减弱了Cu²⁺对DNA-银纳米簇荧光的猝灭作用，使得荧光信号增强，且当固定Cu²⁺浓度在一定浓度范围内不变时，溶液荧光强度和PPi浓度之间存在一定线性关系。据此可以实现对PPi的测定。

如图3所示：本发明的发明人还利用本发明所得到的荧光DNA-银纳米簇所构建的构建DNA-银纳米簇-铜离子复合检测体系来检测其他的阴离子，发现其他阴离子的响应效果并不理想，证明了本发明所得到的荧光DNA-银纳米簇-Cu²⁺复合体系对焦磷酸根离子的检测具有一定的选择性。

另外，发明人还作了以下对比试验：对铜离子单独与荧光DNA-银纳米簇探针作用后所得的溶液，进行荧光光谱图测定，以及铜离子先与焦磷酸根离子混合后，再与荧光DNA-银纳米簇探针作用后所得的溶液进行荧光光谱图测试，测试结果如图5所示，从图5可知：1)所合成的荧光DNA-银纳米簇具有较强的荧光强度；2)Cu²⁺的存在会有效猝灭银纳米簇的荧光；3)体系中引入PPi与Cu²⁺结合后，银纳米簇的荧光信号得到明显的恢复。其中图5中曲线a为荧光DNA-银纳米簇的荧光光谱；b在为在荧光DNA-银纳米簇中加入8ul 1.0mMCu²⁺后的荧光光谱图；曲线c为在荧光DNA-银纳米簇中加入8ul 1.0mMCu²⁺和8ul 2.0mmol PPi后的荧光光谱图。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：本发明将序列为5’-ACC CGA ACC TGGGCT ACC CAC CCC TTA ATC CCC-3’的富C寡链DNA片段作为模板合成的荧光DNA-银纳米簇具有性能稳定、绿色环保的优点，且制备该荧光DNA-银纳米簇的制备方法简单；本发明利用该荧光DNA-银纳米簇进行铜离子以及焦磷酸根离子的检测，检测方法快速简单、检测灵敏度好，选择性高等优点，克服了有机荧光染料存在的激发光谱窄、光稳定性差、容易光漂白且常具有毒性等缺点。

附图说明

图1是本发明荧光DNA-银纳米簇的激发光谱和发射光谱

图2是利用本发明荧光DNA-银纳米簇检测不同阳离子所得的响应图。

图3是利用本发明荧光DNA-银纳米簇检测不同阴离子所得的响应图

图4是本发明荧光DNA-银纳米簇检测焦磷酸根离子的工作原理图。

图5是不同条件下荧光DNA-银纳米簇的荧光光谱图。

图6是荧光DNA-银纳米簇与不同浓度Cu²⁺作用后的荧光光谱图。

图7是相对荧光强度与Cu²⁺浓度的标准曲线。

图8是荧光DNA-银纳米簇与不同浓度PPi作用后的荧光光谱图。

图9是荧光强度与PPi浓度的标准曲线。

图10是人体所含常规离子对本发明的荧光DNA-银纳米簇探针荧光强度的影响结果图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：

实施例一(最佳合成条件)：

荧光DNA-银纳米簇的制备方法，它包括以下步骤：将15uL，100μM序列为5’-ACCCGA ACC TGG GCT ACC CAC CCC TTA ATC CCC-3’的寡链DNA母液与73uL的磷酸盐缓冲液混合，然后将所得的混合溶液转移到恒温金属浴内，在90℃范围内加热5min，之后取出混合溶液缓慢降温至室温后，向混合溶液中加入6ul浓度为1.5mM的AgNO₃溶液(寡链DNA与Ag+的摩尔比为1:6)，激烈振荡5min后静置30min，接着在混合溶液中加入6ul浓度为1.5mM的NaBH₄溶液(以摩尔比BH₄ ^-：Ag⁺＝1:1加入NaBH₄溶液)，振荡8min混匀后，室温避光反应6h，即可得所述的荧光DNA-银纳米簇溶液。

所述的磷酸盐缓冲液的pH值为7.5，浓度为50mmol/L。

实施例二：

荧光DNA-银纳米簇的制备方法，它包括以下步骤：将10uL，100uM序列为5’-ACCCGA ACC TGG GCT ACC CAC CCC TTA ATC CCC-3’的寡链DNA母液与84uL的磷酸盐缓冲液混合，然后将所得的混合溶液转移到恒温金属浴内，在80℃范围内加热3min，之后取出混合溶液缓慢降温至室温后，向混合溶液中加入3ul浓度为1mM的AgNO₃溶液(寡链DNA与Ag⁺的摩尔比为1:3)，激烈振荡3min后静置20min，接着在混合溶液中加入3ul浓度为2mM的NaBH₄溶液(以摩尔比BH₄ ^-：Ag⁺＝2:1加入NaBH₄溶液)，振荡5min混匀后，室温避光反应8h，即可得所述的荧光DNA-银纳米簇溶液。

所述的磷酸盐缓冲液的pH值为7.0，浓度为20mmol/L。

实施例三：

荧光DNA-银纳米簇的制备方法，它包括以下步骤：将20uL，100uM序列为5’-ACCCGA ACC TGG GCT ACC CAC CCC TTA ATC CCC-3’的寡链DNA母液与60uL的磷酸盐缓冲液混合，然后将所得的混合溶液转移到恒温金属浴内，在85℃范围内加热4min，之后取出混合溶液缓慢降温至室温后，向混合溶液中加入8ul浓度为3mM的AgNO₃溶液(寡链DNA与Ag+的摩尔比为1:12)，激烈振荡4min后静置25min，接着在混合溶液中加入12uL浓度为3mM的NaBH₄溶液(以摩尔比BH₄ ^-：Ag⁺＝1.5:1加入NaBH₄溶液)，振荡6min混匀后，室温避光反应12h，即可得所述的荧光DNA-银纳米簇溶液。

所述的磷酸盐缓冲液的pH值为7.2,浓度为30mmol/L。

实施例四：

荧光DNA-银纳米簇的制备方法，它包括以下步骤：将10uL，100uM序列为5’-ACCCGA ACC TGG GCT ACC CAC CCC TTA ATC CCC-3’的寡链DNA母液与68uL的磷酸盐缓冲液混合，然后将所得的混合溶液转移到恒温金属浴内，在85℃范围内加热4min，之后取出混合溶液缓慢降温至室温后，向混合溶液中加入10ul浓度为1mM的AgNO₃溶液(寡链DNA与Ag+的摩尔比为1:10)，激烈振荡4min后静置25min，接着在混合溶液中加入12uL浓度为1mM的NaBH₄溶液(以摩尔比BH₄ ^-：Ag⁺＝1.2:1加入NaBH₄溶液)，振荡5min混匀后，室温避光反应8h，即可得所述的荧光DNA-银纳米簇溶液。

所述的磷酸盐缓冲液的pH值为7.2,浓度为30mmol/L。

实施例五：

荧光DNA-银纳米簇的制备方法，它包括以下步骤：将15uL，100uM序列为5’-CCCCCCCCC CCC CCC-3’的寡链DNA母液与58uL的磷酸盐缓冲液(pH 7.0,20mM)混合，然后将所得的混合溶液转移到恒温金属浴内，在90℃范围内加热5min，之后取出混合溶液缓慢降温至室温后，向混合溶液中加入9ul浓度为1.5mM的AgNO₃溶液，激烈振荡5min后静置25min，接着在混合溶液中以摩尔比为BH₄ ^-：Ag⁺＝2:1加入浓度为1.5mM的NaBH₄溶液，振荡5min混匀后，室温避光反应12h，即可得所述的荧光DNA-银纳米簇溶液100uL。

实施例一、实施例二、实施例三、实施例四得到的荧光DNA-银纳米簇探针肉眼观察呈粉红色，在紫外灯365nm照射下呈红色，且放置1个月颜色仍不会明显改变。取实施例一中所得该荧光DNA-银纳米簇探针溶液加入到含0.2MNaNO₃的PBS溶液(pH7.0，20mM)配置成2uM、1uM、0.5uM荧光探针溶液,用530nm激发波长激发，获得波长618nm的荧光(如图1所示)，测得618nm处发射荧光强度分别为187，138，96，由此可知利用序列为5’-ACC CGA ACC TGGGCT ACC CAC CCC TTA ATC CCC-3’的寡链DNA作为模板得到的荧光DNA-银纳米簇具有高荧光强度的特点。

另外，对实施例二、实施例三以及实施例四所得到的荧光DNA-银纳米簇探针溶液也进行类似的测试，实施例二所得到的荧光DNA-银纳米簇探针溶液加入到含0.2MNaNO₃的PBS溶液(pH7.0，20mM)配置成2uM、1uM、0.5uM荧光探针溶液,用530nm激发波长激发，获得波长618nm的荧光，测得618nm处发射荧光强度分别为168，123，87。实施例三所得到的荧光DNA-银纳米簇探针溶液加入到含0.2MNaNO₃的PBS溶液(pH7.0，20mM)配置成2uM、1uM、0.5uM荧光探针溶液，用530nm激发波长激发，获得波长618nm的荧光，测得618nm处发射荧光强度分别为135，111，78。实施例四所得到的荧光DNA-银纳米簇探针溶液加入到含0.2MNaNO₃的PBS溶液(pH7.0,20mM)配置成2uM、1uM、0.5uM荧光探针溶液,用530nm激发波长激发，获得波长618nm的荧光，测得618nm处发射荧光强度分别为153，115，81。

由此可知，虽然实施例一是本发明的最优合成条件，得到的荧光DNA-银纳米簇探针的荧光强度最高，但是实施例二、实施例三、实施例四所得到的荧光DNA-银纳米簇探针也同样具有高荧光强度的特点。

实施例五是实施例一、实施例二、实施例三、实施例四的对比试验，实施例五所得的荧光DNA-银纳米簇探针肉眼观察呈浅黄色，在紫外灯365nm照射下呈红色，放置1个月颜色会褪成无色，取该荧光DNA-银纳米簇探针溶液加入到含0.2mol/L NaNO₃的PBS溶液(pH7.0，20mM)配置成2uM、1uM、0.5uM荧光探针溶液,用530nm激发波长激发，获得波长618nm的荧光，测得618nm处发射荧光强度分别为88，65，43，由此可知，利用序列为5’-CCC CCCCCCCCC CCC-3’的寡链DNA作为模板得到的荧光DNA-银纳米簇不仅稳定性不好，而且荧光强度低。利用5’-ACC CGA ACC TGG GCT ACC CAC CCC TTA ATC CCC-3’序列和5’-CCC CCC CCCCCC CCC-3’序列作为合成荧光银纳米簇的DNA模板，这主要利用了胸腺嘧啶与Ag⁺的亲和力。强荧光银纳米簇形成的一个重要因素是所用DNA模板的二级结构，它在很大程度上影响着新生成的银纳米簇的荧光性质和稳定性。经实施例五与实施例一、实施例二、实施例三、实施例四的对比可知，模板的选择对于稳定新生成的荧光银纳米簇和进一步产生强荧光银纳米簇是至关重要的环节，并不是所有富C寡链DNA片段都适合作为用于高荧光产率的荧光DNA-银纳米簇合成的模板，模板需要进行合理的设计。

实施例六：

一种利用所述荧光DNA-银纳米簇检测铜离子的方法，它包括以下步骤：

(1)绘制Cu²⁺响应标准曲线并获得线性回归方程式：

将实施例一中所得的荧光DNA-银纳米簇溶液加入到含0.2mol/L NaNO₃的PBS溶液(pH7.0，20mM)中配置成1.5uM的荧光DNA-银纳米簇探针溶液。

取3ul上述荧光DNA-银纳米簇探针溶液，与197uLCu²⁺标准缓冲溶液混合，调节混合液中Cu²⁺的浓度依次为：0、2、6、12、18、24、28、30、33、35umol/L。将上述混合液静置5-10min后，用荧光分光光度计在室温下分别对上述混合液进行荧光光谱测定(所得的谱图如图6所示)，同时检测到上述不同Cu²⁺浓度的混合液在618nm处的荧光强度分别为125、115、99、75、54、35、19、13、8、6。获得相对荧光强度与Cu²⁺浓度的标准曲线如图7所示，其中F₀为不含Cu²⁺时荧光DNA-银纳米簇溶液在618nm处的荧光强度，F为含有一定浓度Cu²⁺的条件下银纳米簇在618nm处的荧光强度。根据所得标准曲线，获得相对荧光强度与Cu²⁺浓度的线性回归方程式，线性回归方程为y＝0.027x+0.036，R²＝0.993，其中y为猝灭率，y＝(F₀-F)/F₀,x为Cu²⁺浓度。

(2)检测：之后取3ul上述荧光DNA-银纳米簇探针溶液，与97ul Cu²⁺待测缓冲溶液混合并静置5-10min，用荧光分光光度计在室温下检测混合液在618nm处的荧光强度强度83，将该荧光强度带入步骤(1)所获得的线性回归方程式中，经计算得待测液的Cu²⁺浓度为11.1umol/L。

其中，计算方法为：y＝(125-83)/125＝0.336，将y＝0.336代入线性回归方程y＝0.027x+0.036中，得x＝11.1umol/L。

其中，本实施例中所述的Cu²⁺标准缓冲溶液以及Cu²⁺待测缓冲溶液的缓冲溶液为含有0.2mol/L NaNO₃的PBS缓冲溶液，其中PBS缓冲溶液的pH为7，浓度为20mmol/L。另外，在测试各种混合液在618nm处的荧光强度时，荧光分光光度计的激发波长设置为530nm，激发狭缝宽度为10nm,发射狭缝宽度为10nm。

从图6可知，荧光DNA-银纳米簇荧光探针与不同Cu²⁺浓度的混合液作用，随着Cu²⁺浓度的增加，AgNCs的荧光强度降低，其荧光不仅能被Cu²⁺快速猝灭，且猝灭强度和Cu²⁺浓度密切相关。

实施例七：

一种利用所述荧光DNA-银纳米簇检测焦磷酸根离子的方法，它包括以下步骤：

将实施例一中所得的荧光DNA-银纳米簇溶液加入到含0.2mol/L NaNO₃的PBS溶液(pH7.0，20mM)中配置成1.5uM的荧光DNA-银纳米簇探针溶液。

(1)绘制PPi响应标准曲线并获得线性回归方程式：

取8ul PPi标准缓冲溶液与等体积、浓度为1mmol/L的Cu²⁺缓冲溶液混合于总体积为200ulPBS缓冲溶液中，调节混合液中PPi的浓度依次为0、4、8、20、32、40、60、80、120uM，在35-37℃下反应30-40min后，取3uL上述所配好的荧光DNA-银纳米簇探针溶液分别置于197uL上述不同PPi浓度的混合液中，混匀并静置5-10min，然后用荧光分光光度计在室温下分别对上述混合液进行荧光光谱测定，同时检测到上述混合液在618nm处的荧光强度分别为6、10、17、25、32、45、57、72、102，获得荧光强度与PPi浓度的标准曲线如图9所示，(发明人在计算及绘图时取3次测量的平均值)；根据所得标准曲线，获得荧光强度与PPi浓度的线性回归方程式，线性回归方程式为y＝0.793x+8.499，R²＝0.994，其中y为荧光强度，x为PPi浓度。

(2)检测：

取8ul的PPi待测缓冲液与等体积、浓度为1mM的Cu²⁺缓冲溶液混合于总体积为200ulPBS缓冲溶液中，在35-37℃下反应30-40min后，取3uL上述所配好的荧光DNA-银纳米簇探针溶液置于197uL混合液中，混匀并静置5-10min，用荧光分光光度计在室温下检测混合液在618nm处的荧光强度为63，将该荧光强度带入步骤(1)所获得的线性回归方程式中，经计算得待测液的PPi浓度为68.7uM；

计算方法为：将y＝63代入线性回归方程式y＝0.793x+8.499中，即得x＝68.7uM。

其中，本实施例中所述的Cu²⁺缓冲溶液、PPi标准缓冲溶液以及PPi待测缓冲液的缓冲溶液为含有0.1-0.5mol/L NaNO₃的PBS缓冲溶液，其中PBS缓冲溶液的pH为7.0-7.5，浓度为20-50mmol/L；另外，所述荧光分光光度计的激发波长设置为530nm,激发狭缝宽度为10nm，发射狭缝宽度为10nm。

实施例八：

本发明探究了人体所含常规离子对本发明的荧光DNA-银纳米簇探针荧光强度的影响，主要考察Cl^-、NO₃ ^-、SO₄ ^2-、H₂PO₄ ^-、Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺等离子对荧光DNA-银纳米簇探针荧光强度的影响，测定方式与实施例六相似，得图10所示的结果。从图10中可见，其他离子的存在对检测结果没有明显影响。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干改变、改进和润饰，这些改变、改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建中医药大学

<120> 一种荧光DNA-银纳米簇及其制备方法以及应用

<150> 201610300643.7

<151> 2016-05-09

<160> 1

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

acccgaacct gggctaccca ccccttaatc ccc 33

Claims (5)

1.一种荧光DNA-银纳米簇的应用，其特征在于：用于焦磷酸根离子含量的检测；

其中，用于合成荧光DNA-银纳米簇的寡链DNA片段，其序列为5’-ACC CGA ACC TGG GCTACC CAC CCC TTA ATC CCC-3’；

所述荧光DNA-银纳米簇是通过以下制备方法制备而成：将序列为5’-ACC CGA ACC TGGGCT ACC CAC CCC TTAATC CCC-3’的寡链DNA母液配于磷酸盐缓冲液中，然后将所得的混合溶液转移到恒温金属浴内，在80-90℃范围内加热3-5min，之后取出混合溶液缓慢降温至室温后，向混合溶液中以摩尔比为寡链DNA：Ag⁺＝1:3～1:12加入AgNO₃溶液，激烈振荡3-5min后静置20-30min，接着在混合溶液中以摩尔比BH₄ ^-：Ag⁺＝1:1～2:1加入NaBH₄溶液，振荡5-8min混匀后，室温避光反应6-12h，即可得所述的荧光DNA-银纳米簇溶液。

2.根据权利要求1所述的荧光DNA-银纳米簇的应用，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲液的pH值为7.0-7.5，浓度为20-50mmol/L。

3.根据权利要求1所述的荧光DNA-银纳米簇的应用，其特征在于：所述AgNO₃溶液的浓度为1-3mM，所述NaBH₄溶液的浓度为1-3mM。

4.根据权利要求1所述的荧光DNA-银纳米簇的应用，其特征在于：所述荧光DNA-银纳米簇的粒径为2-10nm；肉眼观察其水溶液显浅粉色，在360nm紫外灯照射下呈亮红色；用530nm激发波长激发，发射波长为570-800nm，在618nm处得到较大荧光发射强度，以罗丹明B为参照物，荧光量子产率为35.3％。

5.根据权利要求1所述的荧光DNA-银纳米簇的应用，其特征在于：焦磷酸根离子含量的检测包括以下步骤：

(1)绘制焦磷酸根离子响应标准曲线并获得线性回归方程式：

取焦磷酸根离子标准缓冲溶液与等体积、浓度为0.5-1mmol/L的Cu²⁺缓冲溶液混合，将混合液中焦磷酸根离子调节至不同浓度后在35-37℃下反30-40min，取适量的荧光DNA-银纳米簇溶液分别置于上述不同焦磷酸根离子浓度的混合液中，混匀并静置5-10min，然后用荧光分光光度计在室温下检测上述混合液在618nm处的荧光强度，获得荧光强度与焦磷酸根离子浓度的标准曲线；根据所得标准曲线，获得荧光强度与焦磷酸根离子浓度的线性回归方程式；

(2)检测：

取焦磷酸根离子待测缓冲溶液与等体积、浓度为0.5-1mmol/L的Cu²⁺缓冲溶液混合，在35-37℃下反应30-40min后，取适量的荧光银纳米簇溶液于混合液中，混匀并静置5-10min，用荧光分光光度计在室温下检测混合液在618nm处的荧光强度，将该荧光强度带入步骤(1)所获得的线性回归方程式中，经计算得待测液的PPi浓度；

其中，所述缓冲溶液为含有0.1-0.5mol/L NaNO₃的PBS缓冲溶液，其中PBS缓冲溶液的pH为7.0-7.5，浓度为20-50mmol/L，所述荧光分光光度计的激发波长设置为530nm，激发狭缝宽度为10nm，发射狭缝宽度为10nm。