CN109706215A - 一种dna-银纳米簇的合成及其在检测核酸剪切酶活性方面的应用 - Google Patents

一种dna-银纳米簇的合成及其在检测核酸剪切酶活性方面的应用 Download PDF

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林大杰
王舜
金辉乐
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Abstract

本发明涉及的是DNA‑银纳米簇的合成及其在检测核酸剪切酶活性方面的应用，制备方法如下：(1)DNA以8000转/分钟离心8分钟，将920uL的Tris‑HNO3加入DNA中使得它的浓度为5mM，活化30s，冷却。(2)将配制好的5mM硝酸银溶液加入上述DNA溶液中反应1h；(3)称取0.001g硼氢化钠用Tris‑HNO3配制成25mM溶液，边搅拌边将新配制的硼氢化钠溶液加入上述溶液，搅拌10分钟后便可得到DNA‑银纳米簇。通过本发明找到了一种合成具有较强荧光效应、稳定性良好的DNA‑银纳米簇的方法，该方法使用的仪器简单，灵敏度高，操作方便，效果直观，为酶活性测定提供了一种便捷的方法。

Description

一种DNA-银纳米簇的合成及其在检测核酸剪切酶活性方面的 应用
技术领域
本发明涉及分析检测领域，特别涉及一种DNA-银纳米簇的合成及其在检测核酸剪切酶活性方面的应用。
背景技术
随着纳米科学的迅猛发展，人们对于自然、世界的认识能力不断提高。从早期的宏观认识，逐渐发展至微观，现已能够发展微观纳米探针对于极微量的目标物质(离子、分子、DNA、细胞等)进行有效的分析和检测。纳米材料的发展为纳米技术的不断拓展提供了坚实的物质基础。纳米技术也逐渐成为当今日常生活以及科研所必须的工具。相较于一直以来广泛应用的依赖大型分析仪器的分析方法，结合纳米材料的新型纳米探针具有快捷、简便、廉价、易操作等优点，尤其是利用具有荧光特性的纳米材料所构建的分析方法显示出更加灵敏和直观的特点。近年来，由DNA稳定合成的银纳米簇探针由于其荧光光谱可调控性强，光化学性质稳定性良好，生物相容性能较优异等优势，已经成为荧光纳米材料的研究热点之一，受到研究人员的广泛关注。
金属纳米簇是由几个到几十个金属原子所组成的，超小的尺寸导致其具有类似于分子的性质，即尺寸大小与电子的费米波长相当，导带结构为不连续的能级，不再呈现金属纳米粒的等离子特征和金属晶体优秀的导电性能，则会表现出类似于半导体的特征，在一定的波长光激发下发射出强烈的荧光。金属纳米团簇作为大纳米晶体和单个金属原子之间的“缺失能带”，是沟通两者的桥梁。近年来，文献报道较多的金属纳米团簇主要是Ag、Au、Pt、Cu等纳米团簇，特别是银纳米簇和金纳米簇居多。
DNA-银纳米簇具有水溶性好，量子产率较高，荧光强度高，生物相容性优良等一系列优点，克服了传统荧光物质毒性大，尺寸较大难于应用于活体细胞成像，光稳定性差，以发生光漂白等缺点。在重金属离子检测，生物成像，生物大分子检测，巯基类药物检测等方面的应用前景广阔。目前银纳米簇的合成已有多种方法，但是其中还存在很多问题，所以寻求一种光稳定性良好，水相中不易团聚，荧光强度高的银纳米簇合成方法至关重要。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种DNA-银纳米簇的合成方法。
本发明的第二个目的，是提供一种DNA-银纳米簇材料，该材料水溶性良好，荧光强度高。
本发明的第三个目的，是提供一种DNA-银纳米簇在检测剪切酶剪切酶活性方面的应用，该检测方式仪器简单，灵敏度高，操作方便，效果直观。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种DNA-银纳米簇的合成方法，包括如下步骤：
(1)将DNA放入离心机中以8000转/分钟的速度离心8分钟，把920uL的Tris-HNO3加入到DNA中使得它的浓度为5mM，然后将DNA溶液放入到80℃的恒温水浴锅中活化30s，取出放入冰水浴中冷却，将冷却后的DNA溶液用移液枪转移至5ml的棕色瓶中；
(2)将配置好的5mM硝酸银溶液移取至上述溶液中，反应1h；
(3)称取0.001克的硼氢化钠用Tris-HNO3配制成25mM的溶液，把棕色瓶放在磁力搅拌器上搅拌的同时加入硼氢化钠溶液，搅拌10分钟后反应4-168小时，得到DNA-银纳米簇；
进一步设置为，本实验所述的DNA均从上海生工生物工程股份有限公司订购，它分为DNA1和配对DNA2，其中DNA1序列号为CCC gCC CgC CCC gTgTCT进一步设置为，实验操作中所述的DNA，硝酸银，硼氢化钠的加入用量比为1:9:9、1:15:15、1:21:21、1:27:27、1:33:33、1:39:39中的任意一种。
进一步设置为，所述的步骤(2)与步骤(3)中的反应温度为4℃-37℃。
DNA-银纳米簇在检测核酸剪切酶活性方面的应用，其检测方法包括如下步骤：
(1)取多组DNA-银纳米簇，都加入等量的配对DNA和Hg2+，控制酶的用量和反应温度，反应1h；
(2)以激发光波长460nm，PMT电压700V，荧光发射收集范围490-650nm，狭缝均为10nm，使用4mm×10mm的荧光比色皿，在室温条件下进行荧光检测。
该发明的有益效果为：
本发明人发现，通过本发明找到了一种合成具有较强荧光效应，稳定性良好的DNA-银纳米簇的方法，同时利用核酸外切酶Exo III对于双链DNA的剪切作用，可以用DNA-银纳米簇的荧光降低程度来评价DNA剪切酶的活性，该方法使用的仪器简单，灵敏度高，操作方便，效果直观，为酶活力测定提供了一种便捷的方法。
附图说明
图1 DNA-银纳米簇产物A3的荧光光谱图和激发发射光谱图；
图2 DNA-银纳米簇产物A1，A2，A3，A4，A5，A6的荧光强度对比；
图3 DNA-银纳米簇产物A7，A8，A9的荧光强度对比；
图4 DNA-银纳米簇产物A10，A3，A12，A13，A14，A15，A16荧光强度对比；
图5 DNA-银纳米簇产物A16荧光光谱图；
图6 DNA-银纳米簇产物A16加入不同物质后的荧光猝灭现象图；
图7不同用量剪切酶的剪切效果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1-6
S1:将DNA放入离心机中以8000转/分钟的速度离心8分钟，把920uL的Tris-HNO3加入到DNA中使得它的浓度为5mM，然后将DNA溶液放入到80℃的恒温水浴锅中活化30s，取出放入冰水浴中冷却，将冷却后的DNA溶液用移液枪转移至5mL的棕色瓶中；
S2:在上述溶液中加入11.28uL5mM硝酸银溶液，37℃下反应1h；
S3:称取0.001克的硼氢化钠用Tris-HNO3配制成25mM溶液，把棕色瓶放在磁力搅拌器上搅拌的同时加入2.25uL的硼氢化钠溶液，搅拌10分钟后在37℃条件下反应48h，得到DNA-银纳米簇；
S4:其中DNA与硝酸银和硼氢化钠的用量比分别为1:9:9，1:15:15，1:21:21，1:27:27，1:33:33，1:39:39，得到的DNA-银纳米簇的产物标记为A1，A2，A3，A4，A5，A6。
S5:将DNA-银纳米簇的产物A3用分光光度计进行荧光测试，得到附图1。
S6:将DNA-银纳米簇的产物A1，A2，A3，A4，A5，A6以激发光波长460nm，PMT电压700V，荧光发射收集范围490-650nm，狭缝均为10nm，使用4mm×10mm的荧光比色皿，在室温条件下进行荧光检测，得到附图2。
从附图1A可以看出合成的DNA-银纳米簇能够发出荧光，荧光强度约为460，附图1B则表明，合成出的DNA-银纳米簇荧光最大发射波长为540nm，最大激发波长为460nm，说明具有荧光效应的DNA-银纳米簇已经被成功合成出来。
附图2中可以明显看出，合成银纳米簇的体系中，当DNA模板的用量一定时，硝酸银和硼氢化钠的用量并非越多越好。随着硝酸银和硼氢化钠用量的增加，总体呈现出荧光强度先增加后降低的趋势，说明了过量的硝酸银和硼氢化钠并不利于DNA-银纳米簇荧光效应的增强，反而会降低银纳米簇的荧光性质。图中表明，最佳的反应比例为1:21:21。
实施例7-9
除S2,S3的反应温度分别设置为4℃，20℃，37℃外，其余操作与实施例1-6均相同，得到DNA-银纳米簇的产物分别标记为A7，A8，A3。
将DNA-银纳米簇的产物A7，A8，A9以激发光波长460nm，PMT电压700V，荧光发射收集范围490-650nm，狭缝均为10nm，使用4mm×10mm的荧光比色皿，在室温条件下进行荧光检测，得到附图3。
附图3直观的表明，随着反应温度的增加，DNA-银纳米簇的荧光强度有着明显的提高。在4℃，20℃，37℃荧光光谱图中，37℃的荧光强度是最高的，这也表明较低的温度并不适宜DNA-银纳米簇的合成，这可能与较低温度下反应所需活化能较大有关。所以37℃为银纳米簇的合成温度。
实施例10-16
除S3中的反应时间分别设置为1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天外，其余操作均相同，得到得到DNA-银纳米簇的产物分别标记为A10，A3，A12，A13，A14，A15，A16。
将DNA-银纳米簇的产物A10，A3，A12，A13，A14，A15，A16以激发光波长460nm，PMT电压700V，荧光发射收集范围490-650nm，狭缝均为10nm，使用4mm×10mm的荧光比色皿，在室温条件下进行荧光检测，得到附图4。
附图4显示，反应体系在经过24h的反应时间后，荧光强度仅仅才330左右，此时体系中合成反应远没有完成，随着反应时间不断增加，体系的荧光强度也在不断的提高，并且到第七天后，体系荧光强度基本趋于稳定，不再增加，并且荧光强度峰值保持在640附近，所以，DNA-银纳米簇的合成需要7天时间才能基本完成，并且荧光强度趋于稳定。
DNA-银纳米簇的产物A16为最佳反应条件下制得的DNA-银纳米簇的产物，是一种荧光强度有较大提高的，稳定性能良好的银纳米簇。
附图5为A16产物的荧光光谱图，图5表明，最佳反应条件下，银纳米簇的荧光强度有了明显的提高。进一步考查该DNA-银纳米簇的稳定性发现，合成反应完成后，其荧光强度可以稳定在最大水平，并且保持至少两周以上，之后会慢慢降低。至此，可以认为已经成功合成了荧光性质优良，稳定性良好的DNA-银纳米簇，并且可以用于DNA剪切酶活性的评价。
DNA-银纳米簇的产物应用性能测试:
1.验证荧光猝灭机理
在探究DNA酶活性时，要排除掉除酶以外其他添加物的影响，所以把合成的银纳米簇的分为五瓶来检测，分别为a.只加Tris-HNO3；b.加Hg2+和配对DNA；c.加配对DNA；d.Hg2+；e.Hg2+和配对DNA和剪切酶，在37℃条件下反应1h,它们反应后测得的荧光光谱如图6；
从图6可以看出在加入配对DNA、剪切酶和Hg2+后的e组荧光强度比只加Tris-HNO3的a组，加Hg2+和配对DNA的b组，加配对DNA的c组，只加Hg2+的d组，荧光强度明显降低，说明实验中Hg2+,配对DNA对DNA-银纳米簇荧光猝灭影响都不大。同时也表明DNA-银纳米簇的荧光，只有在加入Hg2+，配对DNA和剪切酶时，DNA模板被切断，导致荧光被熄灭。荧光猝灭的原因可能是DNA模板被剪断，不足以稳定银纳米簇，以致于银纳米簇之间发生了团聚，形成了无荧光性能的团聚物。
2.DNA剪切酶活性探究
在上述最佳条件下制得DNA-银纳米簇，分别加入等量的配对DNA、和汞离子，只改变DNA剪切酶的用量，探究了0-12U之间剪接酶的剪切效果，结果如图7；
从图7中，我们会发现在加入较少的DNA剪切酶时，随着剪切酶用量的增加，荧光强度会随之下降，当剪切酶用量大于5U时，剪切酶含量基本趋于饱和，银纳米簇荧光强度基本不再降低。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (5)

1.一种DNA-银纳米簇的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将DNA放入离心机中以8000转/分钟的速度离心8分钟，把920uL的Tris-HNO3加入到DNA中使得它的浓度为5mM，然后将DNA溶液放入到80℃的恒温水浴锅中活化30s后，取出放入冰水浴中冷却，将冷却后的DNA溶液用移液枪转移至5mL的棕色瓶中；
(2)将配制好的5mM硝酸银溶液加入上述溶液，反应1h；
(3)称取0.001克的硼氢化钠用Tris-HNO3配制成25mM的溶液，把棕色瓶放在磁力搅拌器上搅拌的同时加入硼氢化钠溶液，搅拌10分钟后反应4-168小时，得到DNA-银纳米簇。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述DNA，硝酸银，硼氢化钠的加入用量比为1:9:9、1:15:15、1:21:21、1:27:27、1:33:33、1:39:39中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述的步骤(2)与步骤(3)中的反应温度为4℃-37℃。
4.一种根据权利要求1-3所述的合成方法制备的DNA-银纳米簇。
5.一种根据权利要求4所述的DNA-银纳米簇在检测核酸剪切酶活性方面的应用，其特征在于，检测方法包括如下步骤：
(1)取多组DNA-银纳米簇，都加入等量的配对DNA和Hg2+，控制酶的用量和反应温度，反应1h；
(2)以激发光波长460nm，PMT电压700V，荧光发射收集范围490-650nm，狭缝均为10nm，使用4mm×10mm的荧光比色皿，在室温条件下进行荧光检测。
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