CN109030455A - 一种基于微片的表面拉曼增强基底的制备和检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于微片的表面拉曼增强基底的制备和检测方法：选择微米尺度的玻璃薄片制作微片作为反应载体；将金纳米棒作为表面增强拉曼散射基底，具体是根据金纳米棒和所要结合的拉曼报告分子之间的反应要求制备金纳米棒；将金纳米棒与构成反应载体的微片结合，得到增强基底微片‑金纳米棒；选择对甲苯硫酚或4‑羟基苯硫酚或二奈硫酚作为拉曼报告分子；将微片‑金纳米棒与拉曼报告分子结合，得到微片‑金纳米棒‑拉曼报告分子。本发明具有基于微球载体的拉曼增强基底的优点，并且可以在很大程度上增强信号的强度，在生物分子分析等领域具有很好的应用前景。

Description

一种基于微片的表面拉曼增强基底的制备和检测方法
技术领域
本发明涉及一种拉曼增强基底的制备。特别是涉及一种基于微片的表面拉曼增强基底的制备和检测方法。
背景技术
液相生物芯片技术是集流式技术、荧光微球、激光检测、数字信号处理和传统化学技术为一体的一种新型生物分子高通量检测技术。这种技术将流式检测与芯片技术有机地结合在一起，使生物芯片反应体系由液相-固相反应改变为接近生物系统内部环境的完全液相反应体系，以实现核酸、蛋白质等多种生物分子的检测。液相生物芯片相比较于传统的固相生物芯片来说，其主要优点在于检测准确度高、信息质量稳定、检测结果可重复性好、检测用时短、操作简便，与其它方法想比，液相生物芯片的优势则体现在高通量、高敏感度、线性范围宽、反应速度快、重复性好等方面。
目前液相生物芯片技术是通过将不同的荧光物质或者不同组合的荧光物质包裹于微球之中，且对微球表面进行修饰，通过结合探针分子，与被标记的待检分子在液相反应环境进行反应，再对微球进行荧光检测，得到荧光编码微球的荧光光谱，辨别出不同的微球，确定荧光的分类和标记荧光的数量，最后确定被结合的生物分子的种类和数量。相比较于荧光光谱，拉曼散射光谱则具有很高的光谱分辨率，而且拉曼分子的谱峰稳定性高，拉曼信号的重现性好，因此基于拉曼光谱的液相生物芯片技术得到了更好的应用。但是拉曼信号强度比较弱，有时候会出现检测信号淹没在噪声之中的情况，所以需要对拉曼信号进行增强。有研究人员发现，纳米金属结构在入射电场的作用下，会形成等离激元共振，这就使得纳米金属结构表面吸附的拉曼分子的拉曼光谱得到了极大增强，因而具有了超高的灵敏度，这称之为表面增强拉曼散射效应。基于表面拉曼增强光谱(SERS)的液相生物芯片得到了发展，这种检测技术具有快速、样品处理简单、适用广泛、高效等特点。
在基于表面拉曼增强光谱(SERS)的液相生物芯片中，基于微球的SERS增强基底则成为比较重要的一部分。目前的SERS增强基底基本是以微球作为反应载体，以金、银、铜等贵金属作为增强基底的，但是基于微球的SERS基底有一定的局限性：微球需实验人员通过不同的方法制备，且制备过程较为复杂，制备材料可能有毒；微球制备完成后需进行多次洗涤，且需进行筛选，以得到大小相同的微球；若将拉曼报告分子和金、银、铜等增强基底包裹到微球内侧，需提前孵化或者修饰，实验整体处理时间长，操作不够方便。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够增强信号强度的基于微片的表面拉曼增强基底的制备和检测方法。
本发明所采用的技术方案是：一种基于微片的表面拉曼增强基底的制备和检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)选择微米尺度的玻璃薄片制作微片作为反应载体；
2)将金纳米棒作为表面增强拉曼散射基底，具体是根据金纳米棒和所要结合的拉曼报告分子之间的反应要求制备金纳米棒；
3)将金纳米棒与构成反应载体的微片结合，得到增强基底微片-金纳米棒；
4)选择对甲苯硫酚或4-羟基苯硫酚或二奈硫酚作为拉曼报告分子；
5)将微片-金纳米棒与拉曼报告分子结合，得到微片-金纳米棒-拉曼报告分子。
步骤1)中所述的反应载体是厚为40～100微米、边长为100微米的玻璃薄片。
步骤1)包括：
(1)将玻璃薄片放置于1.5ml的离心管内；
(2)用丙酮、乙醇和去离子水依次对玻璃薄片进行离心超声洗涤，得到清洗干净的玻璃微片；
(3)将玻璃微片用食人鱼洗液浸泡8～15小时，使玻璃微片表面带羟基；
(4)在带羟基的玻璃微片表面修饰聚乙烯亚胺，使带羟基的玻璃微片表面带正电荷，构成作为反应载体的微片。
步骤2)中所述的金纳米棒的制备包括：
(1)种子合成：在4ml浓度为0.1M的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液中，用24ul，0.1M的硼氢化钠快速还原40ul，24.28mM氯金酸后，得到3～5nm种子溶液，然后将种子溶液于室温下静置2～5个小时，使种子进一步钝化；
(2)在圆底烧瓶中，以两分钟为间隔，分别依次加入20ml，0.2M的十六烷基三甲基溴化铵溶液，400ul，24.28mM的氯金酸溶液和150ul，5M的盐酸，以及40ul-100ul的硝酸银溶液，搅拌均匀后，加入160ul，0.1M的抗坏血酸溶液进行反应，最后加入28ul种子溶液，搅拌后静置于30℃的恒温箱中，12个小时后，反应完成，得到金纳米棒溶液；
(3)在金纳米棒溶液内加入200ul聚乙烯亚胺，搅拌均匀，反应1小时；
(4)再加入200ul聚苯乙烯磺酸钠，搅拌均匀，反应1小时，使金纳米棒表面带有负电荷；
(5)用紫外可见分光光度计获取金纳米棒的消光光谱，用扫描电子显微镜观察金纳米棒的形貌，再通过透射电子显微镜获取金纳米棒的长径比和形貌信息。
步骤3)包括：
(1)将修饰后的微片和金纳米棒在水溶液中混合，进行反应，得到具有增强作用的微片-金纳米棒；
(2)用显微镜观察微片-金纳米棒结合效果。
步骤5)包括：
(1)将微片-金纳米棒用乙醇溶液重新洗涤后，再分散于乙醇溶液中，同时将拉曼报告分子超声溶于乙醇溶液，最后，将具有微片-金纳米棒的乙醇溶液与具有拉曼报告分子的乙醇溶液混合，使两者进行反应，得到微片-金纳米棒-拉曼报告分子；
(2)采用扫描电子显微镜观察微片-金纳米棒-拉曼报告分子结合效果；采用显微激光共聚焦拉曼光谱仪检测微片-金纳米棒-拉曼报告分子的拉曼光谱。
第(1)步具体是天平称取200毫克拉曼报告分子，并且超声溶于2ml乙醇溶液中，待完全溶解后，与具有微片-金纳米棒的乙醇溶液混合，搅拌2小时后静置反应至少12小时，得到微片-金纳米棒-拉曼报告分子。
本发明的一种基于微片的表面拉曼增强基底的制备和检测方法，摒弃了载体微球，而选用具有一定光学厚度的微片来做为表面拉曼增强的载体，在液相环境中与修饰过的金属纳米颗粒进行反应，再与不同种类的待测拉曼报告分子结合，然后对微片进行高分辨率的拉曼光谱分析来识别待测分子。由于现有商用拉曼光谱仪的最大分辨率为1cm-1，而拉曼报告分子和金属纳米颗粒都是小分子物质，检测时精度不够，所以，载体在检测过程中相对必须的部分，而微片的优势则在于其表面平滑，且不会影响拉曼信号的检测。总之，本发明提出的基于微片的拉曼增强基底具有基于微球载体的拉曼增强基底的优点，并且可以在很大程度上增强信号的强度，在生物分子分析等领域具有很好的应用前景。
附图说明
图1a是本发明一种基于微片的表面拉曼增强基底的制备方法的步骤示意图；
图中1：微片 2：金纳米棒 3：拉曼报告分子
图1b是本发明一种基于微片的表面拉曼增强基底的制备方法的检测结果图；
图2是本发明中金纳米棒的紫外可见吸收光谱；
图3是本发明中金纳米棒的扫描电子显微镜(SEM)效果图；
图4是本发明中金纳米棒的透射电子显微镜(TEM)效果图；
图5是金纳米棒和微片反应之后得到的显微镜图像效果图；
图6微片-金纳米棒基底和拉曼报告分子反应之后得到的SEM效果图；
图7微片-金纳米棒基底和拉曼报告分子反应之后得到的局部SEM效果图；
图8是拉曼报告分子-对甲苯硫酚的拉曼光谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明的一种基于微片的表面拉曼增强基底的制备和检测方法做出详细说明。
本发明的一种基于微片的表面拉曼增强基底的制备和检测方法，是以微片作为反应载体，以金纳米材料作为增强基底材料的微片-金纳米棒SERS基底，基于微片-金纳米棒的SERS基底具有很多的优势：以金溶胶中的金纳米棒作为增强基底的材料，因为它的光学特性和局域表面等离子体振动特性，所以增强作用更为明显，在传感技术方面灵敏度很高，检测限很低，而微片的制备过程简单，制备微片所用材料安全无毒，成本低廉，易于保存和运输，而且微片是平面的，金纳米棒结合在微片的表面，相对来说结合表面积大，在对微片的检测中，微片作为背景的影响比较容易消除，检测平面上的拉曼物质更有利于实验者得出实验结果。
如图1a所示，本发明的一种基于微片的表面拉曼增强基底的制备和检测方法，包括如下步骤：
1)选择微米尺度的玻璃薄片制作微片作为反应载体，所述的玻璃薄片是厚为40～100微米、边长为100微米的玻璃薄片，优选厚度为60微米。具体包括：
(1)将玻璃薄片放置于1.5ml的离心管内；
(2)用丙酮、乙醇和去离子水依次对玻璃薄片进行离心超声洗涤，得到清洗干净的玻璃微片；
(3)将玻璃微片用食人鱼洗液浸泡8～15小时，使玻璃微片表面带羟基；
(4)在带羟基的玻璃微片表面修饰聚乙烯亚胺(PEI)，使带羟基的玻璃微片表面带正电荷，构成作为反应载体的微片，用于与带负电荷的金纳米棒通过静电作用结合。
2)将金纳米棒作为表面增强拉曼散射基底，具体是根据金纳米棒和所要结合的拉曼报告分子之间的反应要求选择并制备金纳米棒；
金纳米棒颗粒有一个性质是表面等离子体共振，具有横轴和纵轴两个吸收峰，其中，波长在520nm左右的产生的峰值是由于金纳米棒的横向表面等离子体共振，其对金纳米棒的大小和周围折射率的变化不敏感，而纵向表面等离子体共振所产生的吸收峰值则随着金纳米棒长径比的不同而发生变化，且纵向表面等离子体共振对金纳米棒的大小和周围折射率的变化十分敏感。金纳米棒的SERS基底由于其光学特性和局域表面等离子体振动，其基底的增强因子可达106-1014，广泛应用于高敏感性和更低检出限的化学传感技术。选择金纳米棒作为SERS基底，可有效增强拉曼报告分子的信号强度，针对信号较弱的拉曼报告分子，其增强作用尤其明显。所述的金纳米棒的制备包括：
(1)种子合成：在4ml浓度为0.1M的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液中，用24ul，0.1M的硼氢化钠快速还原40ul，24.28mM氯金酸后，得到3～5nm种子溶液，然后将种子溶液于室温下静置2～5个小时，使种子进一步钝化；
(2)在圆底烧瓶中，以两分钟为间隔，分别依次加入20ml，0.2M的十六烷基三甲基溴化铵溶液，400ul，24.28mM的氯金酸溶液和150ul，5M的盐酸，以及40ul-100ul的硝酸银溶液，搅拌均匀后，加入160ul，0.1M的抗坏血酸溶液进行反应，最后加入28ul种子溶液，搅拌后静置于30℃的恒温箱中，12个小时后，反应完成，得到金纳米棒溶液；
(3)在金纳米棒溶液内加入200ul聚乙烯亚胺(PEI)，搅拌均匀，反应1小时；
(4)再加入200ul聚苯乙烯磺酸钠(PSS)，搅拌均匀，反应1小时，使金纳米棒表面带有负电荷；
(5)用紫外可见分光光度计获取金纳米棒的消光光谱，如图2所示，其中横向局域表面等离子体共振吸收峰大约在520nm附近，纵向局域表面等离子体共振吸收峰在658nm。
用扫描电子显微镜观察金纳米棒的形貌如图3所示，再通过透射电子显微镜获取金纳米棒的长径比和形貌信息，如图4所示。
3)将金纳米棒与构成反应载体的微片结合，得到增强基底微片-金纳米棒；包括：
(1)将修饰后的微片和金纳米棒在水溶液中混合，进行反应，得到具有增强作用的微片-金纳米棒；
(2)用显微镜观察微片-金纳米棒结合效果，如图5所示。
4)选择对甲苯硫酚或4-羟基苯硫酚或二奈硫酚作为拉曼报告分子；
5)将微片-金纳米棒与拉曼报告分子结合，得到微片-金纳米棒-拉曼报告分子。包括：
(1)将微片-金纳米棒用乙醇溶液重新洗涤后，再分散于乙醇溶液中，同时将拉曼报告分子超声溶于乙醇溶液，最后，将具有微片-金纳米棒的乙醇溶液与具有拉曼报告分子的乙醇溶液混合，使两者进行反应，得到微片-金纳米棒-拉曼报告分子；具体是天平称取200毫克拉曼报告分子，并且超声溶于2ml乙醇溶液中，待完全溶解后，与具有微片-金纳米棒的乙醇溶液混合，搅拌2小时后静置反应至少12小时，得到微片-金纳米棒-拉曼报告分子。
(2)采用扫描电子显微镜观察微片-金纳米棒-拉曼报告分子结合效果，如图6所示，从图中可以看出，微片表面结合了一些物质，局部放大所得结果如图7所示，从图7中可以看出，在微片表面的物质即为金纳米棒。而且通过图8的拉曼光谱可以得出表面还有拉曼报告分子的存在；采用显微激光共聚焦拉曼光谱仪检测微片-金纳米棒-拉曼报告分子的拉曼光谱，如图8所示，由图中可以看出，纯物质中一些比较弱的信号，在经过增强后，峰值强度得到了明显的升高。而且同时证明了，拉曼报告分子成功的偶联至金纳米棒表面。
图1b是本发明一种基于微片的表面拉曼增强基底的制备方法的检测结果图，其中横坐标表示拉曼位移(Raman Shift)，纵坐标表示拉曼谱峰强度(Raman Intensity)，黑色实线代表拉曼报告分子的拉曼光谱(Raman Spectrum)。

Claims (7)

1.一种基于微片的表面拉曼增强基底的制备和检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)选择微米尺度的玻璃薄片制作微片作为反应载体；
2)将金纳米棒作为表面增强拉曼散射基底，具体是根据金纳米棒和所要结合的拉曼报告分子之间的反应要求制备金纳米棒；
3)将金纳米棒与构成反应载体的微片结合，得到增强基底微片-金纳米棒；
4)选择对甲苯硫酚或4-羟基苯硫酚或二奈硫酚作为拉曼报告分子；
5)将微片-金纳米棒与拉曼报告分子结合，得到微片-金纳米棒-拉曼报告分子。
2.根据权利要求1所述的一种基于微片的表面拉曼增强基底的制备和检测方法，其特征在于，步骤1)中所述的反应载体是厚为40～100微米、边长为100微米的玻璃薄片。
3.根据权利要求1所述的一种基于微片的表面拉曼增强基底的制备和检测方法，其特征在于，步骤1)包括：
(1)将玻璃薄片放置于1.5ml的离心管内；
(2)用丙酮、乙醇和去离子水依次对玻璃薄片进行离心超声洗涤，得到清洗干净的玻璃微片；
(3)将玻璃微片用食人鱼洗液浸泡8～15小时，使玻璃微片表面带羟基；
(4)在带羟基的玻璃微片表面修饰聚乙烯亚胺，使带羟基的玻璃微片表面带正电荷，构成作为反应载体的微片。
4.根据权利要求1所述的一种基于微片的表面拉曼增强基底的制备和检测方法，其特征在于，步骤2)中所述的金纳米棒的制备包括：
(1)种子合成：在4ml浓度为0.1M的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液中，用24ul，0.1M的硼氢化钠快速还原40ul，24.28mM氯金酸后，得到3～5nm种子溶液，然后将种子溶液于室温下静置2～5个小时，使种子进一步钝化；
(2)在圆底烧瓶中，以两分钟为间隔，分别依次加入20ml，0.2M的十六烷基三甲基溴化铵溶液，400ul，24.28mM的氯金酸溶液和150ul，5M的盐酸，以及40ul-100ul的硝酸银溶液，搅拌均匀后，加入160ul，0.1M的抗坏血酸溶液进行反应，最后加入28ul种子溶液，搅拌后静置于30℃的恒温箱中，12个小时后，反应完成，得到金纳米棒溶液；
(3)在金纳米棒溶液内加入200ul聚乙烯亚胺，搅拌均匀，反应1小时；
(4)再加入200ul聚苯乙烯磺酸钠，搅拌均匀，反应1小时，使金纳米棒表面带有负电荷；
(5)用紫外可见分光光度计获取金纳米棒的消光光谱，用扫描电子显微镜观察金纳米棒的形貌，再通过透射电子显微镜获取金纳米棒的长径比和形貌信息。
5.根据权利要求1所述的一种基于微片的表面拉曼增强基底的制备和检测方法，其特征在于，步骤3)包括：
(1)将修饰后的微片和金纳米棒在水溶液中混合，进行反应，得到具有增强作用的微片-金纳米棒；
(2)用显微镜观察微片-金纳米棒结合效果。
6.根据权利要求1所述的一种基于微片的表面拉曼增强基底的制备和检测方法，其特征在于，步骤5)包括：
(1)将微片-金纳米棒用乙醇溶液重新洗涤后，再分散于乙醇溶液中，同时将拉曼报告分子超声溶于乙醇溶液，最后，将具有微片-金纳米棒的乙醇溶液与具有拉曼报告分子的乙醇溶液混合，使两者进行反应，得到微片-金纳米棒-拉曼报告分子；
(2)采用扫描电子显微镜观察微片-金纳米棒-拉曼报告分子结合效果；采用显微激光共聚焦拉曼光谱仪检测微片-金纳米棒-拉曼报告分子的拉曼光谱。
7.根据权利要求6所述的一种基于微片的表面拉曼增强基底的制备和检测方法，其特征在于，第(1)步具体是天平称取200毫克拉曼报告分子，并且超声溶于2ml乙醇溶液中，待完全溶解后，与具有微片-金纳米棒的乙醇溶液混合，搅拌2小时后静置反应至少12小时，得到微片-金纳米棒-拉曼报告分子。
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