CN109239033B - 一种银纳米簇荧光探针和铀酰离子的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于化学分析领域，尤其涉及一种银纳米簇荧光探针和铀酰离子的检测方法。本发明提供的荧光探针按照以下方法制备得到：a)在还原剂存在下，发夹型DNA和银盐在溶剂中进行反应，得到银纳米簇荧光探针；所述发夹型DNA的序列为5'‑ATAGTCCCCCCACTAT‑3'。本发明合成的荧光探针具有良好的荧光强度以及稳定性，并能被铀酰离子淬灭，非常适用于定性和定量检测样品中的铀酰离子。实验结果表明，本发明提供的荧光探针的激发波长(Ex)为420nm，发射波长(Em)为525nm，荧光探针的稳定性良好；在一定的pH条件下，当UO₂ ²⁺存在时，该荧光探针的荧光强度在一定范围内随UO₂ ²⁺浓度变化呈线性关系。

Description

一种银纳米簇荧光探针和铀酰离子的检测方法

技术领域

本发明属于化学分析领域，尤其涉及一种银纳米簇荧光探针和铀酰离子的检测方法。

背景技术

随着科学技术的发展，我们接触到铀(uranium,U)制品(如水银温度计、核电等)的机会日益增多，它们可对机体神经系统、肾脏、肝脏以及骨骼等造成急性或慢性损伤。2011年3月，日本福岛第一核电站发生了核事故，作为核原料的铀的泄露导致临近土壤受到污染，人们通过食用受污染土壤种植的当地食品农产品受到损害，轻则引起中毒、诱发多种疾病，重则产生严重的脾、肺、肾等的癌变和病理反应，不少国家对日本出口的部门农产品发出禁令。因此建立一种快速、可靠并能用于土壤中铀污染物的监测、毒性效应机制及防治研究的方法已成为环境科学和生命科学等领域的研究热点。

目前国内外用于检测铀的方法主要有色谱法，质谱法，原子吸收光谱法和紫外可见分光光度法。前三种技术由于仪器昂贵、样品预处理复杂，紫外可见分光光度法由于灵敏度较低导致它们的应用受限。荧光光谱法因其具有检测限低、灵敏度高、选择性好、取样量少、操作简单、设备成本低等优点，已成为目前测量环境样品中微量铀的主要方法之一。然而由于不少物质本身不发荧光，不能进行直接的荧光测定，需使用到机荧光染料，但有机荧光染料存在生物相容性差、光漂白严重、稳定性差等缺陷，严重限制了其的应用及发展。因此设计与合成能避免以上问题的新型荧光探针具有十分重大的意义。

银纳米簇(silver nanoclusters,AgNCs)通常是指由几个到几十个银原子所组成的尺寸在2nm以下的聚集体。由于其尺寸接近电子的费米能级，当特定波长的光作用于金属纳米簇的表面时，电子跃迁并产生强烈的光吸收和发射，表现出独特的光学特性。同时，因其光稳定性好、易于合成、水溶性好、毒性低、生物相容性好等优点，已成为在荧光分析中具有应用前景很好的探针之一。

银纳米簇的合成需要稳定剂的存在，如果合成过程中没有合适的稳定剂存在，银纳米簇会发生强烈地相互作用和不可逆的聚集，形成较大的无荧光的纳米颗粒。目前，以不同构型稳定剂合成的银纳米簇在检测汞离子和铅离子方面得到了广泛的应用，但是以银纳米簇作为荧光探针检测铀酰离子的研究尚未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种银纳米簇荧光探针和铀酰离子的检测方法，本发明提供的银纳米簇荧光探针具有良好的荧光强度以及稳定性，可用于对铀酰离子进行定性和定量检测。

本发明提供了一种银纳米簇荧光探针，按照以下方法制备得到：

a)在还原剂存在下，发夹型DNA和银盐在溶剂中进行反应，得到银纳米簇荧光探针；

所述发夹型DNA的序列为5'-ATAGTCCCCCCACTAT-3'。

优选的，所述发夹型DNA和银盐中Ag⁺的摩尔比为1：(3～15)。

优选的，所述发夹型DNA在反应体系中的浓度为5～20μmol/L。

优选的，步骤a)中，反应体系中还含有pH缓冲剂，所述反应的pH值为6～8。

优选的，所述步骤a)具体包括：

a1)发夹型DNA、银盐和溶剂混合，得到混合液；

a2)所述混合液与还原剂混合，避光反应，得到银纳米簇荧光探针。

优选的，步骤a2)中，所述避光反应的温度为2～6℃；所述避光反应的时间为48～96h。

本发明提供了一种铀酰离子的检测方法，包括以下步骤：

将待测液与上述技术方案所述的银纳米簇荧光探针混合反应，测定反应液的荧光强度，根据测得的荧光强度定性检测所述待测液中的UO₂ ²⁺。

优选的，所述待测液与银纳米簇荧光探针在非碱性条件下混合反应；

所述非碱性条件的pH值为4～7。

优选的，还包括：

根据测得的荧光强度和预先建立的UO₂ ²⁺含量标准曲线计算得到所述待测液中UO₂ ^{2 +}的含量。

优选的，所述待测液按照以下方法制备得到：

待测土壤加酸消解，得到提取液；之后将所述提取液的pH值调节至中性，得到待测液。

与现有技术相比，本发明提供了一种银纳米簇荧光探针和铀酰离子的检测方法。本发明提供的荧光探针按照以下方法制备得到：a)在还原剂存在下，发夹型DNA和银盐在溶剂中进行反应，得到银纳米簇荧光探针；所述发夹型DNA的序列为5'-ATAGTCCCCCCACTAT-3'。本发明以环部为富胞嘧啶的发夹型DNA(5'-ATAGTCCCCCCACTAT-3')作为合成银纳米簇荧光探针的稳定剂，合成的荧光探针具有良好的荧光强度以及稳定性，并能被铀酰离子淬灭，非常适用于定性和定量检测样品中的铀酰离子。实验结果表明，本发明提供的银纳米簇荧光探针的激发波长(Ex)为420nm，发射波长(Em)为525nm，荧光探针的稳定性良好；当UO₂ ²⁺存在时，该荧光探针的荧光强度在一定范围内随UO₂ ²⁺浓度变化呈线性关系。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1提供的DNA-AgNCs合成路线图；

图2是本发明实施例1提供的DNA-AgNCs的荧光激发和发射光谱；

图3是本发明实施例1提供的DNA-AgNCs的透射电镜图；

图4是本发明实施例1提供的DNA-AgNCs在一周内的荧光值变化曲线图；

图5是本发明实施例2提供的DNA/AgNO₃浓度比率对DNA-AgNCs荧光的影响图；

图6是本发明实施例2提供的AgNO₃/NaBH₄浓度比率对DNA-AgNCs荧光的影响图；

图7是本发明实施例2提供的NH₄Ac-HAc用量对DNA-AgNCs荧光的影响图；

图8是本发明实施例2提供的冰浴时间对DNA-AgNCs荧光的影响图；

图9是本发明实施例4提供的不同缓冲溶液种类下的ΔF/F₀值柱状图；

图10是本发明实施例4提供的不同缓冲溶液pH下的ΔF/F₀值点线图；

图11是本发明实施例4提供的不同缓冲溶液用量下的ΔF/F₀值点线图；

图12是本发明实施例4提供的不同反应温度下的ΔF/F₀值点线图；

图13是本发明实施例4提供的不同反应时间下的ΔF/F₀值点线图；

图14是本发明实施例6提供的UO₂ ²⁺的标准曲线图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种银纳米簇荧光探针，按照以下方法制备得到：

a)在还原剂存在下，发夹型DNA和银盐在溶剂中进行反应，得到银纳米簇荧光探针；

所述发夹型DNA的序列为5'-ATAGTCCCCCCACTAT-3'。

本发明提供的银纳米簇荧光探针(DNA-AgNCs)由发夹型DNA、银盐、还原剂在溶剂中混合反应制成。其中，所述发夹型DNA的序列为5'-ATAGTCCCCCCACTAT-3'，上述序列的DNA优选由上海生工有限公司提供；所述银盐优选为AgNO₃；所述还原剂优选为NaBH₄；所述溶剂优选为水。在本发明中，所述发夹型DNA在反应体系中的浓度优选为5～20μmol/L，具体可为5μmol/L、6μmol/L、7μmol/L、8μmol/L、9μmol/L、10μmol/L、11μmol/L、12μmol/L、13μmol/L、14μmol/L、15μmol/L、16μmol/L、17μmol/L、18μmol/L、19μmol/L或20μmol/L；所述发夹型DNA和银盐中Ag⁺的摩尔比优选为1：(3～15)，具体可为1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14或1:15；所述盐中Ag⁺和还原剂的摩尔比优选为(0.2～4)：1，具体可为0.2:1、0.3:1、0.33:1、0.34:1、0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1或4:1。在本发明中，反应体系中优选还含有pH缓冲剂，所述pH缓冲剂优选为NH₄Ac-HAc，通过pH缓冲剂优选将反应的pH值控制在6～8，具体为6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8。本发明提供的一个实施例中，所述pH缓冲剂以pH缓冲剂溶液的形式添加到反应体系中，所述pH缓冲剂溶液的pH值具体为6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8，所述pH缓冲剂溶液的用量优选占反应体系总体积的5～30％，具体可为5％、10％、15％、20％、25％或30％。

在本发明中，反应制备所述银纳米簇荧光探针的具体过程包括：

a1)发夹型DNA、银盐和溶剂混合，得到混合液；

a2)所述混合液与还原剂混合，避光反应，得到银纳米簇荧光探针。

在本发明提供的上述制备过程中，首先将发夹型DNA、银盐和溶剂混合，优选先分别将发夹型DNA、银盐分别与部分溶剂混合，得到对应的溶液，再将各溶液与余量的溶剂混合。其中，发夹型DNA溶液的浓度优选为50～200μmol/L，具体可为50μmol/L、60μmol/L、70μmol/L、80μmol/L、90μmol/L、100μmol/L、110μmol/L、120μmol/L、130μmol/L、140μmol/L、150μmol/L、160μmol/L、170μmol/L、180μmol/L、190μmol/L或200μmol/L；银盐溶液的浓度优选为0.5～2mmol/L，具体可为0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、1mmol/L、1.1mmol/L、1.2mmol/L、1.3mmol/L、1.4mmol/L、1.5mmol/L、1.6mmol/L、1.7mmol/L、1.8mmol/L、1.9mmol/L或2mmol/L。发夹型DNA、银盐和溶剂混合均匀后，得到混合液。

在本发明提供的上述制备过程中，得到所述混合液后，将其与还原剂混合。在本发明中，得到所述混合液后优选先在冰浴中放置一段时间，再与还原剂混合，所述放置的时间优选为0～60min，具体可为0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min。在本发明中，所述还原剂优选以还原剂溶液的形式与所述混合液混合，所述还原剂溶液的浓度优选为，0.5～2mmol/L，具体可为0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、1mmol/L、1.1mmol/L、1.2mmol/L、1.3mmol/L、1.4mmol/L、1.5mmol/L、1.6mmol/L、1.7mmol/L、1.8mmol/L、1.9mmol/L或2mmol/L；所述混合液与还原的混合优选在震荡条件下进行，混合的时间优选为10～60s，具体可为10s、15s、20s、25s、30s、35s、40s、45s、50s、55s或60s。在本发明提供的一个实施例中，若反应体系中还含有pH缓冲剂，则pH缓冲剂优选以缓冲剂溶液的形式在发夹型DNA溶液、银盐溶液和余量溶剂混合时添加。

在本发明提供的上述制备过程中，待所述混合液与还原剂混合完毕后，避光反应。其中，所述避光反应的温度优选为2～6℃，具体可为2℃、2.5℃、3℃、3.5℃、4℃、4.5℃、5℃、5.5℃或6℃；所述避光反应的时间优选为48～96h，具体可为48h、50h、52h、54h、56h、58h、60h、62h、64h、66h、68h、70h、72h、74h、76h、78h、80h、82h、84h、86h、88h、90h、92h、94h或96h。避光反应结束后，得到银纳米簇荧光探针。

本发明以环部为富胞嘧啶的发夹型DNA(5'-ATAGTCCCCCCACTAT-3')作为合成银纳米簇荧光探针的稳定剂，合成的荧光探针具有良好的荧光强度以及稳定性，并能被铀酰离子淬灭，非常适用于定性和定量检测样品中的铀酰离子。实验结果表明，本发明提供的银纳米簇荧光探针的激发波长(Ex)为420nm，发射波长(Em)为525nm，荧光探针的稳定性良好；当UO₂ ²⁺存在时，该荧光探针的荧光强度在一定范围内随UO₂ ²⁺浓度变化呈线性关系。

本发明提供了一种铀酰离子的检测方法，包括以下步骤：

将待测液与上述技术方案所述的银纳米簇荧光探针混合反应，测定反应液的荧光强度，根据测得的荧光强度定性检测所述待测液中的UO₂ ²⁺。

在本发明提供的检测方法中，首先将待测液与所述银纳米簇荧光探针混合反应。其中，所述待测液可以为待测水样，也可以是经过预处理的其他待测样品。在本发明提供的一个实施例中，对土壤中的含铀情况进行检测，其预处理过程具体包括：

待测土壤加酸消解，得到提取液；之后将所述提取液的pH值调节至中性，得到待测液。

在本发明提供的上述土壤样品预处理过程中，首先对待测土壤进行加酸消解，具体方式可以包括：首先将待测土壤和盐酸混合加热，待加热蒸发至尽干时，将其与硝酸、氢氟酸和高氯酸混合加热，待加热至形成粘稠液体后，将其与硝酸溶液混合，最后待混合液冷却后定容。待测土壤加酸消解后，得到提取液，之后将所述提取液的pH值调节至中性，得到待测液。在本发明中，提取液进行pH调节时所采用的pH值调节试剂优选为NH₄Ac-HAc缓冲剂。

在本发明提供的检测方法中，待测液与所述银纳米簇荧光探针混合反应的过程中，所述银纳米簇荧光探针在反应体系中的含量(以发夹型DNA计)优选为0.5～3μmol/L，具体可为0.5μmol/L、1μmol/L、1.5μmol/L、2μmol/L、2.5μmol/L或3μmol/L。在本发明中，所述待测液与所述银纳米簇荧光探针优选在非碱性条件下混合反应，所述非碱性条件的pH值优选为4～7，具体可为4、4.5、5、5.5、6、6.5或7。在本发明中，优选通过缓冲液调控反应体系的pH值，所述缓冲液包括但不限于HAc-NaAc缓冲液、tris-HAc缓冲液或NH₄Ac-HAc缓冲液，优选为NH₄Ac-HAc缓冲液。在本发明中，所述缓冲液的用量优选占反应体系总体积的5～30％，具体可为5％、10％、15％、20％、25％或30％。在本发明中，所述混合反应的温度优选为10～40℃，具体可为10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃；所述混合反应的时间优选为5～30min，具体可为5min、10min、15min、20min、25min或30min。

在本发明提供的检测方法中，待测液与所述银纳米簇荧光探针混合反应结束后，测定反应液的荧光强度。在本发明提供的一个实施例中，所测定的荧光强度优选为500～550nm处的荧光强度，更优选为525nm处的荧光强度。获得反应液的荧光强度后，若反应液的荧光强度比相同银纳米簇荧光探针浓度下的空白对照样的荧光强度低(即银纳米簇荧光探针与待测液反应后出现荧光淬灭现象)，则表明待测液中含有UO₂ ²⁺，反之亦然。在本发明中，通过检测待测液是否会引起银纳米簇荧光探针产生荧光淬灭，可实现待测液中UO₂ ²⁺的定性检测。

在本发明提供的检测方法中，还可以在获得反应液的荧光强度后，根据所述荧光强度和预先建立的UO₂ ²⁺含量标准曲线计算得到所述待测液中UO₂ ²⁺的含量，即实现待测液中UO₂ ²⁺的定量检测。

在本发明提供的一个实施例中，以荧光淬灭的程度(F₀-F)作为定量检测UO₂ ²⁺的参数，标准曲线可按照以下方式建立：

配制不含UO₂ ²⁺的空白试样和一系列已知浓度的UO₂ ²⁺标准液，将其分别与所述银纳米簇荧光探针混合反应，混合反应的条件与待测液与所述银纳米簇荧光探针混合反应时一致，反应结束后，测定反应液的荧光强度值，以F₀-F的差值为纵坐标，标准液的UO₂ ²⁺浓度为横坐标，绘制标准曲线。其中，F₀表示不含UO₂ ²⁺的空白试样与银纳米簇荧光探针混合后测定的荧光强度值，F表示标准液与银纳米簇荧光探针混合反应后测定的荧光强度值。

本发明提供的检测方法通过利用本发明提供的银纳米簇荧光探针能被铀酰离子淬灭的特性，通过检测待测样品是否会引起银纳米簇荧光探针产生荧光淬灭，以及淬灭程度，实现了对待测样品中铀酰离子的定性和定量检测。实验结果表明，本发明提供的检测方法的UO₂ ²⁺检出限为1.8pM，专属性、精密度和准确性良好。

为更清楚起见，下面通过以下实施例进行详细说明。

本发明下述实施例涉及的试剂与仪器如下：

1)主要试剂

硝酸银(1.0mM)：称取AgNO₃0.0085g，溶解后转至50mL容量瓶中，用超纯水定容混匀后于棕色试剂瓶保存，低温避光处保存备用；

硼氢化钠(1.0mM)：称取NaBH₄0.0378g，超纯水溶解后转至25mL容量瓶中，超纯水定容至25mL，混匀后从中取10μL加入390μL水，混匀后使用(NaBH₄现配现用)；

铀标准液：准确称量0.0502g UO₂(NO₃)₂·6H₂O标准品，用超纯水溶解后转至100mL容量瓶中，定容得到1.00mM储备液，于4℃环境下保存，使用时稀释到目标浓度；

NH₄Ac-HAc缓冲液(200mM，pH 6.8)：称取乙酸铵3.8540g，溶解后转至250mL容量瓶中，用超纯水定容混匀后于棕色试剂瓶保存，低温避光处保存备用。用冰乙酸和氨水将缓冲液pH调至3～7；

DNA制品由上海生工有限公司合成，序列如下：5'-ATAGTCCCCCCACTAT-3'。用DEPC水制备的DNA储备溶液，使用前95℃加热5分钟，然后缓慢退火至室温待用。

2)主要仪器

在本发明的下述实施例中，所用试剂均为分析纯，在使用前没做任何特殊的处理，所用到的玻璃器皿均用王水浸泡过夜，并且用超纯水清洗烘干，一次性器材在使用前均是用超纯水超声清洗并烘干，实验所用的水均为超纯水(电阻为18.25MΩ·cm)。

实施例1

1)发夹型DNA-银纳米簇(DNA-AgNCs)的合成

按照图1所示路线合成DNA-AgNCs，图1是本发明实施例1提供的DNA-AgNCs合成路线图。具有过程包括：在4mL EP管中依次加入600μL 200mM NH₄Ac-HAc缓冲液(pH 6.8)，300μL 100μM DNA溶液，1785μL水和210μL 1mM AgNO₃，混匀后冰浴30分钟，再将新制的NaBH₄(105μL，1mM)迅速加入上述混合物中，并且剧烈震荡30s以还原银离子。混合物在黑暗、4℃条件下反应72h合成稳定的DNA-AgNCs后待用。DNA、AgNO₃和NaBH₄的最终浓度分别为10μM、70μM和35μM。

2)荧光光谱实验

取15μL合成的DNA-AgNCs，加入85μL超纯水，振荡混匀后置于荧光分光光度计中在350～700nm波长范围内扫描得到具体的激发波长(Ex)和发射波长(Em)，结果如图2所示，图2是本发明实施例1提供的DNA-AgNCs的荧光激发和发射光谱。通过图2可以看出，本实施例合成的DNA-AgNCs的激发波长(Ex)为420nm，发射波长(Em)为525nm，说明合成的DNA-AgNCs具有优良的荧光特性。

本发明下述实施例涉及荧光检测时，均在420nm激发波长和525nm发射波长条件下进行。

3)透射电镜(TEM)对DNA-AgNCs的表征

将合成的DNA-AgNCs振荡混匀后滴加在铜网上，干燥后置于透射电镜下观察银纳米簇的形貌，结果如图3所示，图3是发明实施例1提供的DNA-AgNCs的透射电镜图，图3中主图是低分别率TEM图像，插图为高分辨TEM图像。通过图3的主图可以看出，本实施例合成的DNA-AgNCs是球形的，且具有良好的分散性，平均尺寸介于2～3nm；通过图3的插图可以看出，本实施例合成的AgNCs具有良好的晶体结构及均匀的晶格距离。

4)DNA-AgNCs的稳定性评价

取15μL合成的DNA-AgNCs加入85μL超纯水混匀，每隔一段时间检测其荧光强度，结果如图4所示，图4是发明实施例1提供的DNA-AgNCs在一周内的荧光值变化曲线图。通过图4可以看出，在DNA-AgNCs合成好的前3天，荧光逐渐增强，第3天到第5.5天的荧光强度较为稳定，之后荧光逐渐淬灭。可见，本实施例合成的DNA-AgNCs具有较好的稳定性。

实施例2

DNA-AgNCs合成条件的比较

1)DNA/AgNO₃浓度比率的影响

本实施例考察了在40mM NH₄Ac-HAc缓冲液、10μM DNA、30μM NaBH₄存在的前提下，DNA与AgNO₃的浓度比率为1：4，1：5，1：6，1：7，1：8，1：9时反应24h对合成的DNA-AgNCs荧光强度的影响(其他合成条件参照实施例1)。

结果如图5所示，图5是本发明实施例2提供的DNA/AgNO₃浓度比率对DNA-AgNCs荧光的影响图，由图5可知，随着DNA与硝酸银浓度比率的增加，体系的荧光强度不断提高，DNA与硝酸银的比例为1：7，体系的荧光强度达到最大值，大于1：7时，体系的荧光强度反而降低。也就是，当DNA的浓度为10μM时，最优的硝酸银浓度为70μM。

2)AgNO₃/NaBH₄浓度比率的影响

本实施例考察了在40mM NH₄Ac-HAc缓冲液、10μM DNA、70μM AgNO₃存在的前提下，AgNO₃与NaBH₄的浓度比率为3：1，2：1，1：1，1：2，1：3时反应24h对合成的DNA-AgNCs荧光强度的影响(其他合成条件参照实施例1)。

结果如图6所示，图6是本发明实施例2提供的AgNO₃/NaBH₄浓度比率对DNA-AgNCs荧光的影响图。由图6可知，随着AgNO₃与NaBH₄浓度比率的增加，体系的荧光强度不断提高，AgNO₃与NaBH₄的比例为2：1，体系的荧光强度达到最大值。也就是，当AgNO₃的浓度为70μM时，最优的硼氢化钠浓度为35μM。

3)NH₄Ac-HAc用量的影响

本实施例考察了在10μM DNA、70μM AgNO₃、35μM NaBH₄存在的前提下，反应体系总体积为100μL时，NH₄Ac-HAc(pH 6.8)的用量分别为0μL，10μL，20μL，25μL，30μL，40μL时，反应24h对合成的DNA-AgNCs荧光强度的影响(其他合成条件参照实施例1)。

结果如图7所示，图7是本发明实施例2提供的NH₄Ac-HAc用量对DNA-AgNCs荧光的影响图。通过图7可以看出，NH₄Ac-HAc用量为25μL后荧光强度几乎保持不变。

4)冰浴时间的影响

本实施例考察了在40mM NH₄Ac-HAc缓冲液、10μM DNA、70μM AgNO₃、35μM NaBH₄存在的前提下，冰浴时间为0min，10min，20min，30min，40min，50min，60min时，反应24h对合成的DNA-AgNCs荧光强度的影响(其他合成条件参照实施例1)。

结果如图8所示，图8是本发明实施例2提供的冰浴时间对DNA-AgNCs荧光的影响图。通过图8可以看出，冰浴30min时荧光强度最大。

实施例3

UO₂ ²⁺的检测

1)将一定量的UO₂ ²⁺、20μL pH 5.0的NH₄Ac-HAc缓冲液和15μL实施例1合成的DNA-AgNCs加入EP管中，用超纯水定容至100μL，混合液混匀后，在25℃下静置反应15min，检测反应液在525nm处的荧光强度，记为F。

2)参照步骤1)的实验过程，其区别仅在于不添加UO₂ ²⁺，检测其在525nm处的荧光强度，记为F₀。

结果发现，F₀-F＞0，说明实施例1合成的DNA-AgNCs可被UO₂ ²⁺淬灭。

本实施例进一步检测不同UO₂ ²⁺添加量下的反应液荧光强度，结果发现，随着体系中UO₂ ²⁺浓度增加，且体系的荧光强度逐渐降低，在一定范围内荧光强度随UO₂ ²⁺浓度变化呈线性关系。

实施例4

UO₂ ²⁺检测条件的比较

1)缓冲液种类的影响

本实施例比较了反应体系中的UO₂ ²⁺终浓度为30pM的前提下，pH 7.0的HAc-NaAc、tris-HAc、NH₄Ac-HAc三种缓冲液对反应体系ΔF/F₀值的影响(ΔF＝F₀-F)，具体检测过程参照实施例3，其区别仅在于将实施例3中pH 5.0的NH₄Ac-HAc缓冲液替换成上述三种缓冲液。

结果如图9所示，图9是本发明实施例4提供的不同缓冲溶液种类下的ΔF/F₀值柱状图。通过图9可以看出，NH₄A_C-HAc缓冲溶液使体系具有最大的ΔF/F₀值。

2)缓冲液pH的影响

本实施例比较了反应体系中的UO₂ ²⁺终浓度为30pM的前提下，不同pH(4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0)的NH₄Ac-HAc缓冲溶液对体系ΔF/F₀的影响，具体检测过程参照实施例3，其区别仅在于将实施例3中的NH₄Ac-HAc缓冲液的pH值替换成4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0。

结果如图10所示，图10是本发明实施例4提供的不同缓冲溶液pH下的ΔF/F₀值点线图。通过图10可以看出，pH过低或过高都会使ΔF/F₀值降低，当pH为5.0时，ΔF/F₀达到最大。

3)缓冲液用量的影响

本实施例比较了反应体系中的UO₂ ²⁺终浓度为30pM的前提下，不同NH₄Ac-HAc缓冲溶液的用量(5μL，10μL，15μL，20μL，25μL，30μL)对体系ΔF/F₀值的影响，具体检测过程参照实施例3，其区别仅在于将实施例3中的NH₄Ac-HAc缓冲液的用量替换成5μL，10μL，15μL，20μL，25μL，30μL。

结果如图11所示，图11是本发明实施例4提供的不同缓冲溶液用量下的ΔF/F₀值点线图。通过图11可以看出，随着缓冲液用量的增加，ΔF/F₀值增大，当NH₄Ac-HAc缓冲液用量为20μL时，ΔF/F₀值达到最大，此后，随着缓冲溶液用量增加，ΔF/F₀值逐渐下降。

4)温度的影响

本实施例比较了反应体系中的UO₂ ²⁺终浓度为30pM的前提下，不同反应温度(10℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃)对体系ΔF/F₀值的影响，具体检测过程参照实施例3，其区别仅在于将实施例3中的静置反应温度替换成10℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃。

结果如图12所示，图12是本发明实施例4提供的不同反应温度下的ΔF/F₀值点线图。通过图12可以看出，随着温度的升高ΔF/F₀值逐渐增大，当温度为25℃时达到最大，温度高于25℃后体系的ΔF/F₀值逐渐降低。

5)反应时间的影响

本实施例比较了反应体系中的UO₂ ²⁺终浓度为30pM的前提下，不同反应时间(5min，10min，15min，20min，25min，30min)对体系ΔF/F₀值的影响，具体检测过程参照实施例3，其区别仅在于将实施例3中的静置反应时间替换成5min，10min，15min，20min，25min，30min。

结果如图13所示，图13是本发明实施例4提供的不同反应时间下的ΔF/F₀值点线图。通过图13可以看出，ΔF/F₀值随着反应时间的延长不断增大，当反应15min后，ΔF/F₀值达到最大，当反应继续进行时，ΔF/F₀值逐渐降低，在15分钟达到最大值。

实施例5

干扰离子对UO₂ ²⁺检测的影响

本实施例研究了待测水样中可能存在的一些金属离子(Al³⁺、Pb²⁺、Ce²⁺、Zn²⁺、La²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Ag⁺、Hg²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Mn²⁺、Cr⁶⁺)对UO₂ ²⁺检测体系的影响，具体过程包括：准备17支EP管中加入20μL NH₄Ac-HAc缓冲液和15μL实施例1合成的DNA-AgNCs，同时加入30μL 1.0×10^-10mol/L的UO₂ ²⁺以及30μL不同浓度的干扰离子(Al³⁺、Pb²⁺、Ce²⁺、Zn²⁺、La²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Ag⁺、Hg²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Mn²⁺、Cr⁶⁺)，超纯水定容至100μL，振荡混匀，置于25℃环境中反应15min，然后测定荧光强度值，改变干扰离子的浓度，直到相对误差在±5％以内，确定干扰离子的最高浓度，结果表1所示：

表1干扰离子对UO₂ ²⁺检测的影响

通过表1可以看出，3.0×10^-8mol/L的Al³⁺、Pb²⁺、Ce²⁺、Zn²⁺、La²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Ag⁺、Hg^{2 +}，1.5×10^-8mol/L的Ca²⁺、Ba²⁺、Mn²⁺、Cr⁶⁺均不干扰UO₂ ²⁺的检测，也就是说，1000倍的Al³⁺、Pb^{2 +}、Ce²⁺、Zn²⁺、La²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、Ag⁺、Hg²⁺，500倍Ca²⁺、Ba²⁺、Mn²⁺、Cr⁶⁺均不影响UO₂ ²⁺的测定结果。

实施例6

标准曲线、检出限及精密度

1)UO₂ ²⁺标准曲线：

配制浓度为1.0×10^-10M和1.0×10^-9M的UO₂ ²⁺标准液，在7支EP管中，加入20μLNH₄Ac-HAc缓冲液15μL实施例1合成的DNA-AgNCs，再依次加入0μL、4μL、15μL、30μL、45μL、60μL 1.0×10^-10M和7.5μL1.0×10^-9M的UO₂ ²⁺标准液，用超纯水定容至100μL，振荡混匀，25℃条件下反应15min，测定荧光强度值，F₀-F的差值为纵坐标，UO₂ ²⁺浓度c为横坐标，绘制标准曲线，结果如图14所示，图14是本发明实施例6提供的UO₂ ²⁺的标准曲线图。通过图14可以看出，UO₂ ²⁺浓度在4.0×10^-12～7.5×10^-11mol/L范围内与的差值呈较好的线性关系，线性回归方程为y＝16.67c(pM)+1026.76，相关系数r＝0.996。

2)UO₂ ²⁺检出限：

在11支EP管中，加入20μL pH 5.0的NH₄Ac-HAc缓冲液、15μL实施例1合成的DNA-AgNCs，超纯水定容至100μL，振荡混匀，25℃条件下反应15min，测定荧光强度值，由公式LOD＝3S_b/k(S_b为空白标准偏差。k为标准曲线的斜率)得到UO₂ ²⁺的检出限为1.8pM。

(3)UO₂ ²⁺检测精密度：

准备3组EP管，每组11支，第1组中加入20μL pH 5.0的NH₄Ac-HAc缓冲液，15μL实施例1合成的DNA-AgNCs，10μL 1.0×10^-10M的UO₂ ²⁺，第2组中加入20μL NH₄Ac-HAc缓冲液，15μL实施例1合成的DNA-AgNCs，30μL 1.0×10^-10M的UO₂ ²⁺、第3组中加入20μL NH₄Ac-HAc缓冲液，15μL实施例1合成的DNA-AgNCs，60μL 1.0×10^-10M的UO₂ ²⁺，超纯水定容至100μL，振荡混匀，25℃条件下反应15min，测定荧光值，计算对应的相对标准偏差，依次为2.83％、0.58％、0.86％。

实施例7

1)实际样品的预处理

含铀土壤(加标样)的制备：按18mg/kg土壤标准加入铀。分别从空白土壤和加标土壤中称取0.2g于50mL聚四氟乙烯坩埚中，用水润湿后加入6mL盐酸，于电热板上低温加热，使样品初步分解，待蒸发至尽干时，稍冷后加入3mL硝酸、2mL氢氟酸、2mL高氯酸，加盖，于电热板上中温加热1h，后开盖继续加热除硅，为了达到良好的飞硅效果，应经常振动坩埚。当加热至冒浓白烟时，加盖分解黑色有机碳化物。待坩埚壁上的黑色有机物消失后，开盖，驱赶白烟并蒸至黏稠状(视消解情况，可补加酸)。取下坩埚稍冷，加入1mL硝酸溶液和少量蒸馏水，温热溶解可溶性残渣，冷却后全量转移至100mL容量瓶中，定容。取空白土壤和加标样提取液各100μL，加入pH 9.2的NH₄Ac-HAc缓冲液300μL，将pH调至7.0(稀释4倍)，再用超纯水稀释1000倍(稀释了4000倍)。

2)加铀土壤的测定

在2mL EP管中加入20μLpH 5.0的NH₄Ac-HAc缓冲液，按照步骤1)的方法处理样品后取稀释4000倍的空白和样品各20μL，加入15μL实施例1合成的DNA-AgNCs，超纯水定容至100μL，振荡混匀，25℃条件下反应15min，测定荧光值，结果如表2所示：

表2样品中UO₂ ²⁺检测结果(n＝5)

注：表2中，n表示平行实验的次数。

该样品同时用ICP-MS进行检测，与本实施例检测结果一致，表明本发明提供的检测方法可行。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种铀酰离子的检测方法，包括以下步骤：

a)提供银纳米簇荧光探针；所述银纳米簇荧光探针按照以下步骤制备得到：在还原剂存在下，发夹型DNA和银盐在溶剂中进行反应，得到银纳米簇荧光探针；所述发夹型DNA的序列为5'-ATAGTCCCCCCACTAT-3'；

b)将待测液与所述银纳米簇荧光探针混合反应，测定反应液的荧光强度，根据测得的荧光强度定性检测所述待测液中的UO₂ ²⁺。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述发夹型DNA和银盐中Ag⁺的摩尔比为1：(3～15)。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述发夹型DNA在反应体系中的浓度为5～20μmol/L。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤a)中，反应体系中还含有pH缓冲剂，所述反应的pH值为6～8。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤a)具体包括：

a1)发夹型DNA、银盐和溶剂混合，得到混合液；

a2)所述混合液与还原剂混合，避光反应，得到银纳米簇荧光探针。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤a2)中，所述避光反应的温度为2～6℃；所述避光反应的时间为48～96h。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测液与银纳米簇荧光探针在非碱性条件下混合反应；

所述非碱性条件的pH值为4～7。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，还包括：

根据测得的荧光强度和预先建立的UO₂ ²⁺含量标准曲线计算得到所述待测液中UO₂ ²⁺的含量。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测液按照以下方法制备得到：

待测土壤加酸消解，得到提取液；之后将所述提取液的pH值调节至中性，得到待测液。

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