CN113512039A - 一种基于络合作用检测Cu+的荧光探针及其应用 - Google Patents

Abstract

一种基于络合作用检测Cu⁺的荧光探针及其应用。本发明提供了一种可视化检测亚铜离子的荧光探针AHP，特别是在特定的环境下用于在无氧环境中快速可视化定量检测亚铜。该探针可以在无氧环境中快速、高选择性地检测Cu⁺。探针中的硫元素与Cu⁺发生金属络合反应，产生光致电子转移(PET)效应。极大地抑制了探针的荧光，实现了亚铜离子的可视化检测。并且探针本身具有较高的量子荧光产率和稳定的化学性质。因此，在空气中可以保持稳定的荧光强度，有利于检测活动的开展和实验结果的准确性。该探针在人体细胞的检测和应用方面具有巨大的潜力，为未来的分析和检测铺平了道路。

Description

一种基于络合作用检测Cu+的荧光探针及其应用

技术领域

本发明涉及亚铜离子荧光分析检测技术领域，特别涉及一种在特定的环境下对亚铜离子的线性检测。

背景技术

铜是生命中必不可少的氧化还原活性营养素。在人体内氧运输、呼吸代谢和细胞生长过程中，蛋白质含有其必要的有效催化和结构辅助因子。除了蛋白质中含有的铜离子，新出现的数据表明还存在不稳定的亚铜离子。由于它们的化学不稳定性，它们与低分子量配体的结合相对较弱。然而，亚铜离子在人类活动中起着至关重要的作用。它促进了越来越多的动态过渡金属信号通路，包括神经通讯、气味和脂肪分解。然而，人体内铜比例失衡会导致多种疾病，如癌症、心血管疾病、神经退行性阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病、糖尿病和肥胖症以及遗传门和威尔逊病。

因此，开发一种能够实时监测人体内亚铜离子含量的方法变得越来越重要。越来越多的检测方法被发明出来。荧光灯、生物发光和磁共振成像探针为亚铜离子的目视观察提供了重要方法。然而，这些方法涉及使用仪器量大、携带不便、样品前处理过程复杂、检测成本高，且不能进行亚铜离子的现场检测。因此，设计用于在生理还原条件下测量Cu⁺的荧光探针非常重要。

由于π-π、p-π共轭体系和咪唑化合物在可见光波长范围内的光学效应，这些化合物在荧光探针(F Ma,Sun M,Zhang K,et al.An oxidative cleavage-based ratiometricfluorescent probe for hypochlorous acid detection and imaging[J].RSCADVANCES,2014,4(104):59961-59964.)和有机染料(Tsai M S,Hsu Y C,Lin J T,etal.Organic Dyes Containing 1H-Phenanthro[9,10-d]imidazole Conjugation forSolar Cells[J].Journal of Physical Chemistry C,2007,111(50):18785-18793)等各个领域都有潜在的应用。咪唑环的合成通常需要特定的环境条件。

可见，亚铜离子是人类生命活动必不可少的元素。然而，过量的亚铜会导致人体系统功能失调。为了帮助解释这种不断发展的生物学，我们报告了一种用于检测不稳定Cu(I)的淬灭型荧光探针AHP。

发明内容

本发明的目的是提供一种可视化检测亚铜离子的荧光探针，特别是在特定的环境下用于在无氧环境中快速可视化定量检测亚铜。

本发明的荧光探针分子式为C₁₅H₁₄CuN₂S，结构式(AHP)如下：

本发明的所述荧光探针的制备方法，包括步骤：将N-(4-甲基苄基)-1-(吡啶-2-基)甲胺(MDPA,(4-methylbenzyl)-pyridin-2-ylmethl-amine，sigma-aldrich)和氨水添加到二氯甲烷(DCM)和乙醇混合溶剂中混匀并在冰浴冷却20-40分钟，然后滴加CS₂，滴毕在室温下搅拌8-12小时产生黄色溶液，将溶液在硅胶柱上进行色谱分离，真空干燥即得。所述氨水为常用氨水，浓度一般25-28wt％。冰浴温度-10-0℃为佳。

具体反应式如下：

将本发明所述荧光探针在检测Cu⁺中应用，其是通过在无氧的中性或碱性环境下使荧光探针与Cu⁺发生金属络合反应，使得荧光探针的荧光发生淬灭。具体反应式如下：

由于探针在中性和碱性条件下荧光响应明显，因此测试了NaOH加入量，使探针起始荧光强度达到最大。本发明优选向5mL浓度为10mM的荧光探针溶液中，加入50μL浓度为0.4M的NaOH溶液，然后加入到含Cu⁺的体系中，所述含Cu⁺的体系为无氧或厌氧环境。其中，所述的荧光探针溶液为乙醇溶液，并可配制10mM的荧光探针母液置于室温中备用。因为只有在此环境下，荧光探针才会有较为明显的荧光响应。

本发明还进行了将探针应用于血清蛋白中Cu⁺的检测。向血清蛋白中加入不同浓度的Cu⁺溶液，检测其回收率。从而发现他在检测人体细胞中Cu⁺浓度的潜在应用。也就是说，本发明所述荧光探针可在制备用于检测血清蛋白中Cu⁺的检测体系中应用，所述检测体系包括检测试剂盒、检测试剂、检测试纸等等。

本发明探究了AHP在特定溶剂中被Cu⁺淬灭荧光，为有机荧光分析检测提供了重要思路。本发明验证了AHP的金属络合机制，从而光致电子转移淬灭探针荧光。

本发明中Cu⁺与探针中的硫元素发生金属络合反应，导致光致电子转移(PET)效应，极大抑制了探针的荧光，实现了快速、选择性地可视化检测无机环境中Cu⁺。并且探针荧光强度与Cu⁺浓度之间存在良好的线性关系(R²＝0.992)，可实现Cu⁺的定量检测。探针浓度为0.1μM时，检出限为15nM，目测法检出限低至0.1μM。这项工作为基于有源探针实时监测人体厌氧环境中的Cu⁺浓度提供了一个有价值的起点。

本发明开发出一种在室温下通过简单的步骤合成荧光分子AHP的方法。该探针可以在无氧环境中快速、高选择性地检测Cu⁺。探针中的硫元素与Cu⁺发生金属络合反应，产生光致电子转移(PET)效应，极大地抑制了探针的荧光，实现了亚铜离子的可视化检测(绿色荧光的明显猝灭)。并且探针本身具有较高的量子荧光产率和稳定的化学性质。因此，在空气中可以保持稳定的荧光强度，有利于检测活动的开展和实验结果的准确性。该探针在人体细胞的检测和应用方面具有巨大的潜力，为未来的分析和检测铺平了道路。

本发明的检测机理如下：亚铜离子与探针中的硫元素发生金属络合反应，导致光致电子转移(PET)效应。

附图说明

图1是添加10μL Cu⁺前后探针的激发和发射光谱。Ex激发；Em发射。

图2是在不同pH值下，探针对于Cu⁺的荧光淬灭响应。

图3是分别记录加入了不同量Cu⁺的AHP探针在420nm激发波长下连续照射15min探针的荧光稳定性。

图4是0.1μM AHP对不同浓度Cu⁺(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.3、1.7、2.2、2.8μM)的荧光响应与线性图谱。

图5是探针AHP的选择性和干扰性检测。上图显示Cu⁺相较其他离子荧光减弱显著；中图显示在其他离子中混合Cu⁺荧光减弱显著；下图显示加入其他离子时均显示绿色荧光，而加入Cu⁺绿色荧光消失猝灭。

具体实施方式

下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。

实施例1

探针制备：

将50μL N-(4-甲基苄基)-1-(吡啶-2-基)甲胺(MDPA)和30μL浓度25wt％的氨水(NH₃·H₂O)添加到2mL DCM/乙醇＝1:1混合溶剂中在冰浴中冷却30分钟。然后滴加35μLCS₂，滴毕，在室温下搅拌10小时。产生黄色溶液。将溶液在PET/EAC＝4:1的硅胶柱上进行色谱分离。然后真空干燥得到纯品。产率为61.2％。纯化后的探针分子进行高分辨质谱以及核磁共振测试：ESI-MS(m/z):255.09(M+H)⁺；277.07(M+Na)⁺；1H NMR(CDCl3,400MHz)δ:8.34(d,J＝7.4Hz,9H),7.28(m,32H),7.20(d,J＝7.8Hz,30H),7.08(s,9H),6.85(s,8H),6.73(m,8H),6.54(t,J＝6.8Hz,9H),5.49(s,20H)。与Cu⁺反应后的探针分子高分辨质谱测试：ESI-MS(m/z):339.23(M+Na)⁺。

实施例2

亚铜离子溶液配置：通过先后向探针中加入相同摩尔质量的FeCl₂和CuSO₄溶液得到。

随着Cu⁺浓度的不断增加，荧光强度逐渐降低，并表现出良好的线性关系，在0～2.8μM范围内的相关系数为0.992。它可用于量化较低浓度的Cu⁺。检测限为15nM。如图4。

实施例3

探针的选择性和干扰性验证：

在Ni²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Mg²⁺、Na⁺、K⁺、Mn²⁺、Cd²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、NH₄ ⁺、Cu²⁺、Ag⁺、Pb²⁺金属离子存在时为了检测探针选择性。加入两倍量其他离子与探针混合，研究了AHP对Cu⁺的抗干扰作用，结果如图5。即使加入过量的干扰金属离子，对探针的荧光也没有明显影响。与其他金属离子相比，该探针对Cu⁺具有高选择性。

实施例4

为了实现探针在生物学领域的应用，我们探索了探针检测血清蛋白中Cu⁺的能力。首先在血清样品中加入1、5、10μM的Cu⁺，通过记录反应前后的荧光强度确定含量。根据得到的线性方程，添加1、5和10μM时的Cu⁺回收率分别为94％、97.2％和93.5％，如下表1所示。结果表明设计的探针可用于检测血清蛋白中的Cu⁺。

表1

应当说明的是，本发明的上述所述之技术内容仅为使本领域技术人员能够获知本发明技术实质而进行的解释与阐明，故所述之技术内容并非用以限制本发明的实质保护范围。本发明的实质保护范围应以权利要求书所述之为准。本领域技术人员应当知晓，凡基于本发明的实质精神所作出的任何修改、等同替换和改进等，均应在本发明的实质保护范围之内。

Claims (7)

1.一种基于络合作用检测Cu⁺的荧光探针，命名：AHP，结构式如下：

2.权利要求1所述荧光探针的制备方法，包括步骤：

将(4-甲基-苄基)-吡啶-2-基甲基-胺和氨水添加到DCM和乙醇混合溶剂中冰浴冷却20-40分钟，然后滴加CS₂，滴加完毕在室温下搅拌8-12小时产生黄色溶液，将溶液在硅胶柱上进行色谱分离，真空干燥即得。

3.权利要求1所述荧光探针在检测Cu⁺中的应用，其是通过在无氧的中性或碱性环境下使荧光探针与Cu⁺发生金属络合反应，使得荧光探针的荧光发生淬灭。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，向4-6mL浓度为8-12mM的荧光探针溶液中，加入40-60μL浓度为0.4M的NaOH溶液，然后加入到含Cu⁺的体系中，所述含Cu⁺的体系为无氧或厌氧环境。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，向5mL浓度为10mM的荧光探针溶液中，加入50μL浓度为0.4M的NaOH溶液，然后加入到含Cu⁺的体系中，所述含Cu⁺的体系为无氧或厌氧环境。

6.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的荧光探针溶液为8-12mM的乙醇溶液。

7.权利要求1所述荧光探针在制备用于检测血清蛋白中Cu⁺的检测体系中的应用。

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