CN113866140A - 一种银纳米簇及其用于巯基药物检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种银纳米簇及其用于巯基药物检测的方法，其以单链DNA为模板制备银纳米簇，具体方法如下：将单链DNA放入离心机中以4000rpm的速度离心30秒，加入59μLpH为7.4的PBS缓冲溶液，震荡混匀，得到100mM浓度的单链DNA；取配备完成的单链DNA溶液6μL于干净的离心管中，加入294μL的PBS溶液稀释，混合均匀；再取75μL的稀释液于另一干净离心管中，同时加入Ag+溶液9μL，暗反应15min后加入4.5μL的7.6*10‑6g/mL的NaBH4溶液；最后加入1.5μL PBS缓冲液反应60min得银纳米簇DNA‑Ag，用于巯基药物检测。本发明可高效、高灵敏、高选择性检测巯基药物浓度。
Description
技术领域
本发明涉及荧光检测技术领域，特别指一种银纳米簇及其用于巯基药物检测的方法。
背景技术
常用的巯基药物包括谷胱甘肽、D-青霉胺，其中：
谷胱甘肽(GSH)是一种较为重要的化合物，其主要的生理作用是清除人体内的自由基，是一种不可缺少的抗氧化剂，可以保护身体内许多不同种类的蛋白质和酶分子中的巯基，保障了人体的基础生化功能。人体红细胞上的GSH主要用于保护其膜上蛋白质的巯基，从而防止人体出现溶血现象。同时，GSH在人体肝脏部位发挥着抑制乙醇侵害的作用，有效防止脂肪肝的出现。GSH还能促进进入人体内不慎进入的有毒化合物、重金属离子或致癌物质等排出体外，起到中和解毒的作用。尽管已经有大量的分析方法用于GSH的检测，也有了较为常用且标准的检测方法，但是基于检测控制人体内GSH含量的重要程度，亟需开发出更为简便、快速的GSH检测分析方法，以确保满足谷胱甘肽的检测效果。
D-青霉胺是一种螯合铜的药物，具有免疫调节性质，常用于治疗类风湿性关节炎、威尔逊氏病和肾结石(胱尿症)，但D-青霉胺治疗的相关不良事件频繁且往往严重。因此，迫切需要开发出更为简便、快速的D-青霉胺检测分析方法，对D-青霉胺的安全性剖面进行全面的评估。
目前已知的检测巯基药物的方法有比色法、高效毛细管电泳法以及高效液相色谱法等。这些方法虽然都有着各自的优势，但都需要相对复杂的操作和过高的成本，并且达不到较为明显的专一性。
比色法是以生成有色化合物的显色反应为基础的，一般包括两个步骤：首先是选择适当的显色试剂与待测组分反应，形成有色化合物，然后再比较或测量有色化合物的颜色深度，在此过程中，溶液的酸度、显色剂的用量、温度、溶剂等对显色反应都有影响，测量的灵敏度和准确度较差。
高效毛细管电泳法是以高压电场为驱动力,毛细管为分离通道,根据样品组分淌度和分配的差异来实现分离的一种方法。该方法操作简便,可靠性高,但灵敏度不高,要求巯基药物的含量最小为50μmol·L-1,并且处理样品比较繁琐,不适于大样品的测定。
高效液相色谱法是用高压泵将不同极性的溶剂泵入色谱柱中，注入待测样品，通过样品各组分不同的溶解度，在溶剂以及色谱柱固定相之间发生吸附和解吸过程而分离，然后进入检测器检测。高效液相色谱法线性范围宽，但该法步骤复杂、耗时、灵敏度不高,且样品巯基药物的含量要高于50μmol·L-1。
发明内容
本发明的目的是针对背景技术中存在的缺点和问题加以改进和创新，提供一种银纳米簇，可高效、高灵敏、高选择性检测巯基药物。
本发明的另一目的是提供一种利用上述银纳米簇对巯基药物检测的方法，可快速检测出巯基药物浓度。
本发明银纳米簇以单链DNA为模板制备而成，具体方法如下：
将单链DNA放入离心机中以4000rpm的速度离心30秒，加入59μL pH为7.4的PBS缓冲溶液，震荡混匀，得到100mM浓度的单链DNA；取配备完成的单链DNA溶液6μL于干净的离心管中，加入294μL的PBS溶液稀释，混合均匀；再取75μL的稀释液于另一干净离心管中，同时加入Ag+溶液9μL，暗反应15min后加入4.5μL的7.6*10-6g/mL的NaBH4溶液；最后加入1.5μLPBS缓冲液反应60min得银纳米簇DNA-Ag，用酶标仪检测其荧光强度。
优选的，所述的单链DNA碱基序列为AATTCC CCC CCC CCC CAATT。
优选的，酶标仪的具体工作条件是关闭育温器，激发波长480nm，发射光谱波长扫描范围520～680nm，增益为140，步幅为1，进行荧光检测；在pH为7.4的条件下，制备时间为1.5h时，DNA-Ag纳米簇荧光值达到最大。
本发明用银纳米簇进行巯基药物检测的方法，其巯基药物为谷胱甘肽与D-青霉胺，具体方法如下：
1、谷胱甘肽溶液的制备：称取0.0307g的谷胱甘肽粉末溶于100mL的超纯水中，得到1mM的谷胱甘肽溶液。
2、谷胱甘肽的检测：取1.5mL配得的谷胱甘肽溶液至离心管中，以1μM为梯度分别稀释11管谷胱甘肽溶液，浓度从小到大为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μM的谷胱甘肽溶液，各取10μL加入到银纳米簇体系中，确保体系量一定，反应10分钟后用酶标仪检测，观察其曲线峰值并记录数据。
3、D-青霉胺溶液的制备：称取0.0149g的D-青霉胺粉末溶于100mL的超纯水中，得到1mM的D-青霉胺溶液。
4、D-青霉胺的检测：取1mL配得的D-青霉胺溶液至离心管中，以10μM为梯度分别稀释6管D-青霉胺溶液，浓度从小到大为0，10，20，30，40，50μM的D-青霉胺溶液，各取10μL加入到银纳米簇体系中，确保体系量一定，反应10分钟后用酶标仪检测，观察其曲线峰值并记录数据。
5、选择性测试：为了检测其他氨基酸对谷胱甘肽与D-青霉胺的检测是否有干扰，使用丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸和丙氨酸做检测，它们的溶液浓度均为50μM。
优选的，所述方法在银纳米簇制备1小时20分钟时加入谷胱甘肽或D-青霉胺，固定10分钟后检测；酶标仪的具体工作条件是关闭育温器，激发波长480nm，发射光谱波长扫描范围520～680nm，增益为140，步幅为1，进行荧光检测，可得荧光在560nm处有最高峰。
本发明的优点及有益效果：
本发明以探索一种高效、专一性强的荧光检测巯基药物的方法为目标，用DNA作为模板合成能特异性识别并结合巯基的银纳米簇，由于巯基药物可以与DNA-Ag纳米簇形成S-Ag配位键，使得原本有荧光现象的纳米簇荧光淬灭。在无巯基药物的条件下，可以检测出荧光，在巯基药物存在的条件下荧光淬灭，且不同浓度下的谷胱甘肽和D-青霉胺淬灭效果不同，以此进行巯基药物浓度的检测，为巯基类药物检测提供新的思路与手段。
附图说明
图1为本发明银纳米簇合成原理图。
图2为单链DNA荧光强度随时间的变化趋势图。
图3为本发明银纳米簇在固定时间下与不同浓度的谷胱甘肽反应后的荧光光谱的变化结果。
图4为本发明银纳米簇在与不同浓度谷胱甘肽相互作用的Stern-Volmer曲线。
图5为本发明银纳米簇在固定时间下与不同浓度的D-青霉胺反应后的荧光光谱的变化结果。
图6为本发明银纳米簇在与不同浓度D-青霉胺相互作用的Stern-Volmer曲线。
图7为相同浓度不同氨基酸和巯基药物对银纳米簇荧光的淬灭柱状图。
具体实施方式
本发明银纳米簇DNA-Ag采用的单链DNA(后简称ssDNA)碱基序列为AATTCC CCCCCC CCC CAATT。
本发明检测两种常见巯基药物：谷胱甘肽(GSH)与D-青霉胺。
谷胱甘肽结构图：
D-青霉胺结构图：
本发明以DNA为模板银纳米簇的制备及其巯基药物检测的方法，具体按照以下步骤操作：
步骤1.DNA-Ag纳米簇荧光反应器的制备：将ssDNA放入离心机中以4000rpm的速度离心30秒，加入59μLpH为7.4的PBS缓冲溶液，震荡混匀，得到100mM浓度的ssDNA，取配备完成的ssDNA溶液6μL于干净的离心管中，向里加入294μL的PBS溶液稀释，混合均匀，再取75μL的稀释液于另一干净离心管中，同时加入Ag+溶液9μL，暗反应15min，再加入4.5μL的7.6*10-6g/mL的NaBH4溶液(即配即用，在冰面操作)，最后加入1.5μLPBS缓冲液反应60min。该步骤中，反应后酶标仪检测的具体工作条件是关闭育温器，激发波长480nm，发射光谱波长扫描范围520～680nm，增益为140，步幅为1，进行荧光检测；在pH为7.4的条件下，制备时间为1.5h时，DNA-Ag纳米簇荧光值达到最大。
步骤2.谷胱甘肽溶液的制备：称取0.0307g的谷胱甘肽粉末溶于100mL的超纯水中，得到1mM/L的谷胱甘肽溶液。
步骤3.谷胱甘肽的检测：取1.5mL配得的谷胱甘肽溶液至离心管中，以1μM为梯度分别稀释11管谷胱甘肽溶液，浓度从小到大为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μM的谷胱甘肽溶液，各取10μL加入到上述体系中，确保体系量一定，反应10分钟后用酶标仪检测，观察其曲线峰值并记录数据。
步骤4.D-青霉胺溶液的制备：称取0.0149g的D-青霉胺粉末溶于100mL的超纯水中，得到1mM的D-青霉胺溶液。
步骤5.D-青霉胺的检测：取1mL配得的D-青霉胺溶液至离心管中，以10μM为梯度分别稀释6管D-青霉胺溶液，浓度从小到大为0，10，20，30，40，50μM的D-青霉胺溶液，各取10μL加入到上述体系中，确保体系量一定，反应10分钟后用酶标仪检测，观察其曲线峰值并记录数据。
步骤6.选择性测试：为了检测其他氨基酸对谷胱甘肽与D-青霉胺的检测是否有干扰，使用丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸和丙氨酸做检测，它们的浓度均为50μM。该步骤中，丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸和丙氨酸检测方法与巯基药物检测方法相同；与四种氨基酸(丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸和丙氨酸)相比，巯基药物出现明显的荧光淬灭，该策略对巯基药物的检测具有显著的选择性和排他性，可以用于巯基药物的准确鉴别和定量。
上述步骤3与步骤5中：在1小时20分钟时加入GSH以及D-青霉胺，固定十分钟后(1.5h时)检测；酶标仪的具体工作条件是关闭育温器，激发波长480nm，发射光谱波长扫描范围520～680nm，增益为140，步幅为1，进行荧光检测，可得荧光均在560nm处有最高峰。
为了便于理解本发明，现给出以下实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文中所使用的所有的技术和科学术语与本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1：
以DNA为模板的新型银纳米簇制备，其方法包括以下步骤：
DNA-Ag纳米簇荧光反应器的制备：将ssDNA放入离心机中以4000rpm的速度离心30秒，加入59μLpH为7.4的PBS缓冲溶液，震荡混匀，得到100mM浓度的ssDNA，取配备完成的ssDNA溶液6μL于干净的离心管中，向里加入294μL的PBS溶液稀释，混合均匀，再取75μL的稀释液于另一干净离心管中，同时加入Ag+溶液9μL，暗反应15min，再加入4.5μL的7.6*10-6g/mL的NaBH4溶液(即配即用，在冰面操作)，最后加入1.5μLPBS缓冲液反应60min。
酶标仪的具体工作条件是关闭育温器，激发波长480nm，发射光谱波长扫描范围520～680nm，增益为140，步幅为1，进行荧光检测。
ssDNA的确定：将C50-DNA、C40-DNA、C30-DNA、ssDNA放入离心机中以4000rpm的速度离心30秒，依次加入28μL、35μL、48μL、59μLpH为7.4的PBS缓冲溶液，震荡混匀，得到100mM浓度的C50-DNA、C40-DNA、C30-DNA、ssDNA，取配备完成的C50-DNA、C40-DNA、C30-DNA、ssDNA溶液各6μL于4管干净的离心管中，每管都加入294μL的PBS溶液稀释，混合均匀，再各取75μL的稀释液于另4管干净离心管中，同时再依次加入Ag+溶液9μL，暗反应15min，再在这4管离心管中加入4.5μL的7.6*10-6g/mL的NaBH4溶液(即配即用，在冰面操作)，最后加入1.5μLPBS缓冲液反应60min。经检测荧光最高峰值均处于560nm左右，但ssDNA的荧光强度远高于其他三种DNA，故实验中取用ssDNA进行新型银纳米簇的制备。
荧光银纳米簇的激发波长及发射波长确定：根据文献及实际实验情况，将合成的荧光银纳米簇溶解于水溶液中，在300nm到700nm进行扫描，荧光银纳米簇的最大激发波长在480nm，最大发射波长在560nm处。
PBS缓冲溶液(0.01mol/L，pH＝7.4)的配制：
母液配制：
0.2mol/LK2HPO4溶液：称取78g K2HPO4·12H2O溶于1000mL水中；
0.2mol/LKH2PO4溶液：称取27.2g KH2PO4·2H2O溶于1000mL水中；
0.01mol/L PBS母液(pH＝7.4)：取19mL的0.2mol/L KH2PO4溶液，81mL的0.2mol/LK2HPO4溶液混合，得到0.2mol/L的PBS母液，然后取50mL母液加入1000mL容量瓶中，加水稀释至1000mL即可。
0.1mMAg+(AgNO3溶液)的配制：取16.987g的硝酸银粉末溶于100mL的水中，得到1mol/L的AgNO3溶液，后取1μL的AgNO3溶液加入一干净的离心管中，再加入99μL的超纯水，得到0.01mol/L的AgNO3溶液。取1μL 0.01mol/L的AgNO3溶液加入一干净的离心管中，再加入99μL的超纯水，最终得到0.1mM的AgNO3溶液。
NaBH4溶液的配制：称取0.038g的硼氢化钠粉末溶于50mL的水中搅拌溶解，后用移液枪取1μL的溶液至一干净的离心管中并加入99μL的超纯水，得到0.2mM的NaBH4溶液。
由于NaBH4具有强氧化性，在配制NaBH4溶液时需迅速配制，尽量在暗反应仅剩3分钟时配好并加入，天气较热时可以使用提前存放在冰箱中冰冻的超纯水，降低反应环境的温度，减缓NaBH4氧化时间，并且每次配制NaBH4溶液时即配即用。
取pH为7.4的PBS缓冲溶液(0.01mol/L，pH＝7.4)各20mL于6个干净的烧杯中，并标记1号、2号、3号、4号、5号、6号，后使用pH计通过加入1mol/L的盐酸溶液或1mol/L的氢氧化钠溶液少量进行pH调试，最终配得1号PBS溶液的pH为5.7，2号PBS溶液pH为6.1，3号PBS溶液pH为6.5，4号PBS溶液pH为7.0，5号PBS溶液pH为7.4，6号PBS溶液pH为8.0。实验后可知，在pH为7.4，制备时间为1.5h时，DNA-Ag纳米簇荧光值达到最大。
为排除其他离子的干扰，设置5组对照组，取5管干净的离心管分别加入90μL的水、90μL的PBS溶液、90μL的ssDNA、90μL的AgNO3溶液、90μL的NaBH4溶液，然后在室温下进行荧光光谱检测，结果发现以上对照组均无荧光产生。
实施例2：
荧光检测巯基药物的方法，具体方法包括以下步骤：
步骤1.谷胱甘肽溶液的制备：称取0.0307g的谷胱甘肽粉末溶于100mL的超纯水中，得到1mM的谷胱甘肽溶液。
步骤2.谷胱甘肽的检测：取1.5mL配得的谷胱甘肽溶液至离心管中，以1μM为梯度分别稀释11管谷胱甘肽溶液，浓度从小到大为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μM的谷胱甘肽溶液，各取10μL加入到上述DNA-Ag纳米簇体系中，确保体系量一定，反应10分钟后用酶标仪检测，观察其曲线峰值并记录数据。
步骤3.D-青霉胺溶液的制备：称取0.0149g的D-青霉胺粉末溶于100mL的超纯水中，得到1mM的D-青霉胺溶液。
步骤4.D-青霉胺的检测：取1mL配得的D-青霉胺溶液至离心管中，以10μM为梯度分别稀释6管D-青霉胺溶液，浓度从小到大为0，10，20，30，40，50μM的D-青霉胺溶液，各取10μL加入到上述体系中，确保体系量一定，反应10分钟后用酶标仪检测，观察其曲线峰值并记录数据。
步骤5.选择性测试：为了检测其他氨基酸对谷胱甘肽与D-青霉胺的检测是否有干扰，使用丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸和丙氨酸做检测，它们的浓度均为50μM。
在1小时20分钟时加入GSH以及D-青霉胺，固定十分钟后(1.5h时)检测。
酶标仪的具体工作条件是关闭育温器，激发波长480nm，发射光谱波长扫描范围520～680nm，增益为140，步幅为1，进行荧光检测，可得荧光均在560nm处有最高峰。
GSH的淬灭作用：在加入GSH后，新型银纳米簇的荧光发射峰发生了很大的改变，如图3所示。当加入GSH浓度10μM时，溶液荧光强度明显降低，其淬灭程度符合Stern-Volmer方程log(F0-F)＝3.1363+1.0764C(μM)(R2＝0.9931)，谷胱甘肽的线性测定范围为0-1μM。
D-青霉胺的淬灭作用：在加入D-青霉胺后，新型银纳米簇的荧光发射峰发生了很大的改变，如图5所示。当加入D-青霉胺浓度50μM时，溶液荧光强度明显降低，其淬灭程度符合Stern-Volmer方程log(F0-F)＝3.0645+1.6306C(μM)(R2＝0.9931)，D-青霉胺的线性测定范围为0-5μM。
丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸和丙氨酸检测方法与巯基药物检测方法相同。
丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸和丙氨酸检测方法与巯基药物检测方法相同；与四种氨基酸(丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸和丙氨酸)相比，巯基药物出现明显的荧光淬灭，该策略对巯基药物的检测具有显著的选择性和排他性，可以用于巯基药物的准确鉴别和定量。
1mM谷胱甘肽溶液的稀释：取10μL浓度为1mM的谷胱甘肽溶液于一干净的离心管中，加入990μL的水，可得到10μM的谷胱甘肽溶液，后将10μM的谷胱甘肽溶液稀释，分别取2μL，4μL，6μL，8μL，12μL，14μL，16μL，18μL的溶液于8个干净的离心管中，依次加入18μL，16μL，14μL，12μL，10μL，8μL，6μL，4μL，2μL的超纯水混合均匀，得到浓度分别为1，2，3，4，5，6，7，8，9μM的谷胱甘肽溶液各20μL。
1mM D-青霉胺溶液的稀释：分别取1μL，2μL，3μL，4μL，5μL浓度为1mM的D-青霉胺溶液于5个干净的离心管中，依次加入99μL，98μL，97μL，96μL，95μL的超纯水混合均匀，得到浓度分别为10，20，30，40，50μM的D-青霉胺溶液各100μL。
各种氨基酸的配制：
各种氨基酸均用超纯水配制成为浓度为50μM的标准溶液，所述氨基酸为以下四种：谷胱甘肽(GSH)、丝氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、缬氨酸(Val)和丙氨酸(Glu)。
在90μL的DNA-Ag纳米簇体系中分别加入10μL的PBS溶液(0.01mol/L，pH＝7.4)、谷胱甘肽、D-青霉胺、丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸和丙氨酸，在室温下进行荧光光谱检测(激发波长：480nm，发射波长：560nm)，荧光检测结果如图7所示，可以看出，加入巯基药物的纳米簇荧光均可被淬灭，但淬灭程度存在差异，第2组谷胱甘肽和第3组D-青霉胺的荧光强度明显低于其他组，其淬灭曲线符合Stern-Volmer方程，说明本发明所得到的新型银纳米簇对巯基药物具有良好的选择性，可应用于巯基药物浓度的定量检测。
本发明以DNA分子为模板合成银纳米簇，利用巯基通过S-Ag配位键形成配位复合物，进而利用DNA-Ag纳米簇荧光淬灭的原理来检测巯基药物，达到高效检测其含量的目的，从而有效运用于巯基药物的检测，为巯基类药物检测提供新的方法。
本发明以DNA为模板合成了稳定性好的荧光银纳米簇，并研究了其与含巯基药物相互作用的荧光性质，本发明检测后发现，含巯基药物通过巯基与银纳米簇发生特异性作用，高选择性淬灭银纳米簇的荧光。
本发明所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行的描述，并非对本发明构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域中工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。
Claims (5)
1.一种银纳米簇，其特征在于它以单链DNA为模板制备而成，具体制备方法如下：
将单链DNA放入离心机中以4000rpm的速度离心30秒，加入59μLpH为7.4的PBS缓冲溶液，震荡混匀，得到100mM浓度的单链DNA；取配备完成的单链DNA溶液6μL于干净的离心管中，加入294μL的PBS溶液稀释，混合均匀；再取75μL的稀释液于另一干净离心管中，同时加入Ag+溶液9μL，暗反应15min后加入4.5μL的7.6*10-6g/mL的NaBH4溶液；最后加入1.5μLPBS缓冲液反应60min得银纳米簇DNA-Ag，用酶标仪检测其荧光强度。
2.根据权利要求1所述的银纳米簇，其特征在于所述的单链DNA碱基序列为AAT TCCCCC CCC CCC CAATT。
3.根据权利要求1所述的银纳米簇，其特征在于酶标仪的具体工作条件是关闭育温器，激发波长480nm，发射光谱波长扫描范围520～680nm，增益为140，步幅为1，进行荧光检测；在pH为7.4的条件下，制备时间为1.5h时，DNA-Ag纳米簇荧光值达到最大。
4.一种用权利要求1-3任一所述银纳米簇进行巯基药物检测的方法，其特征在于巯基药物为谷胱甘肽与D-青霉胺，具体方法如下：
1)谷胱甘肽溶液的制备：称取0.0307g的谷胱甘肽粉末溶于100mL的超纯水中，得到1mM的谷胱甘肽溶液；
2)谷胱甘肽的检测：取1.5mL配得的谷胱甘肽溶液至离心管中，以1μM为梯度分别稀释11管谷胱甘肽溶液，浓度从小到大为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μM的谷胱甘肽溶液，各取10μL加入到银纳米簇体系中，确保体系量一定，反应10分钟后用酶标仪检测，观察其曲线峰值并记录数据；
3)D-青霉胺溶液的制备：称取0.0149g的D-青霉胺粉末溶于100mL的超纯水中，得到1mM的D-青霉胺溶液；
4)D-青霉胺的检测：取1mL配得的D-青霉胺溶液至离心管中，以10μM为梯度分别稀释6管D-青霉胺溶液，浓度从小到大为0，10，20，30，40，50μM的D-青霉胺溶液，各取10μL加入到银纳米簇体系中，确保体系量一定，反应10分钟后用酶标仪检测，观察其曲线峰值并记录数据；
5)选择性测试：为了检测其他氨基酸对谷胱甘肽与D-青霉胺的检测是否有干扰，使用丝氨酸、脯氨酸、缬氨酸和丙氨酸做检测，它们的溶液浓度均为50μM。
5.根据权利要求4所述的巯基药物检测的方法，其特征在于银纳米簇制备1小时20分钟时加入谷胱甘肽或D-青霉胺，固定10分钟后检测；酶标仪的具体工作条件是关闭育温器，激发波长480nm，发射光谱波长扫描范围520～680nm，增益为140，步幅为1，进行荧光检测，可得荧光在560nm处有最高峰。
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