CN104359846A - 一种检测α-L-岩藻糖苷酶含量的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒,由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成;其中试剂R1的组分包括:生物缓冲液1、金属离子络合物、α-L-岩藻糖苷酶反应底物、表面活性剂1、防腐剂1;试剂R2的组分包括:生物缓冲液2、2-氯-对硝基苯酚-a-L-岩藻糖苷酶、激活剂、表面活性剂2、防腐剂2。本发明中的试剂盒采用双试剂模式,检测灵敏度高、检测限低、线性测试范围宽、精确度高、重复性好、稳定性好、抗干扰性强。可以用于半自动、全自动生化分析仪,所需检测仪器(生化分析仪)在各大医院和检验中心普遍使用。适用于临床上的推广应用,特别对于急诊能实现快速诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域,特别是涉及一种α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
AFU是一种酸性水解酶,广泛分布于哺乳动物体液和组织细胞的溶酶体中,以肝肾等组织活性较高。其主要生理功能是参与含岩藻糖基的各种糖脂、糖蛋白、黏多糖等大分子物质的分解代谢。它合成于细胞中,正常情况下其体内含量始终保持在一个低水平范围内。AFU的化学本质是一种糖蛋白,它在体内分布相对分子质量也不尽相同,其血中的相对分子质量为2.7×105~3.9×105Dα,远大于白细胞和肝脏细胞中的。AFU在人体中呈多型性,当pH值为3.8~3.9时酶活性基本消失,而在pH值为6.2~7.0时酶活性上升。早期测定该酶主要用于诊断遗传性AFU缺乏症,并以此与其他遗传性黏多糖储积病进行鉴别。自Deugnier提出AFU对原发性肝癌有一定提示作用后,这方面的研究也相应增多。
AFU常表达于PHC患者发病早期,其生物活性明显高于继发性肝癌及肝硬化,它与AFP浓度无明显相关性。研究发现血清的AFU在肝癌患者中的活性明显高于在慢性肝炎、肝硬化、其他肿瘤患者及健康人群中的活性,较AFU具有更高的敏感性,若两者联合检测可将肝癌的敏感性提高到82.16%。有研究表明在诊断肝癌时AFU活性与肿瘤大小无关,这就对于AFP阴性和小肝癌患者的诊断更具有意义。而且,有研究认为,AFU水平与肝癌患者TNM分期呈相关性,AFU水平越高,TNM分期越晚,遂认为AFU是一个有效的用于判断原发性肝癌病情的血清学指标。
PHC患者在有效治疗后,AFU水平发生显著下降,这为AFU阴性的原发性肝癌患者诊疗提供重要的参考标准。若术后或药物治疗后,患者血清AFU再度升高,说明病情恶化。有研究认为PHC患者癌细胞合成和释放AFU增加,或肝癌时血清AFU激活物增加及AFU作用的底物浓度增加,最终导致血清AFU增高。肿瘤切除后癌细胞减少,上述机制发生改变,使酶活性下降,所以含量降低;当肿瘤复发时血清AFU可再次升高。因此AFU为PHC患者治疗后的动态监测、疗效和预后判断以及转归提供非常重要的信息。
AFU除在PHC相应升高外,在一些非肝癌性疾病如肝硬化、急慢性肝炎、病毒性肝炎、肾病、糖尿病、胰腺炎、甲状腺功能减低及白血病患者中,其血清水平也会升高。所以AFU在诊断上述疾病时具有很高的诊断价值。同时,有研究报道AFU在恶性胸腔积液中含量高于良性,所以AFU是判断良、恶性胸腔积液的可靠依据;其机制为人体感染乙型肝炎病毒(HBV)后,HBV活跃复制启动肝脏组织炎症反应因素,使肝细胞出现变性、坏死,进而肝细胞再生和纤维组织增生,从而导致AFU活性升高。
目前,临床上对AFU的测定方法很多,有荧光猝灭法、速率法、终点法等。目前在临床上应用较为广泛的是酶法。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种检测时间短,稳定性好、重复性好、精确度高、检测灵敏度高、线性测试范围宽、抗干扰性强的α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒,用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明的第一方面提供一种α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒,由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成;其中试剂R1的组分包括:生物缓冲液1、金属离子络合物、α-L-岩藻糖苷酶反应底物、表面活性剂1、防腐剂1;试剂R2的组分包括:生物缓冲液2、2-氯-对硝基苯酚-a-L-岩藻糖苷酶、激活剂、表面活性剂2、防腐剂2。
优选的,所述试剂R1中,所述生物缓冲液1选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液或柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合;更优选Tris缓冲液,其原因是Tris缓冲液碱性较强,可调节PH范围广,对生物化学过程干扰很小,不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。所述试剂R2中,所述生物缓冲液2选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液或柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合。
优选的,所述R1试剂中,生物缓冲液1的浓度为20~200mmol/L,PH7.0-7.5;R2试剂中,生物缓冲液2的浓度为20~200mmol/L,PH7.0-7.5。
优选的,为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果,本发明对所述试剂R1中的生物缓冲液1进行了改进,所述试剂R1中的生物缓冲液1包括下列组分:水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸,且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度为3.5-7.5g/L,生物缓冲液1的pH值为7.2-7.6。
优选的,各组分在生物缓冲液1中的浓度为:
所述生物缓冲液1的溶剂为水。
所述生物缓冲液1可以采用本领域内公知的各种pH调节剂来进行pH调节。
优选的,所述R1试剂中,金属离子络合物选自乙二胺四乙酸二钠、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸中的一种或多种的组合,浓度为1~5mmol/L。更优选乙二胺四乙酸二钠,其原因是乙二胺四乙酸二钠具有广泛的配位性能,几乎能与所有的金属离子形成稳定的螯合物。
优选的,所述R1试剂中,α-L-岩藻糖苷酶反应底物为2-氯-对硝基苯酚-a-L-岩藻糖苷,浓度为2~20mmol/L。
优选的,所述R1试剂中,所述表面活性剂1为椰子油脂肪酸二乙醇酰胺,浓度为5~55mmol/L。椰子油脂肪酸二乙醇酰胺属于非离子表面活性剂,易溶于水,具有发泡、稳泡、渗透去污、抗硬水等功能,并且在一定浓度下能完全溶解于不同种类的表面活性剂中,增稠效果明显。所述R2试剂中,所述表面活性剂2为椰子油脂肪酸二乙醇酰胺,浓度为5~55mmol/L。
优选的,所述R1试剂中,所述防腐剂1选自叠氮钠、硫柳汞、ProClin300中的一种,更优选叠氮钠,其原因是叠氮钠具有优良的防腐杀菌性能。所述R2试剂中,所述防腐剂2选自叠氮钠、硫柳汞、ProClin300中的一种。
优选的,所述R1试剂中,防腐剂1的浓度为1~5mmol/L;R2试剂中,防腐剂2的浓度为1~5mmol/L。
优选的,所述R2试剂中,所述2-氯-对硝基苯酚-a-L-岩藻糖苷酶的浓度为0.5~2mmol/L。
优选的,所述R2试剂中,所述激活剂为磷脂酰胆碱,浓度为2~20mmol/L。
优选的,所述检测试剂盒的具体组成为:
试剂R1:
试剂R2:
本发明的第二方面提供前述试剂盒的制备方法和使用方法,具体包括如下步骤:
(1)按照比例分别配置试剂R1、试剂R2,按照需要的α-L-岩藻糖苷酶参考校准品浓度将相应的α-L-岩藻糖苷酶标准品分别加入校准品中,制备得到含有不同浓度α-L-岩藻糖苷酶标准品的一组校准品,并绘制标准曲线;
(2)将待测样本与试剂R1和R2按一定比例混合,使其充分反应;
(3)用全自动生化分析仪测定单位时间内吸光度变化率△A/min;
(4)根据吸光度变化率计算出样本中α-L-岩藻糖苷酶的活性。
本发明第三方面公开了前述试剂盒在检测α-L-岩藻糖苷酶的含量中的应用。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
1.本发明中的试剂盒采用双试剂模式,检测灵敏度高、检测限低、线性测试范围宽、精确度高、重复性好、稳定性好、抗干扰性强。可以用于半自动、全自动生化分析仪,所需检测仪器(生化分析仪)在各大医院和检验中心普遍使用。适用于临床上的推广应用,特别对于急诊能实现快速诊断。
2.本发明中所使用的激活剂为磷脂酰胆碱,能有效提高α-L-岩藻糖苷酶的活性,增强反应灵敏度,能有效减少反应时间,加快临床诊断速度。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明,具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989and Third edition,2001;Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987and periodic updates;the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODSIN ENZYMOLOGY,Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),AcademicPress,San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,ChromatinProtocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999等。
实施例1:
本发明的试剂盒举例是双试剂,其中:
试剂R1:
试剂R2:
实施例2:试剂盒使用方法。
试剂R1:
试剂R2:
2.全自动生化仪参数设置:
(a)检测波长:主波长为340nm,副波长为405nm;
(b)检测温度:37℃;
(c)反应时间:10min,其中,孵育时间5min,加入试剂R2后2min后测定3min内平均吸光度变化率△A/min;
(d)反应方向:负方向。
3.检测步骤
(a)取240ul试剂R1与6ul血清样本(避免溶血)混匀;
(b)将混匀后的溶液在37℃孵育时间5min;
(c)再加入60ul试剂R2,反应2min后检测3min内平均吸光度变化率△A/min。
4.通过平均吸光度变化率△A/min计算出α-L-岩藻糖苷酶的活性。
下述测试为对实施例1试剂盒的性能测试:
将实施例1制备的α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒进行性能测试,主要测试其分析灵敏度、最低检出限、线性范围、准确度、重复性、稳定性及抗干扰性等。
1)分析灵敏度:取浓度在2~1200U/L之间的定值α-L-岩藻糖苷酶样本测定其吸光度变化值,重复测定2次取平均值。结果显示其分析灵敏度为0.0506mA·L/U。
2)最低检测限:采用5%BSA生理盐水溶液作为空白样本,空白样本应不含被测物。在生化分析仪上连续重复检测20次,记录检测结果。结果显示其最低检测限为0.2896U/L。
3)准确性:选择合适浓度的常规检测样本,向常规样本中加入不同量的定值标准品制作成回收样本,定值样本用去离子水作为溶剂;在常规样本中加入同样量的去离子水制作成基础样本,加入的定值标准品的量不超过总体积的1/10,每个重复3次检测取其均值为回收浓度。结果显示平均回收率为100.13%,准确度较高。
4)重复性:每天做2批试验,每批取同一浓度的血清样本做2次测定,记录试验结果,连续测定20天,结果显示CV批内为0.89%,CV批间为1.06%,CV天间为1.39%,总精密度为2.08%,重复性较好。
5)稳定性:取α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒进行常规贮存稳定性试验,2-8℃放置分别按时间2,4,6,8,9,10,11,12,13,14个月进行检测;开盖稳定性试验分别按2-8℃放置0天、7天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天、28天、30天、32天进行测定。结果显示α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒贮存于2-8℃、避光环境中,有效期为18个月。开盖贮存于2-8℃、避光环境中,有效期为30天。
6)抗干扰性:将不同浓度的干扰物加入到血清标本中,对照组加入蒸馏水,以加入干扰物质的血清三次检测平均值,作为实测值,以加入蒸馏水的血清的对照组三次检测平均值为基准值。实测值减去基准值然后除以基准值得偏差。结果显示样本中胆红素≤300μmol/L、血红蛋白≤0.5g/L、乳糜≤0.30%时对α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒检测结果的干扰小于10%。
实施例3
对比试剂盒的制备及使用:
试剂R1中的生物缓冲液采用Tris缓冲液50.0mmol/L,PH7.0-7.5,其他试剂及实验方法均同实施例1和2。
试剂R2:
将实施例3制备的α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒进行性能测试,方法同实施例2。
1)分析灵敏度:取浓度在2~1200U/L之间的定值α-L-岩藻糖苷酶样本测定其吸光度变化值,重复测定2次取平均值。结果显示其分析灵敏度为0.5581mA·L/U。
2)最低检测限:采用5%BSA生理盐水溶液作为空白样本,空白样本应不含被测物。在生化分析仪上连续重复检测20次,记录检测结果。结果显示其最低检测限为2.972U/L。
3)准确性:选择合适浓度的常规检测样本,向常规样本中加入不同量的定值标准品制作成回收样本,定值样本用去离子水作为溶剂;在常规样本中加入同样量的去离子水制作成基础样本,加入的定值标准品的量不超过总体积的1/10,每个重复3次检测取其均值为回收浓度。结果显示平均回收率为98.15%,准确度较高。
4)重复性:每天做2批试验,每批取同一浓度的血清样本做2次测定,记录试验结果,连续测定20天,结果显示CV批内为0.99%,CV批间为1.39%,CV天间为1.99%,总精密度为4.29%,重复性较好。
5)稳定性:取α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒进行常规贮存稳定性试验,2-8℃放置分别按时间2,4,6,8,9,10,11,12,13,14个月进行检测;开盖稳定性试验分别按2-8℃放置0天、7天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天、28天、30天、32天进行测定。结果显示α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒贮存于2-8℃、避光环境中,有效期为10个月。开盖贮存于2-8℃、避光环境中,有效期为20天。
6)抗干扰性:将不同浓度的干扰物加入到血清标本中,对照组加入蒸馏水,以加入干扰物质的血清三次检测平均值,作为实测值,以加入蒸馏水的血清的对照组三次检测平均值为基准值。实测值减去基准值然后除以基准值得偏差。结果显示样本中胆红素≤300μmol/L、血红蛋白≤0.5g/L、乳糜≤0.30%时对α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒检测结果的干扰小于20%。
综上所述,本发明所提供的检测试剂盒具有良好的抗干扰性和特异性,且具有很好的灵敏性,阳性显色强,阴性本底更低,有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒,由彼此独立的试剂R1和试剂R2组成;其中试剂R1的组分包括:生物缓冲液1、金属离子络合物、α-L-岩藻糖苷酶反应底物、表面活性剂1、防腐剂1;试剂R2的组分包括:生物缓冲液2、2-氯-对硝基苯酚-a-L-岩藻糖苷酶、激活剂、表面活性剂2、防腐剂2。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂R1中,所述生物缓冲液1选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液或柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合;所述试剂R2中,所述生物缓冲液2选自磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液或柠檬酸-磷酸盐缓冲液中的一种或多种的组合。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述R1试剂中,生物缓冲液1的浓度为20~200mmol/L,PH7.0-7.5;R2试剂中,生物缓冲液2的浓度为20~200mmol/L,PH7.0-7.5。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述R1试剂中,金属离子络合物选自乙二胺四乙酸二钠、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸中的一种或多种的组合,浓度为1~5mmol/L。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述R1试剂中,α-L-岩藻糖苷酶反应底物为2-氯-对硝基苯酚-a-L-岩藻糖苷,浓度为2~20mmol/L。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述R1试剂中,所述表面活性剂1为椰子油脂肪酸二乙醇酰胺,浓度为5~55mmol/L。
7.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述防腐剂1选自叠氮钠、硫柳汞、ProClin300中的一种;所述R2试剂中,所述防腐剂2选自叠氮钠、硫柳汞、ProClin300中的一种。
8.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述R2试剂中,所述烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原态的浓度为0.5~2mmol/L;所述R2试剂中,所述激活剂为磷脂酰胆碱,浓度为2~20mmol/L。
9.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂R1中的生物缓冲液1包括下列组分:水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸,且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度为3.5-7.5g/L,生物缓冲液1的pH值为7.2-7.6。
10.根据权利要求1~9任一权利要求所述的试剂盒的制备方法和使用方法,其特征在于,具体包括如下步骤:
(1)按照比例分别配置试剂R1、试剂R2,按照需要的α-L-岩藻糖苷酶参考校准品浓度将相应的α-L-岩藻糖苷酶标准品分别加入校准品中,制备得到含有不同浓度α-L-岩藻糖苷酶标准品的一组校准品,并绘制标准曲线;
(2)将待测样本与试剂R1和R2按一定比例混合,使其充分反应;
(3)用全自动生化分析仪测定单位时间内吸光度变化率△A/min;
(4)根据吸光度变化率计算出样本中α-L-岩藻糖苷酶的活性。
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