CN111154833A - 一种α-L-岩藻糖苷酶测定试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种α‑L‑岩藻糖苷酶测定试剂盒,涉及生物检测技术领域。所述的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2,其的成分及相应含量为:试剂R1:磷酸氢二钠7.5‑8.5g/L;柠檬酸5.0‑6.0g/L;叠氮钠0.2‑0.8g/L;试剂R2:磷酸氢二钠7.5‑8.5g/L;柠檬酸5.0‑6.0g/L;叠氮钠0.2‑0.8g/L;2‑氯‑4硝基苯‑α‑L‑岩藻吡喃糖苷4‑8g/L。本发明实施过程中在试剂R1和试剂R2加入精氨酸、天冬酰胺和蔗糖作为稳定剂,明显提高了试剂盒的准确度、精密度和稳定性,提供了一种准确度高、精密度好、稳定性强、线性关系好的α‑L‑岩藻糖苷酶测定试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,具体涉及一种α-L-岩藻糖苷酶测定试剂盒。
背景技术
α-L-岩藻糖苷酶(α-L-Fucosidase,AFU)是一种溶酶体酸性水解酶,广泛分布于人体内的各个组织、细胞及体液中。以肝、肾等组织活性较高,基本功能是催化含岩藻糖基的低聚糖、糖蛋白及糖苷的水解代谢,其本质是一种糖蛋白,在包括免疫反应、信号转导等多种方面发挥重要作用,研究发现,α-L-岩藻糖苷酶的测定在多种疾病的诊断及治疗中都有积极的作用。
测定α-L-岩藻糖苷酶的方法有荧光法、终点比色法和连续监测法。荧光法的研究者利用AFU水解4-甲基伞型酮α-L-岩藻吡喃糖苷释放4-甲基伞型酮,用碱性缓冲液终止反应,并使产物呈现荧光,用360nm或365nm激发波长和400nm或448nm发射波长检测荧光强度,对照不同浓度4-甲基伞型酮制备的标准曲线求酶的活性,此法敏感性高,适用范围广。但该法对仪器条件要求高,不适合用于自动化检测。终点比色法以对硝基苯酚α-L-岩藻糖苷为底物,在AFU催化下生成α-L-岩藻糖苷和对硝基苯酚,对硝基苯酚在碱性溶液中呈黄色,用分光光度计在405nm波长处检测。本法反应时间长,且操作较繁琐,干扰因素多,也不适用自动化检测。于秀艳等对其进行了改进,利用对硝基酚毫摩尔消光系数为18.5的特性,根据AFU在pH5.0的条件下催化对硝基苯-岩藻糖吡喃糖苷,生成对硝基酚和岩藻糖,在405nm波长下,对硝基酚有一吸收高峰,测其吸光度变化,不必做标准曲线,便可准确测出AFU含量。因本法采用因数两点法,可去除因溶血黄疸给试验带来的干扰。速率法(连续监测法)血清中AFU催化2-氯-对硝基酚α-L-岩藻吡喃糖苷(CNP-F)水解生成2-氯-对硝基酚(CNP),在405nm或410nm波长监测CNP的生成速率,计算出AFU活性。本法测定对胆红素250mg/L、血红蛋白230mg/L、抗坏血酸6g/L无明显干扰。该法操作简便,测定时间短,灵敏度和抗干扰性有一定程度的提高,,但依然达不到理想水平,并且存在试剂盒稳定性不好,准确度不高的问题。
目前,已经报道的测定α-L-岩藻糖苷酶的试剂盒少之又少,刘建武“连续监测法测定血清α-L-岩藻糖苷酶”,《临床检验杂志》,1997年03期中记载了一种血清α-L-岩藻糖苷酶单一试剂连续监测法,所用试剂为pH6.5缓冲液,0.1mol/L柠檬酸、0.2mol/L磷酸氢二钠,1.0mmol/L对硝基酚α-L-岩藻吡喃糖苷,检测结果为20份血清的测定值经配对t检验,P>0.05,差异无统计意义;同一份混合血清用本法测定,批内CV=5.0%,批间CV=7.4%;一份32U/L的高值血清经稀释后测定,仍呈良好的线性关系r=0.999,胆红素115μmol/L,血红蛋白32g/L及三酸甘油300μmol/L对测定值无明显干扰,但是该试剂存在不稳定,准确度低的缺点。
因此开发一种准确度高、稳定性强的α-L-岩藻糖苷酶测定试剂盒,成为本领域研究的重中之重,本发明在实施过程中意外地发现控制试剂盒中加入一定质量比的氨基酸不仅可以提高试剂盒检测准确性以及试剂稳定性,还有效的提高了检测的精密性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在提高试剂盒检测准确性以及试剂稳定性的前提下,进而提高检测的精密性,因此提供了一种准确度高、精密度好、稳定性强的α-L-岩藻糖苷酶测定试剂盒。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是:
一方面,本发明公开了一种α-L-岩藻糖苷酶双试剂测定试剂盒,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2,其的成分及相应含量为:
试剂R1:
磷酸氢二钠 7.5-8.5g/L;
柠檬酸 5.0-6.0g/L;
叠氮钠 0.2-0.8g/L;
试剂R2:
优选地,所述的试剂盒,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2,其的成分及相应含量为:
试剂R1:
磷酸氢二钠 8.0-8.3g/L;
柠檬酸 5.5-5.8g/L;
叠氮钠 0.4-0.6g/L;
试剂R2:
再优选地,所述的试剂盒,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2,其的成分及相应含量为:
试剂R1:
磷酸氢二钠 8.3g/L;
柠檬酸 5.6g/L;
叠氮钠 0.5g/L;
试剂R2:
本发明在实施过程中意外地发现控制在试剂R1和R2中加入一定质量比的氨基酸和蔗糖作为稳定剂可以明显提高试剂盒检测准确性以及试剂稳定性,进而提高检测的精密性。
其中,试剂R1和试剂R2中还包括稳定剂,所述的稳定剂为质量比2-5:1-2:2的精氨酸、天冬酰胺和蔗糖。
优选地,所述的稳定剂为质量比3-4:1-2:2的精氨酸、天冬酰胺和蔗糖。
再优选地,所述的稳定剂为质量比4:2:2的精氨酸、天冬酰胺和蔗糖。
所述稳定剂的浓度为1-3g/L,优选为1.5-2.5g/L,再优选为1.8-2.2g/L。
所述稳定剂的浓度为1g/L、1.2g/L、1.4g/L、1.6g/L、1.8g/L、2.0g/L、2.2g/L、2.4g/L、2.6g/L、2.8g/L或3.0g/L。
所述的测定试剂盒,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2,其的成分及相应含量为:
试剂R1:
试剂R2:
所述的试剂R1、试剂R2与样品的体积比为6-10:1-3:1;优选为7-9:1.5-2.5:1;再优选为8:2:1。
另一方面,本发明还提供了上述α-L-岩藻糖苷酶测定试剂盒的使用方法:
本试剂盒适用于杜邦AR、日立7080/7170/7600/7180、迈瑞BS320、迪瑞CS600、雅培C8000/16000、东芝TBA40FR/2000FR/FX8、贝克曼AU5800/2700、贝克曼DXC800、西门子ADVIA2400、罗氏C501/701/702、罗氏P800等全自动生化分析仪。
该测定试剂盒的测定方法为速率法,反应方向为升反应
所述的方法为:向待测样本中加入试剂R1混合均匀,37℃孵育5min,然后再向待测样品中加入试剂R2混合均匀,37℃延迟1分钟,在405nm或410nm波长下连续监测1.5分钟样本吸光度变化,计算样本每分钟平均吸光度变化值△A样本/min;用同样的方法测定空白管每分钟平均吸光度变化值△A空白/min;再通过下式(1)计算得到血清样品的α-L-岩藻糖苷酶活性:
α-L-岩藻糖苷酶(U/L)=(106/c)×(TV/SV)×△A/min=F×△A/min (1)
式中:TV为反应物总容积(μL);
SV为血清用量(μL);
c为反应物2-氯-4硝基苯-α-L-岩藻吡喃糖苷的摩尔吸光度,在本法条件下:c405nm=3430,c410nm=3296;
F:主波长405nm=3430,主波长410nm=3296。
本方法的原理为:α-L-岩藻糖苷酶催化2-氯-4硝基苯-α-L-岩藻吡喃糖苷(CNPF)释放2-氯-4硝基酚(CNP)后者呈色的pH范围较宽,在α-L-岩藻糖苷酶最适的反应条件下,仍可呈现明显黄色,引起405nm-410nm处吸光度升高,连续监测吸光度升高速率,可计算出样品中α-L-岩藻糖苷酶活性。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
(1)本发明在试剂R1和R2中加入稳定剂,可以明显提高试剂的稳定性和准确性,并且提高了试剂的抗干扰能力;
(2)本发明公开的试剂盒在使用过程中控制试剂R1、试剂R2与样品的体积比为6-10:1-3:1,可以提高检测的精密性,提高检测的准确性。
(3)本发明提供的试剂盒中所加稳定剂为质量比3-4:1-2:2的精氨酸、天冬酰胺和蔗糖,可以明显提高试剂盒的稳定性,进而提高了精密性和抗干扰能力。
(4)本发明公开的试剂盒操作简单、制备成本低,适宜于推广使用。
附图说明
图1实施例4试剂盒的稳定性示意图;
图2实施例5试剂盒的稳定性示意图;
图3实施例6试剂盒的稳定性示意图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,下面结合具体实施例,进一步阐明本发明,但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例,并非全部。基于实施方式中的实施例,本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例,都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
测试条件与方法:
仪器:日立7080全自动生化分析仪
参数:
主波长 | 405/410nm | 样品 | 25μL |
次波长 | 600nm | 试剂1 | 200μL |
反应温度 | 37℃ | 试剂2 | 50μL |
反应方向 | 反应类型 | 速率法 |
操作步骤:
实施例1
本实施例的α-L-岩藻糖苷酶测定试剂盒组分及其浓度如下:
试剂R1:
磷酸氢二钠 7.5g/L;
柠檬酸 5.0g/L;
叠氮钠 0.2g/L;
试剂R2:
其中,试剂R1、试剂R2与样品的体积比为6:1:1
实施例2
本实施例的α-L-岩藻糖苷酶测定试剂盒组分及其浓度如下:
试剂R1:
磷酸氢二钠 8.5g/L;
柠檬酸 6.0g/L;
叠氮钠 0.8g/L;
试剂R2:
其中,试剂R1、试剂R2与样品的体积比为10:3:1
实施例3
本实施例的α-L-岩藻糖苷酶测定试剂盒组分及其浓度如下:
试剂R1:
磷酸氢二钠 8.3g/L;
柠檬酸 5.6g/L;
叠氮钠 0.5g/L;
试剂R2:
其中,试剂R1、试剂R2与样品的体积比为8:2:1
实施例4
本实施例的α-L-岩藻糖苷酶测定试剂盒组分及其浓度如下:
试剂R1:
试剂R2:
其中,试剂R1、试剂R2与样品的体积比为8:2:1
稳定剂为质量比2:1:2的精氨酸、天冬酰胺和蔗糖。
实施例5
本实施例的α-L-岩藻糖苷酶测定试剂盒组分及其浓度如下:
试剂R1:
试剂R2:
其中,试剂R1、试剂R2与样品的体积比为8:2:1
稳定剂为质量比5:2:2的精氨酸、天冬酰胺和蔗糖。
实施例6
本实施例的α-L-岩藻糖苷酶测定试剂盒组分及其浓度如下:
试剂R1:
试剂R2:
其中,试剂R1、试剂R2与样品的体积比为8:2:1
稳定剂为质量比4:2:2的精氨酸、天冬酰胺和蔗糖。
对比例1
与实施例6的区别在于:稳定剂仅为质量比2:1的精氨酸和天冬酰胺,其他步骤与操作与实施例6相同。
对比例2
与实施例6的区别在于:稳定剂仅为蔗糖,其他步骤与操作与实施例6相同。
对比例3
与实施例6的区别在于:稳定剂为质量比10:1:1的精氨酸、天冬酰胺和蔗糖,其他步骤与操作与实施例6相同。
对比例4
与实施例3的区别在于:试剂R1、试剂R2与样品的体积比为15:1:1,其他步骤与操作与实施例3相同。
对比例5
与实施例3的区别在于:试剂R1、试剂R2与样品的体积比为4:1:1,其他步骤与操作与实施例3相同。
试验例1线性关系检测
选取α-L-岩藻糖苷酶含量为300U/L的样本,用生理盐水进行系列稀释,配制6个不同浓度的样本,浓度依次为300U/L、250U/L、200U/L、150U/L、80U/L、0U/L。分别利用实施例1-6以及对比例1-5试剂进行检测,每个浓度的样本分别测定三次,分别取平均值,检测结果如表1和表2所示。
表1
表2
如上表1和2所示,实施例1-6检测结果相关系数均大于0.999,且实施例6试剂检测结果的相关系数最高,可达0.9997,对比例1-5这检测结果相关系数明显低于实施例,且改变稳定剂的种类,相关系数降低明显,以上数据表明本发明实施例试剂具有更好的线性相关性。
试验例2稳定性试验
在4℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存α-L-岩藻糖苷酶含量为150U/L的样本试剂,检测实施例4-6及对比例1-3试剂的稳定性。每月1号分别用两组试剂测定同一混合血清样本,测定三次取平均值,检测数据如表3所示。
表3
上表3以及图1-3实验结果显示,实施例4-6试剂在4℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存15个月变化率仅为5左右,稳定性好,而对比例1-3试剂改变了稳定剂的种类或质量比不在本发明公开范围内,将其放置在4℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存12个月后稳定性明显降低,说明本发明试剂添加本发明公开质量比的稳定剂后稳定性增强。
试验例3精密度试验
将实施例4-6以及对比例1-5所制得的α-L-岩藻糖苷酶测定试剂盒对含量为80U/L的同一待测样本进行的多次反复测定,对所得的结果进行SD和CV的计算,检测数据如表4。
表4
由表4可知本发明实施例4-6所制得的测定α-L-岩藻糖苷酶试剂盒的精密度明显高于对比例,而且由表4可知,实施例6为最优的选择.
试验例4灵敏度试验
对实施例1-5制备的5个试剂盒采用日立7080全自动生化分析仪进行测试,测试结果见表5。
表5
根据上表5的测定结果可知实施例制备的试剂盒具有良好的灵敏度,实施例6制备的试剂盒灵敏度最高为0.85ng/mL。
综上,本发明提供的试剂盒的可检测结果准确度高、精密度高、稳定性好、线性好,灵敏度强。其中利用实施例6所述的试剂盒进行检测,检测结果最佳。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述的试剂R1和试剂R2中还包括稳定剂。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于:所述的稳定剂为质量比2-5:1-2:2的精氨酸、天冬酰胺和蔗糖。
6.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于:所述的稳定剂为质量比4:2:2的精氨酸、天冬酰胺和蔗糖。
7.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于:所述稳定剂的浓度为1-3g/L。
9.根据权利要求1-8任一项所述的试剂盒,其特征在于:所述的试剂R1、试剂R2与样品的体积比为6-10:1-3:1。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于:所述的试剂R1、试剂R2与样品的体积比为8:2:1。
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GR01 | Patent grant | ||
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