JPS5845562A - 体液中のβ―リポプロテインフラクシヨンの測定法 - Google Patents
体液中のβ―リポプロテインフラクシヨンの測定法Info
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- JPS5845562A JPS5845562A JP57147846A JP14784682A JPS5845562A JP S5845562 A JPS5845562 A JP S5845562A JP 57147846 A JP57147846 A JP 57147846A JP 14784682 A JP14784682 A JP 14784682A JP S5845562 A JPS5845562 A JP S5845562A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は体液中のβ−リポプロティン(LowDens
ity Lipopr+etel+a (LDL )
)フラクションの測定法及び測定試薬に関する。
ity Lipopr+etel+a (LDL )
)フラクションの測定法及び測定試薬に関する。
高コレステリン血症及び高トリグリセリン血症はアテロ
ーム性動脈硬化症及び心臓価基の発生をうながす。従っ
て、血清中のコレステリン及びトリグリセリドの測定は
臨床化学用簡易実験室において最も多〈実施されるテス
トに属する。
ーム性動脈硬化症及び心臓価基の発生をうながす。従っ
て、血清中のコレステリン及びトリグリセリドの測定は
臨床化学用簡易実験室において最も多〈実施されるテス
トに属する。
トリグリセリド饋及びコレステリン量の変化を測定する
だけでなく、病理学上の原因によるリポプロティンパタ
ーンの変化を調べる場會1個々の冠状動脈疾患のおそれ
をより良好に把握することができるということが多くの
脂質代謝検査から結論されている(M’unch@m@
d、vichr@li 121巻、1979年、第16
39買]。
だけでなく、病理学上の原因によるリポプロティンパタ
ーンの変化を調べる場會1個々の冠状動脈疾患のおそれ
をより良好に把握することができるということが多くの
脂質代謝検査から結論されている(M’unch@m@
d、vichr@li 121巻、1979年、第16
39買]。
公知の血漿リポプ冒ティン社蛋白質、ホスホリピド、コ
レステリン及びトリグリセリドを種々の量で含有してい
る。これらは分析超遠心分離におけるその挙動(異なる
密度)により異なる三種のクラスに分けることができる
二プレーβ−リポプロティン富VLDL(VeryLO
W Density Lipoprotelm 、超低
密度リポプロティン)。
レステリン及びトリグリセリドを種々の量で含有してい
る。これらは分析超遠心分離におけるその挙動(異なる
密度)により異なる三種のクラスに分けることができる
二プレーβ−リポプロティン富VLDL(VeryLO
W Density Lipoprotelm 、超低
密度リポプロティン)。
β−リポプロティン= L D L (Low Den
sityLlpoproteim、低密度リポプロティ
ン)。
sityLlpoproteim、低密度リポプロティ
ン)。
α−リポプロティン、HDL (出gh Denml
−1y Llpeprotein1高密度リポプロティ
ン)。
−1y Llpeprotein1高密度リポプロティ
ン)。
リポプルティンの機能の検査により、リポプルティンの
うちのLDLが決定的なアテロゲン成分を形成してお夛
、血中でのアテロゲン成分の上昇は冠状動脈疾患である
という危険性の上昇を示す。この状態の早期の発見及び
治療は極めて重要である。従って、IrIL清及び血漿
中のLDL−濃度の定量測定のための実施可能な方法が
必要となった。
うちのLDLが決定的なアテロゲン成分を形成してお夛
、血中でのアテロゲン成分の上昇は冠状動脈疾患である
という危険性の上昇を示す。この状態の早期の発見及び
治療は極めて重要である。従って、IrIL清及び血漿
中のLDL−濃度の定量測定のための実施可能な方法が
必要となった。
従来、LDL−リポプロテインフラクシ目ンの測定には
主に次の4種の方法を使用したが。
主に次の4種の方法を使用したが。
これらはいずれも欠点を有する:
l 超遠心分離法
この方法のためにIIi特別な装置が必要であり、この
実施のためには著しく綿密な作業技術及び非常に長い時
間(105000,で2×20時間)を必要とするので
、この方法は簡易実験室には好適でない。従って、この
分析法は従来医学研究実験室においてのみ行なわれてい
る。
実施のためには著しく綿密な作業技術及び非常に長い時
間(105000,で2×20時間)を必要とするので
、この方法は簡易実験室には好適でない。従って、この
分析法は従来医学研究実験室においてのみ行なわれてい
る。
2 沈殿反応
LDL−含量はポリアニオン、例えばヘパリン−Na又
はデキストランスルフェート及び二価のカチオン、例え
ば0.++、 M、++、 M、++を用いて分別沈殿
することによシ、同様に測定する。リポプロティンはポ
リアニオンの濃JL’li上昇fルト共KVLDL、L
DL次に1(DLの順に析出する。しかしながらこの方
法は二工程を必要とし、そのために非実用的でろ九かつ
自動化することができない:VLDL1i第1の沈殿工
程で分離し、引き続き、沈殿剤の漫度會上昇させること
によりLDL−リボプUティンフラクションを析出させ
、混濁測定法によシ測定する(H*Oka b@@ X
e I n t e Oongイ@o folln、
Oh@m、、メキシコ、+ il 978年)。
はデキストランスルフェート及び二価のカチオン、例え
ば0.++、 M、++、 M、++を用いて分別沈殿
することによシ、同様に測定する。リポプロティンはポ
リアニオンの濃JL’li上昇fルト共KVLDL、L
DL次に1(DLの順に析出する。しかしながらこの方
法は二工程を必要とし、そのために非実用的でろ九かつ
自動化することができない:VLDL1i第1の沈殿工
程で分離し、引き続き、沈殿剤の漫度會上昇させること
によりLDL−リボプUティンフラクションを析出させ
、混濁測定法によシ測定する(H*Oka b@@ X
e I n t e Oongイ@o folln、
Oh@m、、メキシコ、+ il 978年)。
3 フリーデワルド式(Frledewmld For
ms鳳]によるLDL−濃度の測定法 この方法により試料のトリグリセリド含量。
ms鳳]によるLDL−濃度の測定法 この方法により試料のトリグリセリド含量。
コレステリン含量及びHDL−コレステリン含量を測定
し、フリーデワルド法によji)LDL−コレステリン
含量を計算する(Olln・Oh@m・第18巻、19
72年、499頁)。この煩雑な方法は全く正確な値を
示さず、このことはトリグリセリドを多く含有する血清
において着しい。
し、フリーデワルド法によji)LDL−コレステリン
含量を計算する(Olln・Oh@m・第18巻、19
72年、499頁)。この煩雑な方法は全く正確な値を
示さず、このことはトリグリセリドを多く含有する血清
において着しい。
4 電気泳動分離及びポリアニオン沈殿による評価
しかしながら、この方法は時間がかかり。
電気泳動装置並びに評価のための密に針を必要とする(
Lab、Med−1第1巻、1977年、第145頁)
。
Lab、Med−1第1巻、1977年、第145頁)
。
従って、本発明の課題は、LDLt−簡易実験室で直接
測定することのできる実用的で、自動化可能な方法をつ
く〕出すことである。この課題は5体液1例えば血清又
は血漿中のβ−リポプ薗テインツラクシ目ン(LDL
)を測定する光めに、1価のカチオンを有するポリビニ
ルスルフェートを添加することにより体液からβ−リポ
プロティンフラクション街選択的に析出させ。
測定することのできる実用的で、自動化可能な方法をつ
く〕出すことである。この課題は5体液1例えば血清又
は血漿中のβ−リポプ薗テインツラクシ目ン(LDL
)を測定する光めに、1価のカチオンを有するポリビニ
ルスルフェートを添加することにより体液からβ−リポ
プロティンフラクション街選択的に析出させ。
測定することを特徴とする体液中のβ−リ?プ四テイン
フラクシ目ンの測定法により解決する。
フラクシ目ンの測定法により解決する。
本発明による方法は% 1価のカチオンを有するポリビ
ニルスルフェートを添加することにより、VLDL及び
HDLの存在下にLDI、’i選択的に事実上定量的に
析出させ、測定することができるといり意外な事実の発
見に基づく:従来公知のLDLf:析出させる検査によ
れば、Vl、DL?あらかじめ分離しない場曾、常にV
LDLが共に析出するので、この発見は意外でめる(M
、Bur 1l−1ein 、H,EL8choln
ick 著1%Protlde+s of th
eBlological F1u1ds#、 Paet
era出版%第21〜28頁(19721: Arzt
l、Lab、第23巻、第101〜110頁、1977
年)5 本発明による沈殿処理は前処理を行なっていない完全血
清中で直接性なうのが有利である。
ニルスルフェートを添加することにより、VLDL及び
HDLの存在下にLDI、’i選択的に事実上定量的に
析出させ、測定することができるといり意外な事実の発
見に基づく:従来公知のLDLf:析出させる検査によ
れば、Vl、DL?あらかじめ分離しない場曾、常にV
LDLが共に析出するので、この発見は意外でめる(M
、Bur 1l−1ein 、H,EL8choln
ick 著1%Protlde+s of th
eBlological F1u1ds#、 Paet
era出版%第21〜28頁(19721: Arzt
l、Lab、第23巻、第101〜110頁、1977
年)5 本発明による沈殿処理は前処理を行なっていない完全血
清中で直接性なうのが有利である。
沈殿を、有利に遠心分離によ)分離する。
本発明においてポリビニルスルフエートトハテリピニル
アルコールのヒドロキシル基’を硫酸でエステル化する
ことにより、これから誘導されたポリマーである0分子
の大きさは、これが十分に水溶性であるかぎり、この方
法に対し特別な影響を与えない。基礎になっているビニ
ルアルコール単位の少なくとも701はスルフェートエ
ステル基を有しているのが有利である、エステル化度8
〇−以上、q#に90%以上が有利である。
アルコールのヒドロキシル基’を硫酸でエステル化する
ことにより、これから誘導されたポリマーである0分子
の大きさは、これが十分に水溶性であるかぎり、この方
法に対し特別な影響を与えない。基礎になっているビニ
ルアルコール単位の少なくとも701はスルフェートエ
ステル基を有しているのが有利である、エステル化度8
〇−以上、q#に90%以上が有利である。
それぞれ必要なポリビニルスルフェート量は簡単な前実
験により容易に決めることができる。
験により容易に決めることができる。
g料sst容蓋めた)ポリビニルスルフェート0.1〜
0.O1重量qbt添加するのが有利である。
0.O1重量qbt添加するのが有利である。
ポリビニルスルフェートの添加を水1tあたシポリビニ
ルスルフエー) (PVa )約1〜20゜の希釈水溶
液の形で行なうのが有利である。しかしながら、試料溶
液を十分に攪拌することができる場合は1本発明を濃縮
溶液で、又はPVaを固体の形で添加して実施すること
もできる。
ルスルフエー) (PVa )約1〜20゜の希釈水溶
液の形で行なうのが有利である。しかしながら、試料溶
液を十分に攪拌することができる場合は1本発明を濃縮
溶液で、又はPVaを固体の形で添加して実施すること
もできる。
しかしながら、一般に試料溶液量は非常にわずかである
ので、希釈溶液の形で添加するのが有利である0例えば
血清200容量部に0.1〜11PV8−溶液40容量
部を加える。特に良好な結果は0.2〜o、s 1の水
溶液を、この水溶液IK対して試料溶液5の容量比で加
えると得られる。
ので、希釈溶液の形で添加するのが有利である0例えば
血清200容量部に0.1〜11PV8−溶液40容量
部を加える。特に良好な結果は0.2〜o、s 1の水
溶液を、この水溶液IK対して試料溶液5の容量比で加
えると得られる。
試料溶液にPvSの他にポリグリコールメチルエーテル
又はポリビニルピロリドンを加えるのが有利である。こ
の組み合わせを使用する場合。
又はポリビニルピロリドンを加えるのが有利である。こ
の組み合わせを使用する場合。
析出は特に良好な再現性を有する。ポリグリコールメチ
ルエーテル又は/及びポリビニルピロリドンを試料溶液
に有利に5〜10容量−の量で加える。
ルエーテル又は/及びポリビニルピロリドンを試料溶液
に有利に5〜10容量−の量で加える。
本発明の方法において、二価のカチオンが測定可能量存
在しないということは重要である。
在しないということは重要である。
通常、二価のカチオンの血清中に存在する量は僅かな痕
跡l!ll程度であり、この量では全く妨害は生じない
ので、この要件は無視することができる。しかしながら
、二□□′−のカチオン含量の並みはずれて高い異常な
試料の出現を全く除くことはできないので、前記の物質
の他に多価カチオンのための錯化剤全添加するのが有利
であふ、このために#′i、、例えばエチレンジアミン
四酢酸(EDTA lのようなボリアオンアセテ−トが
有利である。この種の錯化剤を試料溶液中の濃度0.0
1〜0.001モル/lであるような量で使用するのが
有利である。
跡l!ll程度であり、この量では全く妨害は生じない
ので、この要件は無視することができる。しかしながら
、二□□′−のカチオン含量の並みはずれて高い異常な
試料の出現を全く除くことはできないので、前記の物質
の他に多価カチオンのための錯化剤全添加するのが有利
であふ、このために#′i、、例えばエチレンジアミン
四酢酸(EDTA lのようなボリアオンアセテ−トが
有利である。この種の錯化剤を試料溶液中の濃度0.0
1〜0.001モル/lであるような量で使用するのが
有利である。
本発明により析出(7たLDL−7ラクシヨンの評価は
有利に、リボプロティンの公知の測定法全使用する仁と
により行なわれる。リボプロティン中に含有されるコレ
ステリンはこのために公知の方法によシ有利に測定され
る0例えばコレステリンオキシダーゼでの酸化及び酸化
により生じたF(、0,の測定により行なわれる。この
測定の実施は有利に、試料中の全コレステリン並びに沈
殿上澄中のコレステリンを測定し、この差からLDL−
量を推定するか又はLDL−沈殿を溶かし、このように
して得られた溶液中でコレステリン測定を実施すること
により行なわれる。
有利に、リボプロティンの公知の測定法全使用する仁と
により行なわれる。リボプロティン中に含有されるコレ
ステリンはこのために公知の方法によシ有利に測定され
る0例えばコレステリンオキシダーゼでの酸化及び酸化
により生じたF(、0,の測定により行なわれる。この
測定の実施は有利に、試料中の全コレステリン並びに沈
殿上澄中のコレステリンを測定し、この差からLDL−
量を推定するか又はLDL−沈殿を溶かし、このように
して得られた溶液中でコレステリン測定を実施すること
により行なわれる。
リボプロティンフラクション中のコレステリン量は一定
であるので、測定コレステリン量はリゾプロティン量に
相当する。
であるので、測定コレステリン量はリゾプロティン量に
相当する。
pvsFi有利にカリウム塩として使用されるが、他の
1価のカチオン、特にナトリウム、リチウム及びテンモ
ニ・7ムを同様に使用することができる。
1価のカチオン、特にナトリウム、リチウム及びテンモ
ニ・7ムを同様に使用することができる。
本発明のもう1つの課題は体液中のβ−リポプ四ティン
フラクションを測定するための試薬に関し、これはポリ
ビニルスルフニートラ含有していることを特徴とする。
フラクションを測定するための試薬に関し、これはポリ
ビニルスルフニートラ含有していることを特徴とする。
ポリビニルメチルエーテル及び/又はポリビニルピロリ
ドンt−付加的に含有するのが有利である。もう1つの
有利な実施形式によれば、試薬は更に多価カチオン用の
錯化剤を含有しており、特にポリアミンアセテートが有
利である。
ドンt−付加的に含有するのが有利である。もう1つの
有利な実施形式によれば、試薬は更に多価カチオン用の
錯化剤を含有しており、特にポリアミンアセテートが有
利である。
01[記の有利なtfi類の典型的なμ”薬はそれぞれ
血清容量に対してポリビニルスルフェート0.1〜0.
01重t*、/リグリコールメチルエーテル及び/又U
ポリビニルビayトン5〜10g量チ並びに濃度0.0
1〜0.001、モルの錯化剤を含有している。
血清容量に対してポリビニルスルフェート0.1〜0.
01重t*、/リグリコールメチルエーテル及び/又U
ポリビニルビayトン5〜10g量チ並びに濃度0.0
1〜0.001、モルの錯化剤を含有している。
本発明による方法及び試薬は特に各易さ及び確実さI・
どおhて優れている。一般eこ認められた。
どおhて優れている。一般eこ認められた。
著しく煩雑な測定法と比較すると、!flI来の優れた
一致が得られる。次に実施例にっき本発HA¥を詳細に
説明する: 例 A) 沈殿試薬の製造 溶−液I、PV8/ポリエチレングリコ ルメチルエー
テル pvss液(0=3 t/l ) 34m
ポリエチレングリコールメチルエー テル(分子量190〜550) 16dgD
’rA(o、o 1 %ル) 50 d
sum、PV8/フ92 ト% Plasdone)■
PV8溶液(0ミ39/l) 34dHs0
16dlilDTA
50mシラストン■、K
29−32 (ポリビニルピロリドン) 6−5 yB
) 沈殿 混合、15分間室温で放置、10000fで2分間(又
は15ooyで15分間)遠心分離を行なう。遠心分離
後、VLDL−含量及び乳粛脂粒によりそれぞれ透明又
は混濁の外観を有する上澄液を分醸し、0HOD−PA
P−法でのコレステリン測定のために使用する。01(
OD−PAP−法はコレステリンオキシダーゼt−用い
るコレステリンの酸化及び、この除虫じたH雪Os t
−フェノール及び4−アミノアンチピリンと呈色反応さ
せることによる測光法による測定に基づく。
一致が得られる。次に実施例にっき本発HA¥を詳細に
説明する: 例 A) 沈殿試薬の製造 溶−液I、PV8/ポリエチレングリコ ルメチルエー
テル pvss液(0=3 t/l ) 34m
ポリエチレングリコールメチルエー テル(分子量190〜550) 16dgD
’rA(o、o 1 %ル) 50 d
sum、PV8/フ92 ト% Plasdone)■
PV8溶液(0ミ39/l) 34dHs0
16dlilDTA
50mシラストン■、K
29−32 (ポリビニルピロリドン) 6−5 yB
) 沈殿 混合、15分間室温で放置、10000fで2分間(又
は15ooyで15分間)遠心分離を行なう。遠心分離
後、VLDL−含量及び乳粛脂粒によりそれぞれ透明又
は混濁の外観を有する上澄液を分醸し、0HOD−PA
P−法でのコレステリン測定のために使用する。01(
OD−PAP−法はコレステリンオキシダーゼt−用い
るコレステリンの酸化及び、この除虫じたH雪Os t
−フェノール及び4−アミノアンチピリンと呈色反応さ
せることによる測光法による測定に基づく。
C) コレステリン測定
波長: HP 546nm(470〜560
11m1分光光度計: 50Qnm キュベツト・: 厚さ13 恒温保持温度= 20〜25℃又F137℃試薬−空値
(aL)に対する測定 それぞれの測定例にとって1つの試薬−9値で十分であ
る。
11m1分光光度計: 50Qnm キュベツト・: 厚さ13 恒温保持温度= 20〜25℃又F137℃試薬−空値
(aL)に対する測定 それぞれの測定例にとって1つの試薬−9値で十分であ
る。
混会し、aL及び試料t−20〜25℃で20分又は3
7℃で12分間恒温保持する。1時間かけてaLに対す
る試料の吸光度を測定するにE試料 )。
7℃で12分間恒温保持する。1時間かけてaLに対す
る試料の吸光度を測定するにE試料 )。
31
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 L 1価のカチオンを有するポリビニルスルフせ、測定
すること全特徴とする体液中の/−リポプ四ティ〃ラク
シ目ンの測定法。 λ 基礎になっているビニルアルコール単位の少なくと
も70%がスルフェート基を有する水溶性ポリビニルス
ルフェートを使用する特許請求の範囲第1項記載の方法
。 3、 血清試料にポリビニルスルフェート0.1〜0.
01重t/容tSを添加する特許請求の範囲第1項又は
第2項記載の方法。 4、 コレステリン含量を沈殿中又は血清中及び上澄液
中で測定することによシLDL量t−欄建する特許請求
の範囲第1項〜嬉3項のいずれか1項に植栽の方法。 & 1価のカチオンを有するポリビニルスルフェート及
び−リグリコールメチルエーテル又はぼりビニルピロリ
ドンを添加することにより試料からβ−リポゾロティン
フラクションを選択的に沈殿させ、測定することを特徴
とする体液中のβ−リポプロティンフラクションの測定
法。 a 基礎になっているビニルアルコール単位の少なくと
も70−がスルフェート基を有する水溶性ポリビニルス
ルフニートラ使用する特許請求の範囲第5項記載の方法
。 デ 血清試料にポリビニルスルフニー) 0.1〜0.
01重量/容量チ添加する特許請求の範囲第5項又は第
6項記載の方法。 & 血清試料にポリグリコールメチルエーテル又はメリ
ぎニルピーリドン5〜10容1にチを添加する特許請求
の範囲第5〜第7項のいずれか1項に記載の方法。 張 コレステリン含量を沈殿中又は血清中及び上澄液中
で測定することによfi L D Lt?測定する特1
FF111求の範囲第5項〜f48項のいずれか1項に
記載の方法。 1000価のカチオンを有するポリビニルスルフェート
及びポリグリコールメチルエーテル又はポリビニルピロ
リドン並びに多価カチオンのための錯化剤を添加するこ
とKより試料からβ−リポゾロティンフラクションを選
択的に沈殿させ、測定することYtlf!f徴とする体
液中のβ−リポプロティンフラクションの測定法。 11、錯化剤としてポリアミンアセテートを使用する特
許請求の範囲第10項記載の方法、lλコレステリン含
量を沈殿中又は血清中及び上澄液中で測定することによ
QLDL量を測定する特lFF1l!求の範囲JIO項
又は第11項記載の方法。 1λポリビニルスルフエート會含有することを%徴とす
る体液中のβ−リポプロティンフラクションの測定試薬
。 146?リビニルスルフエート及びポリグリコールメチ
ルエーテル及び/又はポリビニルピロリドy金含有する
ことを特徴とする体液中のβ−リポプロティンフラクシ
ョンの測定試薬。 1&ポリビニルスルフエート及びポリグリコールメチル
エーテル及び/又はポリビニルピロリドン及び多価カチ
オンのための錯化剤を含有することを特徴とする体液中
のβ−ソリ4プロテインフラクシヨン測定試薬。 16、血清容量に対し、ポリビニルスルフェート0.1
〜0.01重量−、ポリグリコールメチルエーテル及び
/又はポリビニルピロリドン5〜lO容量−並びに濃度
0.01〜o、o o tモルに錯化剤を含有する特許
請求の範囲第15項記載の試薬。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3133937.9 | 1981-08-27 | ||
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